蘇鐵葉黃酮類化合物的檢測(cè)與提取工藝研究△

史紅艷，朱海萍，楊培君

(陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001)

·基礎(chǔ)研究·

蘇鐵葉黃酮類化合物的檢測(cè)與提取工藝研究△

史紅艷，朱海萍，楊培君*

(陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001)

目的：以蘇鐵葉為研究材料，開(kāi)展黃酮類化合物的檢測(cè)，同時(shí)對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法：以UV法檢測(cè)的蘇鐵葉總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝條件。結(jié)果：定性檢測(cè)顯示，蘇鐵葉中含黃酮、二氫黃酮等黃酮類化合物組分。研究結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)：提取溫度為80 ℃，乙醇濃度為70%，料液比為1∶25，提取時(shí)間為1.5 h。在此條件下總黃酮的平均得率為1.67%。結(jié)論：該工藝合理，重復(fù)性好，能有效提高蘇鐵葉總黃酮得率。

蘇鐵葉；總黃酮；檢測(cè)；工藝優(yōu)化

蘇鐵葉為蘇鐵科蘇鐵屬植物蘇鐵CycasrevolutaThunb.的葉，又名鐵樹(shù)葉[1]、鳳尾蕉葉[2]。甘、淡，平，小毒。入肝、胃經(jīng)，有理氣、活血功能[2]。相關(guān)研究報(bào)道[4-6]，蘇鐵葉中藥復(fù)方制劑經(jīng)煎煮后對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用[3]，可治療胃癌、肺癌、肝癌等。據(jù)調(diào)查，陜南民間有鐵樹(shù)葉治結(jié)腸炎等疾病的用法。

相關(guān)研究報(bào)道[7-11]，黃酮類化合物具有多種生理活性，如抗氧化、抗炎抑菌、抗病毒、抗糖尿病、抗抑郁、延緩衰老、增強(qiáng)心血管功能、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、改善記憶力以及增強(qiáng)免疫力等。對(duì)蘇鐵研究報(bào)道較少，潘韜文報(bào)道了蘇鐵種皮[12]；劉世彪報(bào)道了蘇鐵種子的化學(xué)成分及毒性[13]；熊江等[14]從貴州蘇鐵葉中分離出8種化合物；楊秋利[15]對(duì)蘇鐵中的微量元素進(jìn)行了測(cè)定；此外，有關(guān)蘇鐵分類學(xué)[16]、解剖學(xué)[17]、分子生物學(xué)[18-19]方面以及提取物病理學(xué)研究[4，20]也有報(bào)道，但蘇鐵葉中黃酮類化合物的系統(tǒng)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以蘇鐵葉為供試材料，通過(guò)乙醇水溶液熱回流提取法，開(kāi)展蘇鐵葉總黃酮化合物的檢測(cè)及提取工藝條件的優(yōu)化，以期為蘇鐵葉黃酮類化合物的研究與利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蘇鐵葉于2012年9月采集于陜西漢中市栽培植株，烘干后粉碎，過(guò)粒徑為0.45 mm的篩，備用。

1.2 試劑與儀器

亞銷酸鈉(NaNO2)、氯化鋁(AlCl3)、氫氧化鈉(NaOH)、95%乙醇、無(wú)水乙醇、乙醚等均為分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-200707)。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2550，日本島津)；電子天平(梅特勒AL204，精密度0.000 1 g)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV10，德國(guó)IKA公司)；優(yōu)普超純水機(jī)(UPH-Ⅱ，成都超純科技有限公司)；索氏提取儀。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮的提取 考慮溶劑的極性、毒性及后續(xù)處理的難度，故選取一定濃度的乙醇作為提取溶劑，提取流程為蘇鐵葉粉末→乙醚去脂→乙醇熱回流→抽濾→定容→黃酮類化合物溶液。

1.3.2 總黃酮的定性測(cè)定 分別用鹽酸-鎂粉、鹽酸-鋅粉、硼氫化鈉(NaBH4)、AlCl3等8種顯色劑做顯色反應(yīng)，對(duì)蘇鐵葉黃酮類化合物進(jìn)行定性檢測(cè)。

1.3.3 UV法檢測(cè)設(shè)計(jì)與總黃酮的定量測(cè)定 取一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液，經(jīng)NaNO2-AlCl3顯色后，用UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于400～600 nm波長(zhǎng)掃描，以確定掃描波長(zhǎng)。

精密稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品6.0 mg，用60%乙醇水溶液溶解并定容于50 mL容量瓶，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入濃度為0.5 mol·L-1的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；然后加入濃度為0.3 mol·L-1的AlCl3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加入濃度為1.0 mol·L-1NaOH溶液4.0 mL，用60%乙醇稀釋至10.0 mL，配成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置15 min后，在確定的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度對(duì)質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸取2.0 mL樣品提取液于10 mL容量瓶中，按上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法配制溶液，以試劑空白為參比液，測(cè)其吸光度記為A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得提取液濃度C(μg·mL-1)。按以下公式計(jì)算蘇鐵葉中總黃酮得率X(%)：

C為樣品溶液中黃酮類化合物的濃度(μg·mL-1)；V為供試樣品的體積(mL)；w為稱取樣品重量(μg)；b為供試液稀釋倍數(shù)。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取脫脂后的蘇鐵葉粉末3份，每份1.0 g，置于三角瓶中，根據(jù)各提取因素，采用不同的單因素3水平試驗(yàn)進(jìn)行熱回流提取。抽濾后得乙醇提取液，濾渣重復(fù)提取2次，趁熱抽濾，合并濾液，并定容至100 mL。按標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算總黃酮類化合物的得率。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 考慮各因素之間的相互影響，試驗(yàn)以蘇鐵葉中總黃酮得率為衡量指標(biāo)。分別選取提取溫度、料液比、乙醇濃度和提取時(shí)間4因素及其對(duì)應(yīng)的3個(gè)較優(yōu)水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，確定提取總黃酮的最佳工藝條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

1.3.6 方法驗(yàn)證 重復(fù)性試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取蘇鐵葉粉末6份各1.0 g，按確定的工藝制備樣品溶液。以標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法測(cè)定吸光度，計(jì)算蘇鐵葉黃酮類化合物含量。

回收率試驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取3份已知質(zhì)量濃度的供試樣品溶液1.0 mL于試管中，分別加入0.5、1.5、2.5 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液(質(zhì)量濃度為0.11 mg·mL-1)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法測(cè)定3組加標(biāo)樣品的吸光度值，每組加標(biāo)樣品平行測(cè)定3次，計(jì)算平均值?；厥章使剑夯厥章?%)=(加標(biāo)試樣測(cè)定黃酮量-已知試樣黃酮量)/加標(biāo)量×100%

穩(wěn)定性試驗(yàn)：移取樣品溶液2.0 mL，以標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法測(cè)定吸光度，每隔10 min測(cè)一次，測(cè)程70 min。

精密度試驗(yàn)：移取最佳條件下提取的蘇鐵葉樣品液2.0 mL于10 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法測(cè)定吸光度值，平行測(cè)定6次。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色反應(yīng)結(jié)果

黃酮類化合物的定性檢測(cè)結(jié)果表明，蘇鐵葉中黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、查爾酮等呈陽(yáng)性反應(yīng)，見(jiàn)表2。

表2 黃酮類化合物顯色反應(yīng)結(jié)果

2.2 波長(zhǎng)掃描結(jié)果

經(jīng)波長(zhǎng)掃描，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和黃酮樣品溶液在505 nm處均有吸收峰，且峰形相似，故蘆丁可作為對(duì)照品用于檢測(cè)蘇鐵葉黃酮類化合物。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制系列濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定吸光度，并以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁對(duì)照品溶液，在0～60 μg·mL-1與吸光度線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=11.543X+0.0677，r=0.999 6，見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 提取次數(shù)的選擇

準(zhǔn)確稱取1.0 g蘇鐵葉干粉，在溫度為80 ℃，乙醇濃度為60%，料液比為1∶20，提取時(shí)間2 h條件下，分別提取黃酮1、 2、3、4次。提取3次時(shí)總黃酮的得率相對(duì)最大，故選3次為最佳提取次數(shù)，見(jiàn)圖2。

圖2 提取次數(shù)對(duì)黃酮類化合物得率的影響

2.5 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 提取時(shí)間對(duì)蘇鐵葉中總黃酮得率的影響 準(zhǔn)確稱取1.0 g蘇鐵葉干粉，固定其他3因素，比較提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響，重復(fù)提取3次，合并濾液。提取時(shí)間在2 h內(nèi)，總黃酮得率隨時(shí)間增加而增加；2～2.5 h其得率基本不變，之后得率反而下降。綜合考慮，選取2 h為最佳提取時(shí)間，見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物得率的影響

2.5.2 料液比對(duì)蘇鐵葉中總黃酮得率的影響 準(zhǔn)確稱取1.0 g蘇鐵葉干粉，固定其他條件，分別提取2 h，比較不同料液比對(duì)總黃酮得率的影響。隨料液比降低，蘇鐵葉總黃酮得率逐漸增加；但當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值；繼續(xù)降低料液比，其得率反而下降。故選取1∶20為最佳料液比，見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)黃酮類化合物得率的影響

2.5.3 提取溫度對(duì)蘇鐵葉中總黃酮得率的影響 準(zhǔn)確稱取1.0 g蘇鐵葉干粉，在前2個(gè)最優(yōu)單因素條件下，固定其他條件，比較不同溫度對(duì)總黃酮得率的影響。隨提取溫度的升高，黃酮類化合物的得率增加；當(dāng)達(dá)80 ℃以上，得率增加不明顯；繼續(xù)升高溫度得率降低。故選取80 ℃為最佳提取溫度，見(jiàn)圖5。

圖5 溫度對(duì)黃酮類化合物得率的影響

2.5.4 乙醇濃度對(duì)蘇鐵葉中總黃酮得率的影響 準(zhǔn)確稱取1.0 g蘇鐵葉干粉，選擇以上3個(gè)最優(yōu)單因素，比較不同濃度乙醇對(duì)總黃酮得率的影響。當(dāng)乙醇濃度達(dá)70%時(shí)，總黃酮得率獲最大值；再增大乙醇濃度，總黃酮得率反而降低。故選70%為最佳乙醇濃度，見(jiàn)圖6。

圖6 乙醇濃度對(duì)黃酮類化合物得率的影響

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇L9(34)正交表，對(duì)提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比4因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳提取條件，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、方差分析見(jiàn)表4。

4因素中提取溫度對(duì)總黃酮得率影響最大，各因子對(duì)總黃酮得率的影響主次順序依次為提取溫度(A)>提取時(shí)間(C)>料液比(D)>乙醇濃度(B)。分析正交試驗(yàn)結(jié)果，確定工藝條件為A3B2C1D3。結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮成本和以上因素，最終確定蘇鐵葉總黃酮的最佳工藝優(yōu)化條件為A2B2C1D3。即：提取溫度為80 ℃，乙醇濃度為70%，提取時(shí)間為1.5 h，料液比為1∶25。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

注：A1.提取溫度為70 ℃；A2.提取溫度為80 ℃；A3.提取溫度為90 ℃；B1.乙醇濃度為60%；B2.乙醇濃度為70%；B3.乙醇濃度為80%；C1.提取時(shí)間為1.5 h；C2.提取時(shí)間為2.0 h；C3.提取時(shí)間為2.5 h；D1.料液比為1∶15；D2.料液比為1∶20；D3.料液比為1∶25。

表4 方差分析結(jié)果

2.7 樣品的UV法檢測(cè)結(jié)果

在優(yōu)化的條件下，樣品的總黃酮平均得率為1.67%，RSD=2.66%，見(jiàn)表5。

表5 樣品的UV法試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.8 方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果，RSD=2.30%(n=6)，表明其重復(fù)性良好?；厥章试囼?yàn)結(jié)果表明，方法的準(zhǔn)確度高，見(jiàn)表6。

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，蘇鐵葉黃酮類化合物顯色后，30 min內(nèi)吸光度無(wú)明顯變化；30 min以后，吸光度逐漸降低；建議在30 min內(nèi)完成試驗(yàn)測(cè)定。

精密度試驗(yàn)結(jié)果：樣品溶液6次測(cè)定的平均吸光度值為0.457，RSD值為0.309%，表明儀器的精密度良好。

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

3 討論

通過(guò)顯色反應(yīng)定性確定蘇鐵葉中含有黃酮、二氫黃酮等黃酮類化合物，但其組分鑒定還有待進(jìn)一步研究。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)蘇鐵葉黃酮類化合物的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，隨各單因素的依次優(yōu)化，最優(yōu)條件逐步增多，黃酮的得率也隨之逐漸增大。優(yōu)化的蘇鐵葉總黃酮提取工藝條件：溫度為80 ℃，料液比為1∶25，提取時(shí)間為1.5 h，乙醇濃度為70%，此條件下蘇鐵葉的總黃酮得率為1.67%。各因素對(duì)蘇鐵葉總黃酮得率的影響主次順序依次為提取溫度(A)>提取時(shí)間(C)>料液比(D)>乙醇濃度(B)。在優(yōu)化工藝條件下，蘇鐵葉總黃酮得率較高，重復(fù)性好。采用本方法對(duì)蘇鐵葉提取液中總黃酮含量進(jìn)行定量分析，其工藝及條件可行性和可操作性強(qiáng)，結(jié)果可靠。

不同植物材料總黃酮提取工藝有一定的差異，張吉祥等[21]采用微波輔助法提取棗核中的總黃酮，報(bào)道各因素對(duì)棗核黃酮提取的影響程度大小依次為料液比>提取溫度>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>微波功率；趙雪梅等[22]采用二次旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的方法，探討常山胡柚皮中黃酮類化合物的最佳提取工藝參數(shù)，指出影響黃酮提取率的參數(shù)主次順序?yàn)樘崛r(shí)間>料液比>提取溫度=乙醇濃度。比較結(jié)果表明，采用不同方法，在不同條件下提取黃酮類化合物，顯著性影響因素不同，而其他因素影響差別較小。因此，本試驗(yàn)所得的優(yōu)化工藝條件合理，可為蘇鐵葉總黃酮的進(jìn)一步研究和資源開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

張婧萱等[23]報(bào)道，淮山藥中總黃酮含量為1.12%；黃紅英等[24]測(cè)定青蒿中黃酮類化合物的含量為2.885%；曠春桃等[25]研究大葉冬青葉中總黃酮提取工藝，并采用氯化鋁法測(cè)定黃酮的含量，其總黃酮得率為0.68%；薛淑萍等[26]在優(yōu)化工藝條件下，測(cè)定桑葉中黃酮類化合物含量為0.18%。比較結(jié)果表明，蘇鐵葉中黃酮類化合物含量除低于青蒿外，高于淮山藥、大葉冬青葉、桑葉中的含量。因此，蘇鐵葉作為一種含黃酮類化合物的中草藥資源植物，具一定的開(kāi)發(fā)利用潛力。

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Extraction and Determination of Flavonoids from Leaves ofCycasrevoluta

SHI Hongyan，ZHU Haiping，YANG Peijun*

(School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong Shaanxi 723001，China)

Objective：To study the extraction and determination of flavonoids from leaves ofCycasrevoluta.Methods：The total flavonoids was determined by UV.The yield of total flavonoids was used as index，the extraction condition was optimized by single factor test and orthogonal design L9(34).Results：The results showed that the leaves ofC.revolutacontained varied flavonoids，including flavones，dihydrogen flavones etc.The optimal extraction conditions were as the following：temperature of 80 ℃，ethanol concentration of 70%，solid-liquid ratio of 1∶25 and time 1.5 h.With this method，the extraction ratio of total flavonoids was 1.67%.Conclusion：The established method is reasonable，reproducible，and can effectively improve the yield of total flavonoids fromC.revolutaleaves.

Cycasrevolutaleaves；flavonoids；determination；technological optimization

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.009

2014-06-11)

國(guó)家中醫(yī)藥公共衛(wèi)生專項(xiàng)(201207002)；漢中市科技計(jì)劃發(fā)展項(xiàng)目(2012-46-1)

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楊培君，教授，研究方向：資源植物研究；E-mail：yang@snut.edu.cn