副干酪乳桿菌NCU622耐酸耐膽鹽及其黏附性能

熊濤，劉妍妍，黃濤，黃巧芬

（南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047）

副干酪乳桿菌NCU622耐酸耐膽鹽及其黏附性能

熊濤，劉妍妍，黃濤，黃巧芬

（南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047）

通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究副干酪乳桿菌NCU622的耐酸、耐膽鹽性能；采用體外細(xì)胞模型（人體結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞）測(cè)定副干酪乳桿菌NCU622的黏附性能，考察了菌體濃度、作用時(shí)間及生長(zhǎng)階段對(duì)其黏附性能的影響，并對(duì)該菌株進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。結(jié)果表明：副干酪乳桿菌NCU622在pH2.5的MRS液體培養(yǎng)基中作用3h，存活率為98.21%；在膽鹽質(zhì)量濃度為0.3、0.5g/100mL的MRS液體培養(yǎng)基中作用4h，存活率分別為95.14%和85.07%。副干酪乳桿菌NCU622對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力較強(qiáng)，為（21.19±0.94）CFU/Caco-2細(xì)胞，且菌體濃度、作用時(shí)間及生長(zhǎng)階段對(duì)其黏附性能均有影響。副干酪乳桿菌NCU622與Caco-2單層細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，對(duì)其無(wú)裂解作用。這表明副干酪乳桿菌NCU622具有良好的耐酸耐膽鹽能力及較強(qiáng)的黏附性能，且對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)裂解作用，符合微生態(tài)制劑和乳酸菌發(fā)酵功能食品的菌種要求。

副干酪乳桿菌NCU622；耐酸；耐膽鹽；黏附性能；細(xì)胞毒性

益生菌是指具有生物活性，攝入適當(dāng)量時(shí)可以對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的微生物［1］。副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品和人體胃腸道中，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究較多的一種益生乳酸菌［2］?？诜嫔粢竭_(dá)腸道并發(fā)揮益生作用，需要一定數(shù)量的菌體能夠耐受有機(jī)體的防御機(jī)制，如口腔酶、胃液中的低pH值環(huán)境和小腸中的膽汁酸等。在這些因素中，胃酸的殺傷力最強(qiáng)，其次是膽汁酸，因此在體外能夠耐受一定濃度的酸和膽鹽是益生菌篩選的主要技術(shù)指標(biāo)［3］。

益生菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附作用是其定殖的第一步［4］，能夠增強(qiáng)菌體與腸道細(xì)胞之間的信號(hào)交流、抑制病原菌在腸道的定殖和提高機(jī)體的免疫力［5］。因而，目前普遍把乳酸菌黏附性能作為評(píng)價(jià)其能否成為益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)。由于通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)益生菌的黏附性能非常困難，現(xiàn)普遍通過(guò)體外模擬實(shí)驗(yàn)來(lái)近似反映體內(nèi)的情況［6］。Caco-2細(xì)胞為人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，其形態(tài)和功能與正常的小腸上皮細(xì)胞非常接近［5］，能表達(dá)正常人腸細(xì)胞的形態(tài)和某些生理特性，因此被廣泛用作體外模型來(lái)評(píng)價(jià)乳酸菌的黏附性能［7］。

作為人體正常菌群的重要組成部分［8］，乳酸桿菌一直被認(rèn)為是安全的［9］。通常情況下，這些人體正常定居者的致病性能是相當(dāng)?shù)偷模?］，只有極少數(shù)感染病例的報(bào)道［10-11］。對(duì)于一些易感人群如免疫功能?chē)?yán)重低下者、新生兒或住院患者，使用適當(dāng)?shù)捏w外實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估益生菌的安全性是必要的。乳酸脫氫酶是真核細(xì)胞中一種穩(wěn)定的胞質(zhì)酶，該酶的釋放被看作細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，并被廣泛用于細(xì)胞毒性檢測(cè)［12］。本實(shí)驗(yàn)研究了副干酪乳桿菌NCU622的耐酸耐膽鹽能力及其黏附性能，考察了菌體濃度、作用時(shí)間及生長(zhǎng)階段對(duì)黏附性能的影響，并對(duì)該菌株進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)，為該菌株能否在胃腸道環(huán)境中發(fā)揮有益作用提供參考。

1　材料與方法

1.1菌種與試劑

副干酪乳桿菌NCU622、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞均由南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

牛膽鹽上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶-EDTA消化液、10×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）北京索萊寶科技有限公司；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DNP-9272型生化培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Airtech生物安全柜蘇凈集團(tuán)安泰公司；PHS-25型pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司；37XC倒置生物顯微鏡上海光學(xué)儀器進(jìn)出口有限公司；Varioskan flash酶標(biāo)儀賽默飛世爾科技有限公司。

1.3培養(yǎng)基

MRS（man rogosa sharpe）培養(yǎng)基，參見(jiàn)GB4789.35—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》［13］中的配制方法。

DMEM完全培養(yǎng)液（補(bǔ)充有100U/mL青霉素、100?g/mL鏈霉素、4mmol/L谷氨酰胺、體積分?jǐn)?shù)1%非必需氨基酸和體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清）用于Caco-2細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)。

DMEM不完全培養(yǎng)液（補(bǔ)充有4mmol/L谷氨酰胺）用于黏附實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

1.4方法

1.4.1耐酸性實(shí)驗(yàn)

用鹽酸調(diào)整MRS液體培養(yǎng)基的pH值至2.5、3.5和4.5，121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻待用。將活化后的副干酪乳桿菌NCU622以體積分?jǐn)?shù)1%［14］的接種量接種到上述處理后的培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，分別于0、1、2、3h取樣，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。按式（1）計(jì)算存活率［15］。

1.4.2耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

用NaOH調(diào)整MRS液體培養(yǎng)基的pH值至8.0，在上述培養(yǎng)基中加入牛膽鹽，使其質(zhì)量濃度分別為0.03、0.3、0.5g/100mL，以不添加牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻待用。將活化后的副干酪乳桿菌NCU622以體積分?jǐn)?shù)1%［16］的接種量接種到上述處理后的培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，分別于0、1、2、3、4h取樣，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。按式（2）計(jì)算存活率［15］。

1.4.3黏附性能實(shí)驗(yàn)

1.4.3.1菌懸液的制備

將副干酪乳桿菌NCU622接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃活化，離心（4500r/min，10min）收集菌體。用無(wú)菌PBS洗滌3次，將菌體重懸于PBS中，用乳酸菌活菌計(jì)數(shù)法［17］快速測(cè)定菌懸液中菌體濃度。

1.4.3.2Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2加細(xì)胞凍存液保存在液氮中（-196℃），經(jīng)復(fù)蘇后置于50mL25cm2培養(yǎng)瓶中，加入DMEM完全培養(yǎng)液，于CO2培養(yǎng)箱（5%CO295%空氣）中37℃培養(yǎng)，每2d換液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)（70%～80%融合），用0.25%胰酶-EDTA消化液消化傳代［18］。

1.4.3.3黏附實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)好的Caco-2細(xì)胞進(jìn)行消化后，用DMEM完全營(yíng)養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，裝于6孔組織培養(yǎng)板中，每孔2mL，于CO2培養(yǎng)箱（5%CO295%空氣）中37℃培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)至單層。棄去組織培養(yǎng)板各孔中培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS緩沖液洗板2次。其中一孔用0.5mL胰酶-EDTA消化液進(jìn)行消化，之后加入0.5mL無(wú)菌PBS緩沖液，用移液槍吹打，使細(xì)胞完全消化并混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度。其他5孔各加入1mL DMEM不完全培養(yǎng)液和1mL菌懸液，用移液槍吹打混合，37℃培養(yǎng)。之后棄去組織培養(yǎng)板各孔中混合液，用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌5次，以除去未黏附的菌體［19-20］。每孔用0.5mL胰酶-EDTA消化液進(jìn)行消化后加入0.5mL無(wú)菌PBS緩沖液，進(jìn)行梯度稀釋，平板計(jì)數(shù)法計(jì)算黏附的細(xì)菌數(shù)。

1.4.3.4菌體濃度對(duì)黏附性能的影響

取培養(yǎng)至14h的副干酪乳桿菌NCU622發(fā)酵液，離心（4500r/min，10min）收集菌體，用無(wú)菌PBS緩沖液調(diào)整其濃度為1×105、1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL，與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)2h，計(jì)數(shù)黏附的細(xì)菌數(shù)。

1.4.3.5作用時(shí)間對(duì)黏附性能的影響

取培養(yǎng)至14h的副干酪乳桿菌NCU622發(fā)酵液，離心（4500r/min，10min）收集菌體，用無(wú)菌PBS緩沖液調(diào)整其濃度為1×108CFU/mL，與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)0.5、1、1.5、2、2.5、3h，計(jì)數(shù)黏附的細(xì)菌數(shù)。

1.4.3.6生長(zhǎng)階段對(duì)黏附性能的影響

分別取培養(yǎng)至延滯末期（2h）、對(duì)數(shù)期（8h）、穩(wěn)定初期（14h）、穩(wěn)定末期（32h）、衰亡期（40h）的副干酪乳桿菌NCU622發(fā)酵液，離心（4500r/min，10min）收集菌體，用無(wú)菌PBS緩沖液調(diào)整其濃度為1×108CFU/mL，與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)2h，計(jì)數(shù)黏附的細(xì)菌數(shù)。

1.4.3.7副干酪乳桿菌NCU622對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性能

取培養(yǎng)至14h的副干酪乳桿菌NCU622發(fā)酵液，離心（4500r/min，10min）收集菌體，用無(wú)菌PBS緩沖液調(diào)整其濃度為1×108CFU/mL，與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)2h，進(jìn)行黏附計(jì)數(shù)和黏附觀察。共培養(yǎng)2h后，棄去組織培養(yǎng)板各孔中混合液，用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌5次，以除去未黏附的菌體。之后自然晾干，革蘭氏染色，顯微鏡下觀察黏附情況，并拍照。

1.4.4細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

1.4.4.1菌懸液的制備

將副干酪乳桿菌NCU622接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃活化14h后，4500r/min離心10min，收集菌體。用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌3次，將菌體重懸于DMEM不完全培養(yǎng)液中，用乳酸菌活菌計(jì)數(shù)法［17］快速測(cè)定菌懸液中菌體濃度，調(diào)整菌體濃度至1×108CFU/mL。

1.4.4.2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

參照Messaoudi等［21］的方法并略做改動(dòng)。將培養(yǎng)好的Caco-2細(xì)胞進(jìn)行消化后，用DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，加入96孔組織培養(yǎng)板中，每孔200μL，于CO2培養(yǎng)箱（5%CO295%空氣）中37℃培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)至單層。棄去組織培養(yǎng)板各孔中培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS緩沖液沖洗板2遍。將各培養(yǎng)孔分成如下幾組：包括無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液孔（背景空白對(duì)照孔）、經(jīng)樣品處理的細(xì)胞孔（樣品孔）、未經(jīng)樣品處理的對(duì)照細(xì)胞孔（樣品對(duì)照孔）、未經(jīng)樣品處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔（樣品最大酶活性對(duì)照孔）、無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液和釋放劑孔（樣品最大酶活性背景空白對(duì)照孔），并做標(biāo)記。在背景空白對(duì)照孔、樣品對(duì)照孔、樣品最大酶活性對(duì)照孔、樣品最大酶活性背景空白對(duì)照孔中各加入200μL DMEM不完全培養(yǎng)液，在樣品孔加入200μL菌懸液（1×108CFU/mL），將組織培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱（5%CO295%空氣）中37℃培養(yǎng)24h。到預(yù)定檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前1h，從CO2培養(yǎng)箱中取出組織培養(yǎng)板，在樣品最大酶活性對(duì)照孔、樣品最大酶活性背景空白對(duì)照孔中加入試劑盒提供的乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放試劑，加入量為原有培養(yǎng)液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，采用乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒處理待測(cè)樣品，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各培養(yǎng)孔的吸光度，并按式（4）計(jì)算LDH釋放率。

式中：A0為樣品孔或樣品對(duì)照孔吸光度；A1為背景空白對(duì)照孔吸光度；A2為樣品最大酶活性對(duì)照孔吸光度；A3為樣品最大酶活性背景空白對(duì)照孔吸光度。

1.5數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0中的One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和顯著性分析，結(jié)果用±s表示。

2　結(jié)果與分析

2.1耐酸性

圖1　副干酪乳桿菌NCU622在不同pH值條件下的生長(zhǎng)情況Fig.1Growth of L. paracasei NCU622at different pH values

細(xì)菌在經(jīng)由胃部到達(dá)腸道的過(guò)程中，影響其活性的主要因素是胃液的pH值［7］。人體胃液的pH值通常在2.5～3.5的范圍內(nèi)波動(dòng)［22］，食物（尤其是流體）通過(guò)胃部的時(shí)間一般為1～2h［23］。副干酪乳桿菌NCU622的耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。在pH值為2.5的MRS液體培養(yǎng)基中作用3h后，副干酪乳桿菌NCU622的活菌數(shù)較0h處稍有下降，下降效果不顯著（P＞0.05）；在pH值為3.5的MRS液體培養(yǎng)基中作用3h后，其活菌數(shù)較0h處增加不顯著（P＞0.05）；在pH值為4.5的MRS液體培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)。這說(shuō)明，當(dāng)活化后的副干酪乳桿菌NCU622轉(zhuǎn)接至pH值分別為2.5、3.5和4.5的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，菌體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)消除了酸脅迫帶來(lái)的不利影響［24］，一定程度上保持了菌體細(xì)胞的穩(wěn)定性。

副干酪乳桿菌NCU622在pH2.5的MRS液體培養(yǎng)基中作用3h后，存活率可高達(dá)98.21%，活菌數(shù)在107CFU/mL以上，說(shuō)明該菌株對(duì)酸具有較好的耐受性，可在胃酸環(huán)境中及酸性食品，如發(fā)酵酸奶中，保持較高的活性［7］。

2.2耐膽鹽性能

人體小腸中膽鹽的質(zhì)量濃度在0.03～0.3g/100mL范圍內(nèi)波動(dòng)［25］，食物在小腸中的停留時(shí)間一般為1～4h［23］，因此本實(shí)驗(yàn)研究了副干酪乳桿菌NCU622在膽鹽質(zhì)量濃度分別為0.03、0.3、0.5g/100mL的MRS液體培養(yǎng)基中作用0～4h后，其活菌數(shù)的變化情況，結(jié)果如圖2所示。

圖2副干酪乳桿菌NCU622在不同膽鹽質(zhì)量濃度條件下的生長(zhǎng)情況Fig.2Growth of L. paracasei NCU622at different concentrations of bile salts

由圖2可知，膽鹽對(duì)副干酪乳桿菌NCU622的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，且隨其質(zhì)量濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)。在膽鹽質(zhì)量濃度為0.03g/100mL的MRS液體培養(yǎng)基中，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，副干酪乳桿菌NCU622的活菌數(shù)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，培養(yǎng)4h后，其活菌數(shù)較0h處顯著增加（P＜0.05）。在膽鹽質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5g/100mL的MRS液體培養(yǎng)基中作用1h后，活菌數(shù)均出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）?；罹鷶?shù)在短時(shí)間內(nèi)顯著下降可能是由于此質(zhì)量濃度的膽鹽使細(xì)胞膜質(zhì)迅速溶解、膜內(nèi)蛋白質(zhì)解離，這種近乎瞬間的溶解導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出，部分細(xì)胞迅速死亡［26］。而當(dāng)作用時(shí)間超過(guò)1h時(shí)，活菌數(shù)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而略有增加，說(shuō)明在此膽鹽質(zhì)量濃度條件下存活下來(lái)的菌體細(xì)胞能保持較好的穩(wěn)定性且出現(xiàn)生長(zhǎng)趨勢(shì)。副干酪乳桿菌NCU622在膽鹽質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5g/100mL的MRS液體培養(yǎng)基中作用4h后，存活率分別為95.14%和85.07%，活菌數(shù)均在106CFU/mL以上，滿足乳酸菌發(fā)揮益生作用的菌體濃度（一般為106～109CFU/mL）［27］要求。以上結(jié)果表明，該菌株在一定程度上可有效消除膽鹽脅迫所帶來(lái)的不利影響，在人體膽鹽生理濃度范圍內(nèi)可保持較高的活性，具有較好的膽鹽耐受性。

2.3黏附性能

2.3.1不同因素對(duì)副干酪乳桿菌NCU622黏附Caco-2細(xì)胞性能的影響

圖3不同菌體濃度對(duì)副干酪乳桿菌NCU622黏附Caco-2細(xì)胞的影響Fig.3Effect of different bacterial concentrations on the adherence of L. paracasei NCU622to Caco-2cells

2.3.1.1菌體濃度對(duì)黏附性能的影響由圖3可知，當(dāng)菌體濃度小于108CFU/mL時(shí)，黏附的細(xì)菌數(shù)隨菌體濃度的提高而顯著增加（P＜0.05）；當(dāng)菌體濃度達(dá)到108CFU/mL后，黏附菌數(shù)略有增加，增加效果不顯著（P＞0.05），黏附趨于飽和。推測(cè)該菌株的黏附性能在一定范圍內(nèi)具有濃度依賴性，而當(dāng)菌體達(dá)到一定濃度后，其表面的黏附素已經(jīng)和細(xì)胞中的大部分特異性受體結(jié)合，黏附在動(dòng)態(tài)平衡中保持一定的數(shù)目。

2.3.1.2作用時(shí)間對(duì)黏附性能的影響

圖4不同作用時(shí)間對(duì)副干酪乳桿菌NCU622黏附Caco-2細(xì)胞的影響Fig.4Effect of different incubation time on the adherence of L. paracasei NCU622to Caco-2cells

由圖4可知，當(dāng)副干酪乳桿菌NCU622與Caco-2細(xì)胞的作用時(shí)間小于2h時(shí)，黏附菌數(shù)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加（P＜0.05）。當(dāng)作用時(shí)間大于2h時(shí)，黏附菌數(shù)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而略有增加，增加效果不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明副干酪乳桿菌NCU622對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附作用在2h內(nèi)存在時(shí)間依賴關(guān)系，在2h后達(dá)到平衡狀態(tài)。

Chauvière等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在嗜酸乳桿菌LB對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附過(guò)程中，前1.5h內(nèi)黏附的菌體數(shù)量隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增加，1.5h后趨于平穩(wěn)。Elo等［28］發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌GG與Caco-2細(xì)胞相互作用2h后黏附達(dá)到飽和，但在1h時(shí)的黏附菌數(shù)只有最大黏附菌數(shù)的1/3左右。乳酸菌的黏附性是吸附和脫附的綜合效應(yīng)，故黏附過(guò)程存在時(shí)間效應(yīng)，需要作用一定的時(shí)間才能達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡［29］。

2.3.1.3生長(zhǎng)階段對(duì)黏附性能的影響

圖5不同生長(zhǎng)階段的副干酪乳桿菌NCU622對(duì)Caco-2細(xì)胞黏附性能Fig.5Effect of different growth stages on the adherence of L. paracasei NCU622to Caco-2cells

由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間小于14h時(shí)，黏附的細(xì)菌數(shù)隨著菌齡的增加而顯著增加（P＜0.05）。穩(wěn)定末期，黏附的細(xì)菌數(shù)略有下降，差異不顯著（P＞0.05）。而到了衰亡期時(shí)，黏附的細(xì)菌數(shù)與穩(wěn)定期相比顯著減少（P＜0.05）。說(shuō)明穩(wěn)定期時(shí)副干酪乳桿菌NCU622對(duì)

Caco-2細(xì)胞的黏附性能最好，這與陳臣［6］的研究結(jié)論一致。推測(cè)可能是由于穩(wěn)定期時(shí)，菌體細(xì)胞不斷積累黏附素及相關(guān)物質(zhì)，且菌體表面結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，更利于黏附作用的發(fā)生。

2.3.2副干酪乳桿菌NCU622對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性能

圖6副干酪乳桿菌NCU622對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附（×1000）000Fig.6Adherence of L. paracasei NCU622to Caco-2cells（×10001000）

副干酪乳桿菌NCU622對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附情況見(jiàn)圖6，經(jīng)平板計(jì)數(shù)黏附的細(xì)菌數(shù)為（21.19±0.94）CFU/Caco-2細(xì)胞。陳臣［6］研究了4株乳桿菌與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)2h后的黏附性能，植物乳桿菌ST-Ⅲ、鼠李糖乳桿菌LGG、干酪乳桿菌BD-Ⅱ和干酪乳桿菌LC2W的黏附菌數(shù)分別為（28.43±1.65）、（16.11±1.57）、（3.82±0.90）、（3.24±0.56）CFU/Caco-2細(xì)胞。本研究中副干酪乳桿菌NCU622對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附菌數(shù)為（21.19±0.94）CFU/Caco-2細(xì)胞，較植物乳桿菌ST-Ⅲ的低，較鼠李糖乳桿菌LGG、干酪乳桿菌BD-Ⅱ和干酪乳桿菌LC2W的高。任大勇［5］體外研究了9株乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性能，結(jié)果顯示植物乳桿菌1.557、唾液乳桿菌23174及干酪乳桿菌20296的黏附效果較好，其黏附菌數(shù)分別為（9.12±0.65）、（6.65±0.57）、（4.92±0.61）CFU/Caco-2細(xì)胞，較副干酪乳桿菌NCU622的低。

2.4細(xì)胞毒性

由圖7可知，副干酪乳桿菌NCU622與Caco-2單層細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)液中LDH的釋放率與單獨(dú)培養(yǎng)Caco-2單層細(xì)胞時(shí)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明副干酪乳桿菌NCU622在與Caco-2單層細(xì)胞共培養(yǎng)的過(guò)程中對(duì)其無(wú)明顯裂解作用。

3　結(jié)論

副干酪乳桿菌NCU622具有良好的耐酸及耐膽鹽性能。在pH2.5的MRS液體培養(yǎng)基中作用3h后，存活率為

98.21%，活菌數(shù)在107CFU/mL以上；在膽鹽質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5g/100mL的MRS液體培養(yǎng)基中作用4h后，存活率分別為95.14%和85.07%，活菌數(shù)均在106CFU/mL

以上。副干酪乳桿菌NCU622對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性能較強(qiáng)，當(dāng)菌體濃度為1×108CFU/mL、共培養(yǎng)2h后，平均每個(gè)Caco-2細(xì)胞上黏附的細(xì)菌數(shù)為（21.19±0.94）CFU。菌體濃度、作用時(shí)間及生長(zhǎng)階段對(duì)其黏附性能均有影響。黏附菌數(shù)隨著菌體濃度的增大而不斷增加，當(dāng)副干酪乳桿菌NCU622的菌體濃度達(dá)到108CFU/mL后，黏附菌數(shù)增加不顯著（P＞0.05）。副干酪乳桿菌NCU622對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附在一定時(shí)間范圍（0～2h）內(nèi)存在量效關(guān)系，培養(yǎng)2h后，黏附趨于飽和。穩(wěn)定期的副干酪乳桿菌NCU622

對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附效果最好。副干酪乳桿菌NCU622與

Caco-2單層細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，不會(huì)引起細(xì)胞的裂解。綜上可知，副干酪乳桿菌NCU622具有較好的耐酸耐膽鹽性能，對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性能較強(qiáng)，且對(duì)其無(wú)明顯裂解作用，符合益生菌的基本特征，值得進(jìn)一步研究。

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Acid，Bile Tolerance and Adhesion Properties of Lactobacillus paracasei NCU622

XIONG Tao，LIU Yanyan，HUANG Tao，HUANG Qiaofen
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，College of Life Science and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang330047，China）

Lactobacillus paracasei NCU622was examined for resistance to acid and bile，adhesion to Caco-2cells，and cytotoxicity against Caco-2cells.Furthermore，the impacts of bacterial concentration，incubation time and growth stage on the adhesion were also studied.It was found that L. paracasei NCU622showed a survival rate of98.21%after3h incubation in MRS broth adjusted to pH2.5.The survival rates of L. paracasei NCU622were95.14%and85.07%after4h incubation in MRS broth supplemented with0.3and0.5g/100mL oxgall，respectively.The adhesion（21.19±0.94）CFU/Caco-2cell）of L. paracasei NCU622was very excellent which was affected by the bacterial concentration，incubation time and growth stage.Moreover，L. paracasei NCU622did not cause Caco-2cells lysis after24h co-culture.In summary，L. paracasei NCU622tolerated well acid and bile，expressed high adhesion to Caco-2cells，and did not cause Caco-2cells lysis.These results demonstrate that L. paracasei NCU622presents favorable strain-specific properties for its utilization as probiotics in microecologics and fermented functional foods，and may have broad prospects for applications in fermented and functional foods.

L. paracasei NCU622；acid tolerance；bile tolerance；adhesion；cytotoxicity

TS201.3

A

1002-6630（2015）05-0093-06

10.7506/spkx1002-6630-201505018

2014-03-24

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100904）；“贛鄱英才555工程”領(lǐng)軍人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（18000063）；江西省教育廳高?？萍悸涞赜?jì)劃項(xiàng)目（贛財(cái)教［2011］243號(hào)）；國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索課題（SKLF-ZZB-201309）

熊濤（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橐嫔按笞诠吒咧祷?。E-mail：xiongtao0907@163.com