延邊泡菜品質(zhì)評(píng)價(jià)以及耐鹽酵母菌的篩選

烏日娜，孟令帥，王茜茜，于美玲，岳喜慶，武俊瑞，*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

延邊泡菜品質(zhì)評(píng)價(jià)以及耐鹽酵母菌的篩選

烏日娜1，2，孟令帥1，王茜茜1，于美玲1，岳喜慶1，武俊瑞1，*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

從延邊11個(gè)泡菜樣品中分離出37株酵母菌，根據(jù)其子囊孢子、假菌絲和細(xì)胞形態(tài)等生理生化特征，可將其分為愛(ài)尼拉酵母屬、拿遜酵母屬和畢赤氏酵母屬等9個(gè)屬。再?gòu)闹泻Y選出6株耐鹽酵母菌。對(duì)6株耐鹽酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行種屬鑒定。結(jié)果表明：6株耐鹽酵母菌分別來(lái)自兩個(gè)屬。LB1-3和YB1-3屬于釀酒酵母屬，LB1-3被鑒定為Kazachstania turicensis；YB1-3被鑒定為Kazachstania exigua。LD1-3、TB1-3、YL1-2和TL1-2屬于酵母屬，被鑒定均為賽瓦酵母（Saccharomyces servazzii）。

泡菜；酵母菌；26S rDNA；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；同源性分析

泡菜作為發(fā)酵食品之一，在我國(guó)已經(jīng)有很長(zhǎng)歷史。由于其制作成本低，風(fēng)味美，而且便于保藏，深受人們的喜愛(ài)。同時(shí)，泡菜中富含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括維生素、鈣和磷等無(wú)機(jī)物［1］。泡菜是蔬菜類經(jīng)自然發(fā)酵而得，是韓國(guó)和朝鮮族的一種傳統(tǒng)食品。就數(shù)量而言，有上百種泡菜，包括白蘿卜、辣白菜和大頭菜等［2］，現(xiàn)已被世界各地廣泛地用作配菜。泡菜的主要原料是大白菜，主要用于辣椒面食譜。它的制作方式是［3］：先用鹽水將白菜腌制，低溫貯存幾天，然后將辣椒、大蒜、生姜、魚汁、青梅汁和蜂蜜等配料混勻后，均勻地涂抹于白菜的表面；再將一些切片水果，涂抹在白菜的表面，最后經(jīng)乳酸菌等微生物發(fā)酵而成。延邊朝鮮族當(dāng)?shù)厝俗雠莶耍P(guān)鍵由三部分組成，那就是容器、鹽水及調(diào)料［4］，其中最關(guān)鍵的就是容器。用來(lái)存放泡菜的容器是地窖，也就是他們俗稱的地氣。地氣意指飲食五谷之氣，俗話說(shuō)“天氣通于肺，地氣通于嗌”，地窖對(duì)于泡菜來(lái)說(shuō)無(wú)疑是最好的保藏容器。

20世紀(jì)初，人們已經(jīng)開(kāi)始研究發(fā)酵蔬菜中的微生物［5］，大家都知道乳酸菌對(duì)于泡菜的發(fā)酵起著重要的作用，同時(shí)，酵母菌作為泡菜中的重要發(fā)酵微生物之一，對(duì)蔬菜發(fā)酵的風(fēng)味和質(zhì)地以及發(fā)酵后的貯藏也有著重要影響［6］。蔬菜發(fā)酵期間，酵母菌引發(fā)發(fā)酵生成乙醇，對(duì)腌制品后熟階段發(fā)生醋化反應(yīng)和生成芳香物質(zhì)是很重要的［7］。酵母菌在消耗可發(fā)酵糖方面起了關(guān)鍵作用，因?yàn)榭砂l(fā)酵糖的存在，在發(fā)酵蔬菜貯藏時(shí)，會(huì)被有害菌如腐敗菌利用，引起腌制品腐敗。而對(duì)發(fā)酵蔬菜起主導(dǎo)作用的乳酸菌一旦完成發(fā)酵后，會(huì)受到低pH值的抑制，不能再利用發(fā)酵糖。這時(shí)酵母菌仍可以很好地生長(zhǎng)繁殖，直至把發(fā)酵糖消耗殆盡為止，這一點(diǎn)對(duì)含有大量糖的胡蘿卜類蔬菜的發(fā)酵，尤其如此。因此，酵母菌被廣泛用于研究發(fā)酵中的代謝機(jī)理［8］。

分子生物學(xué)技術(shù)，常常被用來(lái)鑒定酵母菌的種屬［9］。國(guó)外學(xué)者應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)來(lái)自蘋果和柑橘中的、不同類型的酵母菌進(jìn)行鑒定，成功分離出了紅酵母和畢氏酵母［10］。當(dāng)今，乳酸菌對(duì)于發(fā)酵食品的作用不可替代，因此，酵母菌的研究不容忽視。只有對(duì)泡菜中的微生物進(jìn)行多方面研究，才能更好地利用酵母，生產(chǎn)出更高品質(zhì)的產(chǎn)品。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1采集的泡菜樣品

從延吉朝鮮族傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜的11個(gè)不同樣品中采集的結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　樣品采集結(jié)果Table1Information about samples collected in this study

1.1.2培養(yǎng)基［11］

孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯（PDA）培養(yǎng)基、麥?zhǔn)希∕cClary）培養(yǎng)基（醋酸鈉培養(yǎng)基）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基、硝酸鹽培養(yǎng)基、0.6%酵母浸汁、尿素瓊脂培養(yǎng)基和YEPD培養(yǎng)基。

1.1.3儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；無(wú)菌操作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司制造；DNP-9080生化培養(yǎng)箱上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-6恒溫水浴鍋國(guó)華電器有限公司；VS-1渦旋儀北京鼎昊原料科技有限公司；CR-21G離心機(jī)（50mL）天美科技儀器有限公司；Centrifuge-5418離心機(jī)（1.5mL）上海艾研生物科技有限公司；PTC-200梯度基因擴(kuò)增儀、瓊脂糖凝膠電泳儀美國(guó)伯樂(lè)公司；UV-3200分光光度計(jì)上海美普達(dá)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1泡菜中微生物群落的分析

1.2.1.1泡菜中乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定［12］

采用平板計(jì)數(shù)法，分別對(duì)11個(gè)泡菜樣品中的乳酸菌活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.1.2泡菜中酵母菌活菌數(shù)的測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法，分別對(duì)11個(gè)泡菜樣品中的酵母菌活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，具體步驟參照GB4789.15—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》。

1.2.1.3泡菜中大腸桿菌活菌數(shù)的測(cè)定［13］

分別對(duì)11個(gè)泡菜樣品進(jìn)行濃度稀釋，先進(jìn)行乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對(duì)產(chǎn)氣的發(fā)酵管進(jìn)行伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，最后，挑去可疑的大腸桿菌1～2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)之后，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽孢桿菌，即可報(bào)告為大腸桿菌陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)具體步驟以及MPN檢索表參照GB/T4789.3—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測(cè)定》。

1.2.2泡菜樣品的質(zhì)構(gòu)分析

將泡菜樣品切成邊長(zhǎng)5.0cm相同大小的塊狀，進(jìn)行質(zhì)地剖面分析（texture profile analysis，TPA）實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件：TA3/100探頭下實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為：探頭預(yù)測(cè)試速率2mm/s，測(cè)試速率0.5mm/s，返回速率0.5mm/s，數(shù)據(jù)頻率10點(diǎn)/s，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載10g，等待時(shí)間0s。測(cè)量結(jié)果：測(cè)量3次取平均值。

1.2.3泡菜中酵母菌的分離、純化與鑒定

1.2.3.1酵母菌的分離與純化

在無(wú)菌條件下，取泡菜汁樣品1mL加入蒸餾水中，再取1mL稀釋液加入9mL蒸餾水中，依次從10-1稀釋到10-6，分別取10-5和10-6兩個(gè)稀釋梯度的稀釋液100?L，用無(wú)菌涂布器以涂布的方式接種于孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度兩個(gè)平行，25℃培養(yǎng)48h［14］。

在兩個(gè)梯度的平板中，選取菌株分布均勻，數(shù)量適宜的平板，挑取不同的典型菌株接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)24h后，再繼續(xù)接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)24h［15］。將分離出的酵母菌，經(jīng)過(guò)平板劃線純化2～3次，接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48h，4℃保藏。

1.2.3.2酵母菌的形態(tài)學(xué)以及生理生化鑒定

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：將分離菌種接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基。25～28℃培養(yǎng)3d觀察［16］。

特征培養(yǎng)觀察：將分離菌種分別接種于PDA液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3d觀察［17］。

子囊孢子的形成：將鑒定菌株接種于McClary培養(yǎng)基上，25～28℃培養(yǎng)3～5d，涂片在顯微鏡下觀察［18］。

假菌絲形成：新培養(yǎng)物劃線接種于玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上，25～28℃培養(yǎng)3～5d，涂片在顯微鏡下觀察［19-20］。

葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：在0.6g/100mL酵母浸汁中加入葡萄糖，使糖質(zhì)量濃度達(dá)到2g/100mL，再將其分裝于含杜氏管的試管中（注意使杜氏管中沒(méi)有氣泡）。在115℃高壓滅菌15min后，將生長(zhǎng)旺盛的菌種接入發(fā)酵管中，25℃培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果［18］。

硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)：將待檢測(cè)的生長(zhǎng)旺盛的酵母菌接種在硝酸鹽培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)1～7d，滴加甲、乙混合液（1∶1，V/V），每5mL培養(yǎng)液加混合液0.1mL后，觀察結(jié)果，呈現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，若無(wú)紅色出現(xiàn)［11］，應(yīng)進(jìn)一步檢查，向上述實(shí)驗(yàn)管中加少許鋅粉，若出現(xiàn)紅色，表示硝酸鹽仍存在，為陰性反應(yīng)（硝酸鹽在醋酸的存在下，鋅粉將其還原成亞硝酸鹽，進(jìn)一步形成芳基肼紫紅色化合物）；若不產(chǎn)生紅色，表示硝酸鹽已被還原為氨和氮，仍為陽(yáng)性反應(yīng)。

脲酶實(shí)驗(yàn)：取新培養(yǎng)的酵母菌，接種于作水解尿素的瓊脂斜面上，28℃培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果［21］。

1.2.4泡菜中耐鹽酵母菌的篩選

將37株酵母菌分別接種于0、4、7、10、15g/100mL鹽的YEPD液體培養(yǎng)基，每個(gè)制作兩個(gè)平行，28℃培養(yǎng)1d，選取生長(zhǎng)良好的酵母菌株，再用平板涂布的方法在PDA固體培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)2d［22］，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.5酵母菌26S rDNA序列測(cè)定

1.2.5.1酵母菌基因組DNA的提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增

將酵母菌培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltriethylammnonium bromide，CTAB）法提取基因組DNA［23］，酵母菌的26S rDNA，采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增［24］，擴(kuò)增片段約為600bp。上游引物為NL-1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，下游引物為NL-4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。PCR擴(kuò)增體系（50?L）：10×Buffer5?L，dNTPs（2.5mmol/L）4?L，引物NL-11?L，引物NL-41?L，模板DNA1.25ng，Taq聚合酶（5U/?L）0.4?L，補(bǔ)充ddH2O至50?L，然后離心混勻。

1.2.5.2酵母菌PCR產(chǎn)物檢測(cè)與測(cè)序

預(yù)先制備1.2%的瓊脂糖凝膠，擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，取5?L的PCR產(chǎn)物與1?L6×Loading Buffer混合，加樣于瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，進(jìn)行電泳，電壓5V/cm，電泳液為0.5×TAE。電泳后，用溴化乙錠染色20～30min，紫外燈下觀察。如果PCR成功，則分別可見(jiàn)到約為600bp的條帶。測(cè)序工作由上海桑尼生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.6酵母菌的同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建［25］

利用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），將所分離酵母菌的26S rDNA序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株的對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行比較分析，尋找與目的基因序列同源性最高的已知菌種。然后從GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中，提取已知標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因序列與分離菌株的序列，用ClustalX2.1軟件進(jìn)行校準(zhǔn)排齊，用MEGA5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1泡菜中微生物群落的檢測(cè)結(jié)果由表2可知，乳酸菌總數(shù)為1.83×108～1.35× 1010CFU/mL，酵母菌總數(shù)為2.83×107～7.10× 108CFU/mL，乳酸菌總數(shù)比酵母菌總數(shù)高1（lg（CFU/mL））左右。目前國(guó)內(nèi)對(duì)泡菜中乳酸菌和酵母菌的數(shù)量，沒(méi)有明確的規(guī)定。從表中還可以看出，乳酸菌數(shù)平均為

表2微生物群落的檢測(cè)結(jié)果Table2Microbial communities of kimchi samplesmples

2.70×109CFU/mL，酵母菌數(shù)稍次于乳酸菌數(shù)，平均為

3.31×108CFU/mL。大頭菜和白蘿卜中乳酸菌數(shù)量較多，辣白菜稍少一些。白蘿卜中的酵母菌數(shù)量較多，辣白菜的最少。對(duì)于大腸桿菌來(lái)講，龍井樣品的大腸桿菌數(shù)最少，延吉和圖們的樣品，大腸桿菌數(shù)稍多，但都符合GB2714—2003《醬腌菜衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定。

2.2泡菜的質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果

表3泡菜的質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果Table3Texture profile analysis of kimchiimchi

質(zhì)構(gòu)儀TPA測(cè)試的硬度、咀嚼性、內(nèi)聚性、彈性和膠著性能夠很好地反映泡菜的柔軟度、組織結(jié)構(gòu)和表皮質(zhì)地，可以用來(lái)評(píng)價(jià)泡菜的品質(zhì)。由表3可知，圖們白蘿卜（TB）的硬度、咀嚼性和膠著性這3個(gè)指標(biāo)的數(shù)值最小，內(nèi)聚性、彈性指標(biāo)的數(shù)值最大，說(shuō)明TB的品質(zhì)最好，而龍井大頭菜（LD）的硬度、咀嚼性和膠著性這3個(gè)指標(biāo)的數(shù)值最大，內(nèi)聚性和彈性指標(biāo)的數(shù)值幾乎為最小，說(shuō)明LD的品質(zhì)最差。

總體來(lái)看，按地區(qū)進(jìn)行分類，延吉的泡菜樣品硬度、咀嚼性和膠著性這3個(gè)指標(biāo)的平均數(shù)值為860g、6.0mJ和312g，基本都為最小，內(nèi)聚性和彈性指標(biāo)的平均值分別為0.46和2.20g，各個(gè)地區(qū)的泡菜樣品這兩個(gè)指標(biāo)的數(shù)值相差很小，說(shuō)明延吉的泡菜樣品品質(zhì)最好。龍井的泡菜樣品硬度、咀嚼性和膠著性這3個(gè)指標(biāo)平均值為1584g、14.6mJ和687g，數(shù)值最大，說(shuō)明龍井的泡菜樣品品質(zhì)最差。

總體來(lái)看，按泡菜的種類進(jìn)行分類，辣白菜的硬度、咀嚼性、膠著性、內(nèi)聚性和彈性指標(biāo)的平均數(shù)值分別為1560g、13.2mJ、628g、0.40和2.09mm，白蘿卜的硬度、咀嚼性、膠著性、內(nèi)聚性和彈性指標(biāo)的平均數(shù)值為417g、7.2mJ、251g、0.65和2.96mm，大頭菜的硬度、咀嚼性、膠著性、內(nèi)聚性和彈性指標(biāo)的平均數(shù)值為1409g、9.5mJ、526g、0.39和1.88mm，對(duì)比后不難看出，白蘿卜的硬度、咀嚼性和膠著性指標(biāo)平均數(shù)值最大，內(nèi)聚性和彈性指標(biāo)的平均數(shù)值最小，說(shuō)明白蘿卜的品質(zhì)最好。同理，可以看出辣白菜的品質(zhì)最差。

2.3酵母菌的形態(tài)學(xué)和生化鑒定結(jié)果

根據(jù)表4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》可以將分離出的37株酵母菌分成愛(ài)尼拉酵母屬、拿遜酵母屬、畢赤氏酵母屬、克勒克酵母屬、德巴利酵母屬、耶羅威亞酵母屬、絲孢酵母屬、酵母屬以及裂殖酵母屬等9個(gè)屬，詳細(xì)分類如下：

AL1-3、LL1-2、TL1-1、TD1-3和YL1-3的菌落呈乳白色和奶油色為主，細(xì)胞為芽殖，卵圓形或圓形，產(chǎn)生假菌絲，但不產(chǎn)生子囊孢子，葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陰性，脲酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，初步推斷為愛(ài)尼拉酵母屬。

AL1-1和AL1-2的菌落為奶油色，細(xì)胞為芽殖，卵圓形或圓形，產(chǎn)生假菌絲，產(chǎn)生子囊孢子，子囊孢子通常為1～2個(gè)，葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陰性，脲酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，初步推斷為拿遜酵母屬。

YB1-3、YB1-2的菌落為奶油色或乳白色，細(xì)胞為芽殖，卵圓形或圓形，產(chǎn)生假菌絲，產(chǎn)生子囊孢子，子囊孢子通常為1～4個(gè)，葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性或陰性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陰性，脲酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，初步推斷為畢赤氏酵母屬。

AB1-3、AB1-4、YL1-1、LL1-1、YB1-1、TB1-2、LD1-1和TD1-1的菌落為奶油色或乳白色，細(xì)胞為芽殖，橢圓形、卵圓形或圓形，不產(chǎn)生假菌絲，不產(chǎn)生子囊孢子，葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陰性，脲酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，初步推斷為克勒克酵母屬。

YD1-4、LD1-2、LB1-1、LL1-3、YB1-4、TB1-1和 LB1-3的菌落為奶油色、乳白色，有時(shí)為黃色，細(xì)胞為芽殖，圓形或橢圓形，不產(chǎn)生假菌絲，產(chǎn)生子囊孢子，子囊孢子通常為1～4個(gè)，葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性或陰性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陰性，脲酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，初步推斷為德巴利酵母屬。

表4　酵母菌的形態(tài)學(xué)和生化鑒定結(jié)果Table4Morphological and biochemical identification of yeasts

AB1-2和YD1-1的菌落為奶油色或乳白色，細(xì)胞為芽殖，卵圓形或圓形，產(chǎn)生假菌絲，產(chǎn)生子囊孢子，子囊孢子通常為1～4個(gè)，葡萄糖發(fā)酵陰性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陰性，脲酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，初步推斷為耶羅威亞酵母屬。

LB1-2、TB1-4、AB1-1、YD1-2的菌落為奶油色或乳白色，細(xì)胞為芽殖，卵圓形或圓形，產(chǎn)生假菌絲，不產(chǎn)生子囊孢子，葡萄糖發(fā)酵陰性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陽(yáng)性或陰性，脲酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，初步推斷為絲孢酵母屬。

YL1-2、TB1-3、LD1-3、TL1-2的菌落為奶油色或黃色，細(xì)胞為芽殖，圓形，不產(chǎn)生假菌絲，產(chǎn)生子囊孢子，子囊孢子通常為1～4個(gè)，葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陰性，脲酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，初步推斷為酵母屬。

TD1-2、LD1-4和YD1-3的菌落為奶油色或乳白色，細(xì)胞為裂殖，圓形，不產(chǎn)生假菌絲，產(chǎn)生子囊孢子，子囊孢子通常為1～8個(gè)，葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陰性，脲酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，初步推斷為裂殖酵母屬。

2.4酵母菌的鹽脅迫篩選結(jié)果

圖1　6株耐鹽酵母菌在不同鹽質(zhì)量濃度下的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果Fig.1Colony count results of6salt-tolerant yeast strains at different salt concentrations

利用YEPD培養(yǎng)基對(duì)分離出的37株酵母菌進(jìn)行篩選，共篩選出6株耐鹽菌，結(jié)果如圖1所示。YB1-3在鹽質(zhì)量濃度為7g/100mL左右時(shí)數(shù)量最低，在10g/100mL和15g/100mL時(shí)又有所回升，說(shuō)明其一開(kāi)始雖因鹽質(zhì)量濃度的增加，酵母菌生長(zhǎng)受到抑制，而后期酵母菌產(chǎn)生了耐鹽性，所以在10g/100mL與15g/100mL鹽質(zhì)量濃度時(shí)酵母菌的數(shù)量又有一定程度的增加；TL1-2與LB1-3都是在10g/100mL鹽質(zhì)量濃度下酵母菌數(shù)量最低，而酵母菌同樣產(chǎn)生了耐鹽性，并且在15g/100mL鹽質(zhì)量濃度下酵母菌數(shù)量有一定程度的回升；YL1-2在7g/100mL與15g/100mL鹽質(zhì)量濃度時(shí)有小幅度的回升，但整體呈小幅度的下降趨勢(shì)，鹽質(zhì)量濃度對(duì)其有一定的抑制作用，但影響不算太大；TB1-3在7g/100mL鹽質(zhì)量濃度時(shí)有著明顯的下降趨勢(shì)，酵母菌的生長(zhǎng)收到了抑制，而在10g/100mL時(shí)又有著較大幅度的回升，說(shuō)明其產(chǎn)生了耐鹽性，而在15g/100mL鹽質(zhì)量濃度時(shí)又開(kāi)始下降，說(shuō)明15g/100mL鹽質(zhì)量濃度已經(jīng)超越了其對(duì)鹽的耐受性，酵母菌的生長(zhǎng)又受到了抑制；LD1-3整體呈現(xiàn)出較為均勻的下降趨勢(shì)，但下降幅度有著逐漸減小的趨勢(shì)。

2.5酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)域序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

由表5可知，本實(shí)驗(yàn)篩選的6株耐鹽酵母菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性在97%以上，其中TB1-3與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性達(dá)到100%，基本確定來(lái)自兩個(gè)酵母菌菌屬。其中，2株為釀酒酵母屬（Kazachstania），分別是LB1-3和YB1-3。4株為酵母屬（Saccharomyces），分別是LD1-3、TB1-3、TL1-2和YL1-2。圖2為酵母菌根據(jù)26S rDNA建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可以看出，LB1-3和YB1-3屬于釀酒酵母屬，LB1-3被鑒定為Kazachstania turicensis，YB1-3被鑒定為Kazachstania exigua。LD1-3、TB1-3、YL1-2和TL1-2屬于酵母屬，被鑒定為賽瓦酵母Saccharomyces servazzii。這與表5中序列同源性對(duì)比結(jié)果一致。

表5酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)域序列同源性對(duì)比結(jié)果Table5Homology comparison of yeast26S rDNA D1/D2area sequences

圖2酵母菌根據(jù)26S rDNA建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2Phylogenetic tree of yeasts established on the basis of26S rDNA sequence analysis

3　結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)11個(gè)泡菜樣品中微生物群落的檢測(cè)結(jié)果可以看出，酵母菌和乳酸菌作為泡菜中的主要微生物，二者的數(shù)量比較接近，數(shù)量相差1（lg（CFU/mL））左右，這可能是由于乳酸菌和酵母菌在泡菜的發(fā)酵過(guò)程中所起的作用是協(xié)同的，互相促進(jìn)彼此制約的結(jié)果。

泡菜的指標(biāo)主要包括硬度、咀嚼性、彈性以及內(nèi)聚性等，而咀嚼性在數(shù)值上等于彈性、內(nèi)聚性和硬度的乘積，從而咀嚼性直接影響泡菜的口感和泡菜的品質(zhì)。從泡菜的分析結(jié)果，單個(gè)來(lái)看，圖們白蘿卜的品質(zhì)最好，龍井大頭菜的品質(zhì)最差。綜合來(lái)看，延吉的泡菜品質(zhì)最好，龍井的泡菜品質(zhì)最差?？傮w來(lái)看，白蘿卜的品質(zhì)最好，辣白菜的品質(zhì)最差。由于常規(guī)感官鑒定方法的可靠性和可比性差，而質(zhì)構(gòu)儀的測(cè)定結(jié)果又有著較高的靈敏度，使質(zhì)構(gòu)儀在食品品質(zhì)的評(píng)價(jià)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但是，需要注意的是，質(zhì)構(gòu)儀只是一種儀器，其測(cè)定結(jié)果與口感品嘗會(huì)有一定的差別，所以，本實(shí)驗(yàn)將采用質(zhì)構(gòu)儀和感官評(píng)價(jià)相結(jié)合的方法來(lái)研究泡菜的品質(zhì)。

圖1可以看出，6株耐鹽酵母菌在整個(gè)鹽質(zhì)量濃度區(qū)間的數(shù)量變化幅度，有一定的差異，這可能與不同酵母菌對(duì)鹽的適應(yīng)性的強(qiáng)弱有關(guān)，YB1-3、YL1-2、TB1-3和LD1-3對(duì)鹽的適應(yīng)性較好，而TL1-2對(duì)鹽的適應(yīng)性最差。從6株菌的對(duì)比可以看出，YB1-3對(duì)鹽的耐受性比較穩(wěn)定，并且耐受性最好，菌株YB1-3、TL1-2和LB1-3在鹽質(zhì)量濃度增加到15g/100mL時(shí)該菌仍有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，說(shuō)明該菌的最大耐受鹽質(zhì)量濃度可能高于15g/100mL，這對(duì)于醬油等高鹽度發(fā)酵食品的研制開(kāi)發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。

表4中生理生化鑒定結(jié)果得出YB1-3為畢赤氏酵母屬，LB1-3為德巴利酵母屬，LD1-3、TB1-3、YL1-2和TL1-2為酵母屬，而表5酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)域序列同源性對(duì)比結(jié)果顯示LB1-3和YB1-3屬于釀酒酵母屬，LD1-3、TB1-3、YL1-2和TL1-2屬于酵母屬，可以看出，LD1-3、TB1-3、YL1-2和TL1-2這4株菌的細(xì)胞生物學(xué)和生化鑒定與分子鑒定結(jié)果相一致，鑒定結(jié)果為酵母屬。其余2株菌的生化鑒定與分子鑒定結(jié)果均不相符，說(shuō)明細(xì)胞生物學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果可以提供參考，但是可信度還不能達(dá)到百分之百，同時(shí)，生理生化實(shí)驗(yàn)不僅繁瑣、費(fèi)時(shí)，而且因?qū)嶒?yàn)條件的不同重現(xiàn)性不好，人的因素也是影響其準(zhǔn)確度的主要因素之一?；诜肿由飳W(xué)和PCR鑒定方法，因其擴(kuò)增片段的多態(tài)性，在短時(shí)間內(nèi)極大地提高了菌株鑒定的特異性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性，進(jìn)一步肯定了分子鑒定在酵母菌的種屬鑒定中的作用。

本研究從11個(gè)延邊朝鮮族自治州泡菜樣品中共分離出37株酵母菌，經(jīng)染色以及生理生化鑒定，37種酵母菌共來(lái)自9個(gè)屬，分別是愛(ài)尼拉酵母屬、拿遜酵母屬、畢赤氏酵母屬、克洛克酵母屬、德巴利酵母屬、耶羅威亞酵母屬、絲孢酵母屬、酵母屬以及裂殖酵母屬。

通過(guò)對(duì)酵母菌鹽質(zhì)量濃度脅迫的篩選，6株酵母菌的最高耐鹽質(zhì)量濃度可以達(dá)到15g/100mL，其中，YB1-3菌株在各個(gè)鹽質(zhì)量濃度條件下的酵母菌菌數(shù)最多，平均可以達(dá)到6×108CFU/mL；TL1-2菌種在各個(gè)鹽質(zhì)量濃度條件下的酵母菌菌數(shù)最少，平均只有2.5×107CFU/mL，但是，該菌在鹽脅迫下菌種生長(zhǎng)最穩(wěn)定，而YB1-3在高質(zhì)量濃度的鹽脅迫下有著最好的生長(zhǎng)趨勢(shì)。

利用26S rDNA序列分析法，對(duì)6株耐鹽菌進(jìn)行鑒定，經(jīng)同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果6株耐鹽酵母菌分別來(lái)自兩個(gè)酵母菌菌屬。LB1-3和YB1-3屬于釀酒酵母屬，LB1-3被鑒定為Kazachstania turicensis，YB1-3被鑒定為Kazachstania exigua。LD1-3、TB1-3、YL1-2和TL1-2屬于酵母屬，被鑒定為賽瓦酵母Saccharomyces servazzii。

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Quality Evaluation of and Salt-Tolerant Yeast Screening from Yanbian Kimchi

WU Rina1，2，MENG Lingshuai1，WANG Qianqian1，YU Meiling1，YUE Xiqing1，WU Junrui1，*
（1.College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang110866，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，College of Food Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Totally 37yeasts were isolated from11kimchi samples from Yanbian prefecture，Jilin province，and classified taxonomically into Eeniella，Nadsonia，Pichia and other6genera according to their ascospore，pseudohyphae and cell morphology.Out of these isolates，six with salt tolerance were selected and identified by26S rDNA D1/D2regional sequence and phylogenetic tree analyses.The results showed that the six strains with salt tolerance were from two yeast species.Among these strains，LB1-3and YB1-3belonged to Kazachstania，LB1-3was identified as Kazachstania turicensis，YB1-3was identified as Kazachstania exigua，and LD1-3，TB1-3，YL1-2and TL1-2were identified as Saccharomyces servazzii.

kimchi；yeast；26S rDNA；phylogenetic tree；homology analysis

Q93

A

1002-6630（2015）05-0083-06

10.7506/spkx1002-6630-201505016

2014-08-31

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471713；31370502）；中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014M560395）；遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)資助計(jì)劃項(xiàng)目（2014048）；沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)“天柱山英才支持計(jì)劃”項(xiàng)目作者簡(jiǎn)介：烏日娜（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail：wrn6956@163.com

武俊瑞（1977—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail：junruiwu@126.com