應(yīng)用QIAamp DNA Investgator Kit試劑盒提取牙齒DNA

泉州市公安局刑偵支隊(duì) 程 沖 楊穎峰 孫琳琳

牙齒 DNA含量較骨骼少，但是牙齒外層由牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)包裹，能夠抵抗外界環(huán)境的影響，使得 DNA不易被降解，而且牙齒易于提取、包裝。因此，在一些白骨化案件中，牙齒的 DNA檢驗(yàn)經(jīng)常用于尸源認(rèn)定。近日，本文作者采用了QIAamp DNA Investgator Kit試劑盒提取牙齒DNA，獲得了較好的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 樣本

本實(shí)驗(yàn)室日常受理的牙齒12份。

1.2 儀器和試劑

9700 型擴(kuò)增儀（AB公司）；3130XL型測(cè)序儀（AB公司）；QIAamp DNA Investgator Kit（Qiagen公司）；Identifiler Plus試劑盒（AB公司）。

1.3 方法

1.3.1 牙齒DNA的提取

（1）取牙齒1顆，用清水洗凈表面，用手術(shù)刀片刮去牙齒表層及污垢物，再用無水乙醇泡洗1次去除殘余的水分，用濾紙拭干。將牙齒放入砸牙器中用錘子砸成粉末，取100mg左右牙粉置于1.5mL離心管中。（2）加入360μl Buffer ATL和 20μl 20mg/mL PK，20μL 1mol／L DTT，56℃孵育過夜。（3）離心管快速離心后，加入300μl Buffer AL，混勻后，70℃孵育10分鐘。（4）13000rpm離心1分鐘，取上清液600μL轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，加入150μL無水乙醇，混勻后快速離心 10秒。（5）吸取上清液 750μL轉(zhuǎn)移至 QIAamp MinElute柱中，8000rpm離心1分鐘，再分別用700μL Buffer AW1、Buffer AW2、無水乙醇 8000rpm 離心 1分鐘洗滌QIAamp MinElute柱膜。（6）無水乙醇洗滌后，13000rpm離心3分鐘，取出QIAamp MinElute柱置于新的1.5mL離心管中，打開蓋子，室溫干燥10分鐘。（7）將30μL Buffer ATE加到柱膜的中央，蓋上蓋子，室溫孵育5分鐘，13000rpm離心1分鐘，收集流出液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

另取牙粉100mg按照參考文獻(xiàn)[1]中方法提取牙齒DNA，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

采用Identifiler Plus試劑盒在9700型擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為 10μL，DNA 模板為 1μL，擴(kuò)增參數(shù)參照Identifiler Plus試劑盒操作手冊(cè)。取上述 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3130XL型測(cè)序儀電泳，結(jié)果用GeneMapper ID v3.2軟件進(jìn)行分析，獲得等位基因分型圖譜。

2 結(jié)果

2.1 QIAamp DNA Investgator Kit試劑盒法與參考文獻(xiàn)[1]中方法結(jié)果比較

本文中，12例牙齒經(jīng)不同提取方法檢驗(yàn)均全部得出了一致的檢驗(yàn)結(jié)果。兩種方法均采用Qiagen公司生產(chǎn)的硅膜法提取純化DNA，比較不同提取方法的檢驗(yàn)結(jié)果，QIAamp DNA Investgator Kit試劑盒提取牙齒DNA操作簡單快捷，較常規(guī)的牙齒提取法節(jié)省時(shí)間，無需脫鈣，且文獻(xiàn)[1]中牙齒提取方法由于牙齒消化后需要純化的體系較大，文獻(xiàn)[1]中牙齒消化液與PBI溶液要按體積比1:5混勻，一般混合液能達(dá)到3mL左右，需多次離心才能過濾完全部混合液，而QIAamp DNA Investgator Kit方法只需 1次離心就能全部過柱完牙齒消化液。由于過柱次數(shù)少，在理論上減少了交叉污染的可能。同時(shí)，經(jīng)檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩種方法提取牙齒DNA在峰高、平衡性方面無顯著差異。

2.2 案例檢驗(yàn)應(yīng)用

2015年×月×日，我市某地發(fā)現(xiàn)一具經(jīng)過高壓鍋蒸煮的頭骨，送檢頭骨上牙齒2顆。牙齒采用本文方法提取DNA，并進(jìn)行STR分型檢驗(yàn)，結(jié)果成功獲得STR分型（圖1），為本案尸源認(rèn)定提供了重要依據(jù)。

圖1 經(jīng)過高壓蒸煮的牙齒STR分型

3 討論

QIAamp DNA Investgator Kit試劑盒法提取牙齒DNA的優(yōu)勢(shì)：（1）檢材需求量少，僅需100mg牙粉即可滿足檢驗(yàn)需求。（2）牙粉無需脫鈣處理。（3）牙粉消化液體積小，僅需1次離心即可全部過柱完。（4）離心次數(shù)少，不存在重復(fù)利用離心管，減少交叉污染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法檢出率一致，但QIAamp DNA Investgator Kit試劑盒法在操作過程更具有優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，QIAamp DNA Investgator Kit試劑盒提取牙齒DNA操作簡單，無需特殊儀器，成功率高且提取成本低廉，能滿足實(shí)際檢案的需求。

[1] 凃政,劉志芳,陳松,等.牙齒的 DNA 提取及 STR 分型研究[J].刑事技術(shù),2007,196 (5): 9-11.