HPLC測定復(fù)方苦參止癢軟膏中苦參堿的含量△

于思杰，趙久麗，曹俊嶺，呂嘉衛(wèi)，屈雙擎，瞿幸，聶波*

(1.涿州市醫(yī)院，河北 涿州 072750；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點實驗室，北京 100700；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

·中藥工業(yè)·

HPLC測定復(fù)方苦參止癢軟膏中苦參堿的含量△

于思杰1，趙久麗2，曹俊嶺3，呂嘉衛(wèi)3，屈雙擎3，瞿幸3，聶波2*

(1.涿州市醫(yī)院，河北 涿州 072750；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點實驗室，北京 100700；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

目的：建立復(fù)方苦參止癢軟膏中苦參堿的HPLC含量測定方法。方法：ZORBAX NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-無水乙醇-3%磷酸水溶液(80∶10∶10)；流速為0.8 mL·min-1；檢測波長為220 nm；柱溫為35 ℃。結(jié)果：苦參堿質(zhì)量濃度在0.012 5～0.600 mg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 7，平均回收率為99.8%(n=7)，RSD=2.10%。結(jié)論：該方法準確、快速、靈敏度高，可用于復(fù)方苦參止癢軟膏的質(zhì)量控制。

復(fù)方苦參止癢軟膏；苦參堿；高效液相色譜法

復(fù)方苦參止癢軟膏是北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院皮膚科主任瞿幸教授的臨床經(jīng)驗方(目前組方和工藝已取得專利授權(quán)，專利授權(quán)號：201310179396.6)，是由苦參、黃柏、蛇床子等中藥組成的復(fù)方制劑，具有清熱燥濕，解毒祛風(fēng)，潤膚止癢的功能，對于皮膚有淡紅斑、丘疹、鱗屑、干燥瘙癢的亞急性、慢性濕疹皮炎均有較好的療效[1]。該制劑臨床應(yīng)用20余年，使用方便，價格低廉，療效確切，得到廣大患者的認可，目前需求量逐年增加。但現(xiàn)有質(zhì)量標準對于質(zhì)量控制僅僅是薄層色譜鑒別，本研究采用HPLC構(gòu)建該制劑君藥苦參中苦參堿的含量測定方法，以提高該制劑質(zhì)量標準，更好地對生產(chǎn)過程進行質(zhì)控，保證用藥安全有效。

1 儀器和材料

1.1 儀器

LC-10Atvp高效液相色譜儀(日本島津公司，配10AV P二元泵、SPD10A二極管陣列檢測器、柱溫箱、在線脫氣機、手動進樣器及系統(tǒng)控制器)；超聲波清洗機(型號：SB5200，上海新芝生物技術(shù)研究所)；循環(huán)水式多用真空泵(型號：SHB-Ⅲ，鄭州長城科貿(mào)有限公司)；萬分之一電子分析天平(型號：SHANGPINGJA1003，上海天平儀器廠)。

1.2 材料

苦參堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110805-200508)；復(fù)方苦參止癢軟膏(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，批號分別為400001，400002，400003)；陰性樣品(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院)；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取苦參堿對照品8 mg，加乙腈-無水乙醇(8∶1)定容至10 mL，制備成質(zhì)量濃度為0.8 mg·mL-1的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取本品10 g，加水50 mL，攪拌，用抽濾法濾過，濾液加濃氨試液1 mL，用三氯甲烷提取4次，每次15 mL，合并提取液，蒸干，殘渣加乙腈-無水乙醇(8∶1)1 mL，使其溶解，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為ZORBAX NH2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-無水乙醇-3%磷酸水溶液(80∶10∶10)；檢測波長為220 nm；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為35 ℃。在此色譜條件下，樣品與對照品在相同保留時間出現(xiàn)相同色譜峰，陰性對照品在此保留時間無干擾，樣品中苦參堿達到基線分離，分離度良好，無其他色譜峰干擾。對照品、陰性對照品、樣品的HPLC圖，見圖1。

注：A.對照品；B.陰性對照品；C.樣品；1.苦參堿。圖1 復(fù)方苦參止癢軟膏中苦參堿的HPLC圖

2.4 標準曲線的繪制

精密量取2.1項下對照品儲備液，按倍數(shù)稀釋法制備8個濃度的標準品試液，質(zhì)量濃度分別為0.6、0.3、0.2、0.15、0.1、0.05、0.025、0.012 5 mg·mL-1。分別吸取上述溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定。以對照品濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，計算回歸方程，苦參堿在0.012 5 ～0.6 mg·mL-1線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=13 956X+65 013，r=0.999 7(n=8)。

2.5 精密度試驗

精密吸取2.4項下質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的對照品溶液20 μL，連續(xù)進樣測定7次?？鄥A色譜峰峰面積的RSD為2.6%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的同一對照品溶液20 μL，分別于0、40 min，1.5、3、6、9、21 h進樣測定，苦參堿色譜峰峰面積的RSD為1.20%，說明對照品溶液在21 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批次的樣品6份，按2.2項下方法平行制備供試品溶液，進樣測定，苦參堿質(zhì)量分數(shù)的RSD為1.20%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一批供試品7份，各10 g，分別加50 mL水，后加入精密稱取的苦參堿對照品，然后按2.2項下的供試品溶液制備方法進行制備，按2.3項下的條件進行測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方苦參止癢軟膏中苦參堿加樣回收率結(jié)果(n=7)

2.9 樣品測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按所建立的色譜條件進行檢測，結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方苦參止癢軟膏中苦參堿的含量(n=3)

3 討論

3.1檢測波長的選擇

取苦參堿對照品溶液經(jīng)二極管陣列檢測器進行紫外線光譜掃描，結(jié)果在202 nm處有最大吸收，但在此波長下干擾多，基線不穩(wěn)定。經(jīng)過比較，選擇220 nm作為檢測波長，此波長下干擾少，基線穩(wěn)定，重復(fù)性好，且吸收度合適[2]。

3.2 色譜柱、流動相、流速的選擇

根據(jù)文獻報道的苦參堿HPLC含量測定方法，分別考察了C18色譜柱下乙腈或甲醇-不同濃度的磷酸水為流動相[3-4]和NH2色譜柱下乙腈-不同比例的無水乙醇-3%磷酸水為流動相[5]，發(fā)現(xiàn)苦參止癢軟膏中的苦參堿在C18色譜柱下色譜峰峰形對稱性差，無法達到基線分離；而在NH2色譜柱下苦參堿分離度和峰形都得到很好改善。進一步比較1.0、0.8、0.6 mL·min-1流速下的分離情況，發(fā)現(xiàn)流速為0.8 mL·min-1時，苦參堿的分離度較好，且保留時間適中。因此，選擇ZORBAX NH2色譜柱，以乙腈-無水乙醇-3%磷酸水溶液(80∶10∶10)為流動相，0.8 mL·min-1的流速進行測定，得到的供試品色譜中苦參堿色譜峰較對稱，與其他色譜峰分離良好，且基線較為平穩(wěn)。

3.3 樣品及對照品溶劑的選擇

分別采用甲醇、乙腈作為溶劑溶解對照品及樣品，發(fā)現(xiàn)存在干擾峰，影響苦參堿色譜峰的分離度。采用乙腈-無水乙醇-3%磷酸水溶液(80∶10∶10)為流動相，溶解后，干擾峰消失，目標色譜峰分離效果理想。

3.4復(fù)方苦參止癢軟膏為北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院院內(nèi)制劑，在皮科臨床已應(yīng)用20余年，需求量逐年增加。臨床研究表明，復(fù)方苦參止癢軟膏外用治療亞急性、慢性濕疹的臨床療效好、安全性高，生活質(zhì)量指數(shù)評分優(yōu)于對照組(霜膏基質(zhì)安慰劑組)。該研究建立制劑君藥苦參中苦參堿的HPLC含量測定方法，提高了該制劑的質(zhì)量標準，該方法快速、準確、靈敏度高，可作為復(fù)方苦參止癢軟膏生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制方法。

[1] 戴明，瞿幸，張霞.復(fù)方苦參止癢霜治療濕疹的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2005，4(4)：234-236.

[2] 彭紅華，蔣嫦月，林吳，等.不同生長年限山豆根中苦參堿和氧化苦參堿的含量比較[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20(8)：72-75.

[3] 傅小英，曹紅.高效液相色譜法測定苦參堿乳膏中苦參堿的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2006，22(5)：385-386.

[4] 王曉萍，石會麗，李富賢，等.HPLC法同時測定苦刺花中苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿的含量[J].陜西中醫(yī)，2014，35(9)：1247-1249.

[5] 田娟，王維皓，高慧敏，等.HPLC測定復(fù)方苦參注射液中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿的含量[J].中國中藥雜志，2007，32(3)：222-224.

DeterminationofMatrineinCompoundKushenAntipruriticOintmentbyHPLC

YUSijie1，ZHAOJiuli2，CAOJunling3，LYUJiawei3，QUShuangqing3，QUXing3，NIEBo2*

(1.DepartmentofDermatology，ZhuozhouMunicipalHospitalHebeiZhuozhou072750，China；2.KeyLaboratoryofChineseInternalMedicineofMinistryofEducationandBeijing，DongzhimenHospital，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing 100700，China；3.DongzhimenHospital，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100700，China)

Objective：To establish an HPLC method for determination of matrine in Compound Kushen antipruritic ointment.Methods：ZORBAX NH2column(250 mm×4.6 mm，5μm)was used with acetonitrile-ethyl alcohol-3%phosphoric acid(80∶10∶10)as the mobile phase，the flow rate was 0.8 mL·min-1，and the detection wavelength was set at 220 nm with temperature at 35℃.Results：Good linearity was shown between the concentration and peak area in the concentration range of 0.125-0.600 mg·mL-1for the matrine，The average recovery rate was 99.80% and RSD was 2.10%.Conclusion：The method is accurate，rapid，highly sensitive，and can be used for the quality control of Compound Kusheng antipruritic ointment.

Compound Kushen antipruritic ointment；matrine；HPLC

2015-04-24)

北京市中醫(yī)藥科技項目(YNZJ2011-03)

*

聶波，博士，副研究員，研究方向：中藥藥理與中藥體內(nèi)代謝；E-mail：nieboww_1977@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.5.018