山豆根抑制丁酰膽堿酯酶活性及活性部位UPLC-Q-TOF-MS分析△

王增繪，王冬梅，劉艾琳，黃林芳*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所，北京 100050)

·基礎(chǔ)研究·

山豆根抑制丁酰膽堿酯酶活性及活性部位UPLC-Q-TOF-MS分析△

王增繪1，王冬梅1，劉艾琳2，黃林芳1*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所，北京 100050)

目的：應(yīng)用高通量藥物篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)山豆根乙醇提取物具有較強的抑制丁酰膽堿酯酶(BuChE)活性。采用超高效液相色譜與串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q-TOF-MS)對其活性部位組分進(jìn)行分析和鑒定。方法：藥材經(jīng)石油醚滲濾、乙醇提取、乙酸乙酯萃取和水煎煮后，得到4個提取部位。采用5，5′-二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)法檢測BuChE活性，并應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS對其活性部位組分進(jìn)行分析和鑒定。結(jié)果：山豆根的乙醇部位顯示較強的BuChE抑制活性，并從其活性部位中分析鑒定了9個化合物，其中7個化合物主要成分為苦參堿類生物堿，屬于喹諾里西啶類生物堿，分別是槐醇、苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、9a-羥基苦參堿、14β-羥基氧化苦參堿、Lamprolobine；2個黃酮類成分分別是Kushenol O、Kushenol I/N。山豆根乙醇提取部位IC50為15.169 μg·mL-1。結(jié)論：首次發(fā)現(xiàn)山豆根乙醇提取部位具有較強的BuChE抑制活性，其主要化學(xué)成分為苦參堿類生物堿，研究表明山豆根具有延緩老年癡呆的作用，為研發(fā)延緩老年癡呆新藥提供科學(xué)依據(jù)。

丁酰膽堿酯酶抑制劑；高通量篩選；山豆根；提取物；有效成分；UPLC-Q-TOF-MS

山豆根是豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的干燥根及根莖，味苦，性寒，具有清熱解毒、消腫利咽的功能[1]，主產(chǎn)于廣西西南部至西北部，廣東、云南和貴州也有少量分布。山豆根為《中華人民共和國藥典》收載的常用中藥，其化學(xué)成分主要為喹諾里西啶類生物堿及黃酮類。從山豆根中分離得到的該類生物堿主要分屬于苦參型、金雀花堿型、奧豆堿型(鷹爪豆堿型)和羽扇豆堿型等4種類型[2]，主要有苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐定堿、金雀花堿等一系列生物堿類化合物。黃酮類化合物主要以二氫黃酮類化合物最為豐富?，F(xiàn)代藥理研究表明，山豆根具有抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、殺菌、保肝、增強免疫、抗心律失常、降血壓等廣泛的藥理活性[3]。本實驗首次報道山豆根具有抑制丁酰膽堿酯酶(BuChE)活性、延緩老年癡呆的作用。

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，即老年癡呆癥，是常見的老年慢性退行性神經(jīng)疾病。根據(jù)其公認(rèn)的病理-膽堿能學(xué)說[4-7]，運用膽堿酯酶抑制劑來提高AD患者的乙酰膽堿水平，是目前唯一被普遍認(rèn)可的藥物治療手段。臨床上應(yīng)用乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑，外周副作用較大，長期治療效果不理想。新近研究表明，給予大鼠大腦皮層內(nèi)灌注選擇性BuChE抑制劑可使細(xì)胞外丁酰膽堿濃度增加15倍，且未發(fā)現(xiàn)膽堿樣副作用。臨床試驗也表明，腦脊液中BuChE抑制與AD患者的認(rèn)知功能具有相關(guān)性[11]。近年來，對丁酰膽堿酯酶進(jìn)行抑制已成為新的AD治療手段[8-9]。

本實驗應(yīng)用DTNB法[10]建立了BuChE抑制劑高通量篩選方法，對山豆根提取物進(jìn)行了BuChE抑制活性篩選，研究首次發(fā)現(xiàn)，山豆根具有較強的BuChE抑制活性，并對其有效部位進(jìn)行超高效液相色譜與串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q-TOF-MS)分析。本實驗為其進(jìn)一步跟蹤分離獲得活性先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)，也為臨床治療AD提供新的用藥依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

POLARstargalaxy微板光學(xué)測定儀(BMG，Ger-many)；Personal Pipettor PP-550MS移液器(Apricot Designs，USA)；美國Waters AcquityTMUPLC/Q-TOF Premier；MassL-ynxV4.1工作站；實驗室ELGA PURELAB Classic-UVF純水機(英國)。

1.2 材料

氯化丁酰巰基膽堿(BuSCh)、四異丙基甲基焦磷酰胺(iso-oMPA)和5，5′-二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)(Sigma公司)；人血漿(北京市紅十字血液中心)；甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；超純水。其他試劑均為市售國產(chǎn)分析純。

山豆根于2011年9月購買于四川新荷花有限公司，藥材樣品經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所鑒定中心林余霖教授鑒定為豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的干燥根及根莖。

2 方法

2.1 待測樣品的制備

藥材樣品粉碎成粗粉，取粗粉500 g，先用石油醚浸泡1 d后滲濾提取至提取液顏色淺(或5倍藥材量)，回收石油醚，得石油醚提取物；殘渣揮去石油醚，用80%乙醇濕潤后再用3倍量80%乙醇回流提取兩次，合并提取液，減壓回收乙醇至無醇味，用等體積乙酸乙酯(EtOAc)萃取2次，合并EtOAc萃取液(上層)，濃縮至干，得EtOAc萃取物；母液濃縮至干(下層)，得乙醇提取物；殘渣揮干乙醇，用3倍量水煮提2次，合并水提取液，濃縮至干，得水提取物。

2.2 活性測定方法

2.2.1 酶反應(yīng)液、底物濃度、DTNB試液濃度的確定人血漿可直接作為酶源。本實驗以0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液稀釋人血漿80倍的稀釋液作為酶反應(yīng)液；篩選體系中選用3 mmol·L-1作為底物的終濃度，以保證較快的反應(yīng)速度，實現(xiàn)高通量；確定DTNB試液的濃度為0.625 mmol·L-1，終濃度為0.25 mmol·L-1。

2.2.2 BuChE活性測定方法 采用改良的DTNB法[11]測定酶活性。BuChE水解丁酰膽堿生成膽堿及丁酸，膽堿可以與巰基顯色劑DTNB反應(yīng)生成TNB黃色化合物，根據(jù)顏色深淺進(jìn)行比色定量，水解產(chǎn)物膽堿的數(shù)量可以反映膽堿酯酶的活力。

氯化丁酰巰基膽堿(BuSCh)和5，5′-二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)試劑均以0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液配制。氯化丁酰巰基膽堿試劑及酶反應(yīng)液均臨用現(xiàn)配?；衔锎笠?guī)模篩選在384孔板中進(jìn)行，用PP-550MS移液器轉(zhuǎn)移液體，每孔中含有終濃度為50 μg·mL-1的天然提取物5 μL，酶反應(yīng)液20 μL，BuSCh試液20 μL，DTNB試液20 μL，反應(yīng)總體積55 μL。用0.05 mol·μL-1磷酸鹽緩沖液來代替樣品，作為標(biāo)準(zhǔn)孔，反映酶的最大活性；以0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液代替樣品及底物作為空白對照；以BuChE的特異性抑制劑四異丙基甲基焦磷酰胺(iso-OMPA)作為陽性對照，以檢驗方法的可靠性。

由移液器依次加入樣品、酶反應(yīng)液、DTNB試液，最后加入底物以啟動反應(yīng)，充分混勻，37 ℃孵育60 min后，送入POLAR star galaxy微板光學(xué)測定儀，讀取412 nm吸收度值(A)。以吸收度值的變化斜率作為相對酶活性。抑制率計算公式：抑制率/%=(A標(biāo)準(zhǔn)-A樣品)/(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)×100。

2.2.3 樣品篩選 計算抑制率后對山豆根提取物樣品進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩時每個樣品依次稀釋為5個濃度，實驗重復(fù)3次，分別為50、5、0.5、0.05、0.005 μg·mL-1。根據(jù)測定結(jié)果計算半數(shù)最大抑制濃度(IC50)值。

2.3 活性成分測定方法

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18Column(50 mm×2.1 mm，，1.7 μm)；流動相：水溶液(A)、甲醇(B)；梯度洗脫：0 min(90% B)→2 min(85% B)→3 min(75% B)→4 min(70% B)→5 min(78% B)→6 min(60% B)→7 min(90% B)→8 min(90% B)；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：4 μL；柱溫：30 ℃。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，采用正離子V模式檢測；脫溶劑氣流量為800 L·h-1，脫溶劑氣溫為450 ℃，錐孔氣流量為50 L·h-1，離子源溫度為120 ℃，毛細(xì)管電壓為3 kV，錐孔電壓為40 V。0.1 s(間隔0.02 s)采集1次譜圖。

2.4 山豆根乙醇溶液的制備

取已制得的山豆根乙醇提取物20.01 mg精密稱定，置于25 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，備用。

3 結(jié)果

山豆根4個部位具有不同程度的BuChE抑制活性，結(jié)果見表1。而其乙醇部位抑制活性最強，在終濃度為50 μg·mL-1時，抑制率為79.18%，IC50為15.169 μg·mL-1，其他3個部位均小于該值。

表1 山豆根不同部位的BuChE抑制率和IC50值

按2.3.1分析條件，繪制山豆根乙醇溶液的UPLC-PDA圖、UPLC-Q-TOF-MS離子流圖，如圖1所示。

數(shù)據(jù)采用Micro mass Marker lynx軟件進(jìn)行處理，根據(jù)正離子模式的一級質(zhì)譜的分子離子峰得到化合物的準(zhǔn)確相對分子質(zhì)量，計算出其元素組成，再由正離子的二級質(zhì)譜中碎片信息，結(jié)合文獻(xiàn)[12-15]，對山豆根用UPLC 分離出的9個主要峰進(jìn)行分析，推斷出其可能的成分，結(jié)果見表2。

表2 UPLC-Q-TOF-ESI-MS鑒定的山豆根提取物中的化合物

4 討論

膽堿酯酶抑制劑是AD治療的普遍策略，人們對植物中的天然乙酰膽堿酯酶抑制劑進(jìn)行了大量篩選，發(fā)現(xiàn)生物堿、萜、黃酮、香豆素等類成分具有抑制乙酰膽堿酯酶的作用[16]。生物堿如石杉堿甲、加蘭它敏等因具有高的抑制活性和強的選擇性已用于臨床，此類藥物多是選擇性AchE抑制劑，長期服用藥效降低、外周不良反應(yīng)較大?；贐uChE抑制劑的動物實驗和臨床試驗的研究結(jié)果，發(fā)展特異性的BuChE抑制劑已逐漸成為一個新的研究方向。尤其對于中藥提取物，發(fā)展中藥的BuChE抑制劑有可能改善AD的臨床治療現(xiàn)狀。

超高壓液相色譜(UPLC)是一個集高分辨率、高靈敏度和高速度于一身的現(xiàn)代分離技術(shù)[17]，串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜(Q-TOF-MS)是高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜，其顯著特點是靈敏度高和選擇性強，得到的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)完整且品質(zhì)高，可以測得化合物準(zhǔn)確分子質(zhì)量，對于成分復(fù)雜的樣品分析與鑒定有其特有的作用[18]。本實驗根據(jù)碎片的精確相對分子質(zhì)量和參考文獻(xiàn)的信息，可得到9個峰對應(yīng)化合物的信息。

苦參堿是豆科植物苦參、苦豆子和山豆根等藥材的主要活性成分[19]。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，當(dāng)臟腑虛衰或外邪侵襲，原有機體平衡被打破，體內(nèi)的生理、病理產(chǎn)物(如痰濁、癖血等)不能及時排除，這些內(nèi)生之毒蘊積體內(nèi)日久化熱而形成“濁毒”。最終導(dǎo)致“濁毒”結(jié)滯于絡(luò)脈。這種“毒損絡(luò)脈”的病理改變是多種疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)濁毒損傷腦絡(luò)時，腦竅雍塞，神機失統(tǒng)，則發(fā)生癡呆。本實驗首次發(fā)現(xiàn)山豆根提取物具有抑制丁酰膽堿酯酶活性的作用，其主要化學(xué)成分為苦參堿類生物堿，屬于喹諾里西啶型生物堿，分別是槐醇、苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、9a-羥基苦參堿、14β-羥基氧化苦參堿、Lamprolobine。目前尚未見關(guān)于山豆根提取物治療老年癡呆疾病的相關(guān)報道，本課題對研發(fā)抗老年癡呆新藥提供了科學(xué)依據(jù)，擬對這些活性提取物做進(jìn)一步的跟蹤分離以獲得活性先導(dǎo)化合物。

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Analysis of Chemical Constituents of Effective Part of Anti-butyrylcholinesterase ofSophoratonkinensisby UPLC-Q-TOF-MS

WANG Zenghui1，WANG Dongmei1，LIU Ailin2，HUANG Linfang1*

(1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Science，Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；2.Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050，China)

Objective：Alzheimer’s disease (AD)，is a common old age chronic degenerative nerve disease.Using cholinesterase inhibitor to improve AD patients choline levels，is currently the only acknowledged drug treatments.Methods：High-throughput drug screening was applied to screen butyrylcholinesterase inhibitory activity ofSophoratonkinensisextracts，and analyzed the active ingredients，The constituents inS.tonkinensiswere determined by UPLC/Q-TOF-MS.Herbs were percolated with petroleum ether，ethanol，ethyl acetate and water，and the corresponding parts of the four extraction were obtained.BuChE inhibitory activity of the candidate compounds was assayed based on thionitrobenzoication (DTNB) method.The mass spectrometer equipped with electrospray ionization source was used as defector and operated in data collected under the positive ion modes.Results：The ethanol extraction part ofS.tonkinensisshowed a strong activity.9 kinds compounds were analyzed and identified，among them 7 mainly were matrine type alkaloids，including sophoranol，sophoridine，matrine，oxymatrine，9a-Hydroxymatrine，lamprolobine，14β-Hydroxyoxymatrine，2 flavonoids were kushenol I/N，kushenol O.Conclusion：The study indicated that extracted with ethanol ofS.tonkinensishas significant butyrylcholinesterase inhibition activity for the first time，and IC50values is 15.169 μg·mL-1，the main compounds mainly is alkaloids of matrine，that indicated thatS.tonkinensis，has a certain effect on BuChE，which will provide scientific basis for AD drug resistance research.

Butyryl cholinesterase inhibitor；high-throughput drug screening；Sophoratonkinensis；extract；active ingredients；UPLC-Q-TOF-MS

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.008

2014-12-19)

國家自然科學(xué)基金(81274013，81473315)；國家自然科學(xué)基金重點項目(81130069)

*

黃林芳，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥資源與質(zhì)量評價；Tel：(010)57833197，E-mail： lfhuang@implad.ac.cn