旋磁在人前列腺增生BPH-1細胞增殖和凋亡中的作用與機制探討*

雷洪恩許永德關瑞禮楊璧鋮李 猛惠 宇高喆珠辛鐘成**

1.北京大學第一醫(yī)院男科中心（北京 100034）;

2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院泌尿外科; 3. 蘇州大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科

·論 著·

旋磁在人前列腺增生BPH-1細胞增殖和凋亡中的作用與機制探討*

雷洪恩1許永德1關瑞禮1楊璧鋮1李 猛2惠 宇3高喆珠1辛鐘成1**

1.北京大學第一醫(yī)院男科中心（北京 100034）;

2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院泌尿外科; 3. 蘇州大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科

目的 研究旋轉磁場在人前列腺增生BPH-1細胞增殖和凋亡中的作用，并就其影響機制作相關探討。方法 設置空白對照（NC）組和旋轉磁場處理（MF）組，不同時間劑量MF組使用CKJ-II（QLX-II）型高場強旋磁治療儀分別處理1 min、5 min、10 min和20 min。然后利用CCK-8實驗、細胞劃痕及免疫熒光染色檢測其對細胞增殖遷移影響，利用Annexin V-PE/ 7-AAD雙染流式細胞術法檢測其對細胞凋亡影響，利用蛋白印跡實驗和免疫熒光檢測其對細胞凋亡相關信號通路蛋白表達的影響。結果 與NC組相比，MF組BPH-1細胞經旋轉磁場處理后，細胞增殖計數(shù)和細胞遷移距離明顯降低，細胞增殖核抗原Ki67表達明顯降低，細胞凋亡比例明顯增加，并且與細胞內p38 MAPK磷酸化水平明顯增加及Caspase-3活化蛋白明顯增加有關。結論 旋轉磁場可使BPH-1細胞發(fā)生增殖遷移減弱和凋亡增加，可能與細胞中細胞增殖相關的核抗原Ki67表達減少和細胞凋亡相關的p38 MAPK/Caspase-3凋亡分子信號通路激活有關。

前列腺增生; 旋轉磁場; 細胞增殖; 細胞凋亡

良性前列腺增生癥（benign prostatic hyperplasia, BPH）為泌尿外科常見疾病，其患病率隨著年齡的增加而增加，該疾病在40～49歲男性中患病率為25%，而在70～79歲男性中患病率高達80%，臨床上主要表現(xiàn)為下尿路刺激癥狀，嚴重危害中老年人的生活質量[1,2]。目前BPH的治療方法主要有改變生活習慣和選擇性α-受體阻滯劑、5α-還原酶抑制劑等口服藥物治療，口服藥物治療效果不佳的重度BPH患者、反復泌尿系感染合并結石癥、尿潴留、輸尿管擴張腎盂積水和腎功能損傷患者需要手術治療[1]。但已有的上述BPH治療方法還存在癥狀改善不徹底、藥物副作用、手術耐受性和術后并發(fā)癥等問題。

旋轉磁場（gyromagnetic field）屬于物理療法的一種，可通過磁場與人體的相互作用而達到治療疾病和調節(jié)生理病理狀態(tài)的作用。研究表明，旋轉磁場可以通過洛倫茲力、磁力、渦電流和熱效應等作用于生物體，達到改善細胞代謝、增加細胞膜的通透性等效果[3]。有研究報道，磁療具有緩解肌肉痙攣和降低血壓以及抑制某些癌的生長與轉移等功能[4,5]，近年來磁療這一非侵入治療方式已經應用至眼科、神經疾病、口腔、心臟病和骨關節(jié)炎等疾病中[6]，并且臨床研究及動物模型研究中也已經有磁療用于治療BPH的相關報道[7,8]。我們前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)CKJ-Ⅱ（QLX-Ⅱ）型高場強旋磁治療儀可顯著改善BPH患者的下尿路刺激癥狀，但是其作用機制目前還不清楚。

本研究采用體外培養(yǎng)的人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞，觀察其經旋轉磁場處理后細胞增殖遷移和凋亡及相關分子信號通路的變化，探討旋轉磁場治療BPH的可能性及其相關作用機制。

材料與方法

一、材料

（一）細胞

人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞，購買自國家實驗細胞資源共享平臺。

（二）試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.25%胰酶消化液購買自美國Hyclone公司，CCK-8細胞計數(shù)試劑盒購買自DOJINDO東仁化學科技（上海）有限公司，Annexin V-PE/ 7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒和蛋白提取試劑盒購買自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，Anti-Ki67抗體購買自美國Abcam公司，Anti-P-p38 MAPK抗體、Anti-p38 MAPK抗體和Anti-Cleaved Caspase-3抗體購買自美國Cell Signaling Technology（CST）公司。

（三）儀器

CKJ-Ⅱ（QLX-Ⅱ）型高場強旋磁治療儀購買自北京旋磁醫(yī)療設備有限公司，Mutiskan MK3型酶標儀購買自美國Thermo公司，DMI 6000 B型熒光顯微鏡購買自德國Leica公司，F(xiàn)ACSCalibur型流式細胞儀購買自美國BD公司，C-DiGit?型掃膜儀購買自英國LICOR公司。

二、方法

（一）細胞培養(yǎng)

BPH-1細胞培養(yǎng)條件為37℃和5% CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清和1%L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞匯合率達80%時，使用0.25%胰酶消化傳代，每周傳代3次，傳代比例為1:3，直至細胞數(shù)量達到實驗要求。細胞凍存時使用含10%二甲基亞砜（DMSO）、20%胎牛血清和70% RPMI-1640培養(yǎng)基的凍存液，慢速逐級降溫至液氮中保存。

（二）旋轉磁場處理細胞方法

CKJ-Ⅱ（QLX-Ⅱ）型高場強旋磁治療儀處于工作狀態(tài)時，旋轉時上磁極表面的磁場強度為280 mT（2800 Gs），下磁極的表面的磁場強度為150 mT（1500 Gs），上下磁極的間距為32 cm；其實驗器皿放置處磁場強度隨時間變化而變化，且磁場強度按正弦函數(shù)分布，最大值為300 mT（3000 Gs），頻率為6 Hz。根據旋磁治療儀使用說明書，旋轉磁場處理細胞時，人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞培養(yǎng)皿置于CKJ-II（QLX-II）型高場強旋磁治療儀的上述實驗器皿放置處。

（三）細胞增殖計數(shù)實驗

BPH-1細胞匯合率達80%時，使用0.25%胰酶消化后計數(shù)，接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL培養(yǎng)基，設3個平行復孔。實驗設置空白對照（NC）組和旋轉磁場處理（MF）組。等待細胞貼壁后，將實驗組96孔細胞培養(yǎng)板置于CKJ-Ⅱ（QLX-Ⅱ）型高場強旋磁治療儀中分別處理1 min、5 min、10 min和20 min，處理方法如上述所述，每天1次，連續(xù)處理2d；當比較NC組和MF 10 min組生長曲線時，處理方法如上述所述，每天1次，連續(xù)處理4d。細胞計數(shù)時，向96孔細胞培養(yǎng)板的每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在37℃恒溫培養(yǎng)箱內孵育1 h，用Mutiskan MK3型酶標儀測定在450 nm處的吸光度，樣品中活細胞數(shù)量與其吸光度大小成正比。

（四）細胞劃痕實驗

將BPH-1細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，將實驗組細胞置于CKJ-Ⅱ（QLX-Ⅱ）型高場強旋磁治療儀中按上述方法進行處理，每天1次，連續(xù)處理2d。待細胞匯合率達90%時，使用滅菌的200 μL移液器槍頭垂直于孔背面的橫線標記劃線，每組3個平行復孔。劃線后使用PBS清洗3次以去除細胞殘骸和碎片，后換用不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。于劃線0 h和24h分別將細胞行0.2%結晶紫染色，經DMI 6000 B型熒光顯微鏡行明場觀察并拍片后，使用美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）研發(fā)的ImageJ 1.47u軟件統(tǒng)計并分析細胞遷移距離。

（五）細胞爬片免疫熒光實驗

將已消毒的24 mm×24 mm蓋玻片置于6孔細胞培養(yǎng)板中，按2×104/mL的細胞密度將細胞接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片，設置NC組和MF 10 min組。細胞貼壁后經旋轉磁場處理，方法如上述所述，每天1次，連續(xù)處理2d。行免疫熒光時，細胞爬片經PBS清洗、甲醛固定、0.5% Triton X-100通透液孵育、5%正常二抗血清封閉和一抗孵育4℃過夜，經熒光二抗和DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色后，至DMI 6000 B型熒光顯微鏡下觀察并拍片。

（六）細胞凋亡流式檢測

將細胞按2×104/mL的密度將細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，設置NC組和MF不同劑量組。等待細胞貼壁后，將實驗組6孔細胞培養(yǎng)板置于旋轉磁場中分別處理1 min、5 min、10 min和20 min，處理方法如上述所述，1次/d，連續(xù)處理2d。細胞凋亡流式檢測使用南京凱基生物科技發(fā)展有限公司的Annexin V-PE/ 7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒，按其操作說明書收集細胞孵育染液后，行FACSCalibur型流式細胞儀上機檢測。

（七）蛋白印跡實驗

使用蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白后，經變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳（SDS-PAGE）后，將分離的蛋白質轉移到PVDF膜上，后經5%脫脂奶粉溶液封閉和一抗孵育4℃過夜，后經HRP標記的二抗孵育后，使用膜化學發(fā)光法檢測結果，曝光經C-DiGit?型掃膜儀掃描。目的蛋白條帶及內參蛋白條帶的灰度值使用NIH研發(fā)的ImageJ 1.47u軟件統(tǒng)計并分析。

三、統(tǒng)計學方法

所有資料均采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學處理，結果以均數(shù)±標準差（±s）表示。各組間比較采用單因素方差分析，其中方差齊者用LSD法，方差不齊者用Dunnett's檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、旋轉磁場可抑制人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞的增殖和遷移

與空白對照（NC）組相比，旋轉磁場處理（MF）組人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞行CCK-8細胞計數(shù)實驗時細胞數(shù)目降低。其中MF 5 min組、MF 10 min組和MF 20 min組BPH-1細胞增殖較NC組細胞增殖明顯降低且具有統(tǒng)計學意義（見圖1A），并且MF 10 min組增殖抑制效果最好，故后續(xù)生長曲線觀察和細胞免疫熒光等實驗中選取MF 10 min組作為實驗處理組。此外，BPH-1細胞經上述旋轉磁場處理，連續(xù)4d行生長曲線觀察，發(fā)現(xiàn)MF 10 min組BPH-1細胞增殖較NC組細胞增殖在第2、3和4天明顯降低且具有統(tǒng)計學意義（見圖1B）。

細胞劃痕檢測細胞遷移試驗結果顯示，MF 10 min組BPH-1細胞經上述旋轉磁場處理后，細胞遷移能力較NC組明顯降低且具有統(tǒng)計學意義（見圖1C和圖1D）。

圖1 旋轉磁場對人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞增殖遷移的影響

二、旋轉磁場可抑制人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞核抗原Ki67的表達

旋轉磁場MF 10 min組BPH-1細胞經上述方法處理后，行細胞增殖相關的核抗原Ki67免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)MF 10 min組細胞較NC組細胞Ki67陽性率明顯降低且具有統(tǒng)計學意義（見圖2），以上結果證明了BPH-1細胞經旋轉磁場處理后增殖明顯減弱，與細胞Ki67表達受抑制有關。

三、旋轉磁場可促進人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞的凋亡

與NC組相比，BPH-1細胞經上述方法處理后，MF 10 min組和MF 20 min組BPH-1細胞總凋亡率明顯增加且具有統(tǒng)計學意義（見圖3），其中細胞凋亡率增加以晚期細胞凋亡率增加為主。

圖2 旋轉磁場對人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞Ki67陽性率的影響

圖3 旋轉磁場對人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞凋亡的影響

四、旋轉磁場促進人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞凋亡的作用與p38 MAPK/Caspase-3細胞凋亡信號通路的激活有關

將細胞蛋白提取行蛋白印跡實驗時，發(fā)現(xiàn)MF 5 min、MF 10 min組和MF 20 min組BPH-1細胞蛋白中p38 MAPK磷酸化水平較NC組明顯升高具有統(tǒng)計學意義（見圖4A和圖4B）；另外，MF 10 min組BPH-1細胞經上述方法處理后，行凋亡相關抗原Cleaved caspase-3免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)MF 10 min組細胞較NC組細胞Cleaved caspase-3陽性率明顯增加且具有統(tǒng)計學意義（見圖4C和圖4D）。以上結果提示BPH-1細胞經旋轉磁場處理后凋亡增加與細胞內p38 MAPK/Caspase-3細胞凋亡信號通路激活有關。

圖4 旋轉磁場對人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞中p38 MAPK/Caspase-3細胞凋亡相關信號通路的影響

討 論

BPH發(fā)生的具體病理生理學機制仍有待于進一步的研究，目前已知其發(fā)生與體內睪酮和雙氫睪酮存在有關，其它危險致病因素有體內高水平的脫氫表雄酮和雌二醇、胰島素樣生長因子和C反應蛋白等[9,10]。此外，BPH的發(fā)生還與種族、肥胖、糖尿病、飲酒和缺乏鍛煉有關[11,12]。前列腺發(fā)生BPH病理改變時，其腺體移行區(qū)平滑肌細胞和上皮細胞發(fā)生增生，進而引起下尿路刺激癥狀等臨床表現(xiàn)。人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞來源于BPH病人前列腺上皮細胞，其細胞增殖能力與BPH的發(fā)生有密切的病理生理學基礎關聯(lián)。本研究采用體外培養(yǎng)的人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞作為實驗研究對象，為探討B(tài)PH發(fā)生的分子機制及尋找潛在治療靶點提供了一個良好的病理生理學模型。

據文獻研究報道，目前磁療已經廣泛應用于神經疾病[13]、心臟疾病[14]和骨關節(jié)疾病[15,16]等，但其具體作用機制還不甚清楚。磁療中應用的磁場可分為靜態(tài)磁場和動態(tài)磁場兩種，且不同磁場因應用方法或產生方式的不同而具有不同的物理學參數(shù)，磁療的具體臨床應用方法有很多種，如磁針法、磁電法、直流電磁療、旋轉磁療法、交變磁療法等[17]。目前，關于磁療過程中物理能量轉化為生物學效應的具體作用機制研究還不是很清楚。有研究認為，磁場可以通過產生洛倫茲力、磁力、渦電流和熱效應等作用于生物體，從而進一步產生生物學效應[3]。動態(tài)磁場的生物學效應可分為微電流和熱效應，本研究中應用的旋轉磁場屬于動態(tài)磁場的一種。當旋轉磁場作用于BPH-1細胞時，細胞內的微電流和熱效應的變化可能進一步影響相關信號通路分子表達的變化。而絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路是細胞應對外界刺激的重要調節(jié)體，所有的真核細胞都能表達MAPK，其調節(jié)著細胞生長、分化和凋亡等重要過程[18]。其中，p38 MAPK信號轉導通路在細胞凋亡、炎癥和細胞應激反應中發(fā)揮著重要的作用[19]。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）是一組存在于細胞質中的蛋白酶，為細胞凋亡的重要指標，其活化后在細胞凋亡執(zhí)行階段可切割某些蛋白，使細胞發(fā)生程序性死亡（凋亡）[20]。p38 MAPK磷酸化可介導Caspase-3發(fā)生活化，為細胞內重要凋亡轉導信號通路，可使細胞內Caspase發(fā)生層聯(lián)激活，引起細胞不可逆地發(fā)生凋亡[21]。在本研究中，旋轉磁場引起的細胞內微電流和熱效應的變化可被認作為一種應激源，而p38 MAPK作為細胞中應對外界刺激的重要調節(jié)分子，對此刺激作出應有的調節(jié)反應。我們的研究結果發(fā)現(xiàn)，旋轉磁場可促進BPH-1細胞中p38 MAPK磷酸化水平增加及Caspase-3發(fā)生活化等變化，證明BPH-1細胞在旋轉磁場作用下發(fā)生增殖與遷移減弱和凋亡增加等變化與細胞中p38 MAPK/Caspase-3凋亡分子信號通路激活有關。簡而言之，人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞在旋轉磁場作用下，細胞內細胞增殖相關的核抗原Ki67表達受到抑制，而細胞凋亡相關的p38 MAPK/ Caspase-3信號通路激活，且BPH-1細胞發(fā)生細胞增殖與遷移減弱和凋亡增加等現(xiàn)象，證明旋轉磁場具有治療BPH的潛在可能性。

目前，磁療這一非侵入治療方式已經在治療BPH的臨床研究中有所應用，但未就其具體分子機制展開討論。2011年，Giannakopoulos等利用脈沖磁場治療年齡在68～78歲間的BPH病人，并同時將其治療效果與服用α-受體阻滯劑藥物治療的病人作了對照[8]，結果發(fā)現(xiàn)，經脈沖磁場連續(xù)治療2周，每周治療5次，每次治療30 min后，10例BPH病人的國際前列腺癥狀評分（IPSS）、超聲測量前列腺體積、尿殘余量和平均尿流率等指標均較治療前明顯改善，而服用α-受體阻滯劑藥物治療對照組的10例病人較治療前只有IPSS指標有明顯改善。2014年，Leoci等利用前列腺增生的犬作為模型，研究脈沖磁場對BPH的治療作用[7]，結果發(fā)現(xiàn)，經脈沖磁場連續(xù)治療3周，每天治療2次，每次治療5 min后，20只實驗犬的前列腺體積平均降低57%，而且磁場對精子數(shù)量、睪酮水平和性欲沒有不利影響。這些臨床及臨床前研究為磁療將來應用于BPH治療提供了證據支持。

綜上所述，旋轉磁場可使人前列腺增生上皮細胞系BPH-1細胞發(fā)生增殖遷移減弱和凋亡增加等變化，且此變化與細胞中細胞增殖相關的核抗原Ki67表達減少和細胞凋亡相關的p38 MAPK/Caspase-3凋亡分子信號通路激活有關。旋轉磁場治療將來可能成為一種潛在的非侵入式臨床治療BPH的新方法。

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（2015-04-15收稿）

The effects of gyromagnetic feld on cell proliferation and apoptosis in human benign prostatic hyperplasia epithelial cell line BPH-1 and its mechanism＊

Lei Hongen1, Xu Yongde1, Guan Ruili1, Yang Bicheng1, Li Meng2, Hui Yu3, Gao Zhezhu1, Xin Zhongcheng1**
1. Andrology Center, Peking University First Hospital, Peking University, Beijing 100034, China; 2. Department of Urology, General Hospital of Ningxia Medical University; 3. Department of Urology, the First Affliated Hospital of Soochow University Corresponding Author: Xin Zhongcheng, E-mail: xinzc@bjmu.edu.cn

Objective To investigate the effects of gyromagnetic field (MF) on cell proliferation, migration, and apoptosis in human benign prostatic hyperplasia epithelial cell line BPH-1 and explore its related mechanism. Methods Cells in the normal control (NC) group and the MF group were exposed in MF for 1 min, 5 min, 10 min, and 20 min. Cell proliferation was analyzed by cell counting kit-8 and immunofuorescence, cell migration was analyzed by wound healing assay, cell apoptosis was analyzed by FACS double staining with Annexin V-PE/ 7-AAD, and cell apoptosis signaling pathway was analyzed by western blot and immunofuorescence. Results Compared with cells in the NC group, the cells in the MF group showed a signifcant decrease in cell number, migration distance, Ki67 expression, as well as a signifcant increase in apoptosis rate, levels of p38 MAPK phosphorylation and cleaved Caspase-3 expression. Conclusion In exposure to MF, BPH-1 cells' proliferation and migration were attenuated and cell apoptosis was increased, which may related to the down-regulation of Ki67 and activation of p38 MAPK/Caspase-3 signaling pathway.

prostatic hyperplasia; gyromagnetic feld; cell Proliferation; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.06.001

R 697.32

資助: 高等學校博士學科點專項科研基金博導類（編號：20120001110021）**

, E-mail: xinzc@bjmu.edu.cn