慢病毒介導(dǎo)的GATA6基因沉默對(duì)肝癌Huh-7細(xì)胞凋亡的影響*

才錦麟，阿力亞，何強(qiáng)(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510080)

慢病毒介導(dǎo)的GATA6基因沉默對(duì)肝癌Huh-7細(xì)胞凋亡的影響*

才錦麟，阿力亞，何強(qiáng)△
(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510080)

目的:研究GATA6基因沉默對(duì)肝癌Huh-7細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)探討可能的作用機(jī)制。方法:構(gòu)建靶向GATA6基因的慢病毒干擾載體，用流式細(xì)胞術(shù)確定轉(zhuǎn)染效率，用RT-PCR和Western blotting法檢測(cè)其對(duì)人類肝細(xì)胞癌細(xì)胞株Huh-7的干擾效果，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例，Western blotting法檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組Huh-7細(xì)胞NF-κB及Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果:靶向GATA6基因的慢病毒干擾載體感染肝癌Huh-7細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染效率為57.4%。GATA6在mRNA和蛋白水平的表達(dá)明顯下降。GATA6沉默的肝癌Huh-7細(xì)胞凋亡比例增加(P＜0.05)，NF-κB和Bcl-2蛋白水平表達(dá)降低。結(jié)論:利用慢病毒載體干擾技術(shù)沉默GATA6基因的表達(dá)可以明顯促進(jìn)Huh-7細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的凋亡。靶向GATA6的RNA干擾技術(shù)在肝癌的基因治療中具有一定的研究?jī)r(jià)值。

GATA6基因;慢病毒;RNA干擾;肝細(xì)胞癌

［ABSTRACT］AIM:To explore the effectof GATA6 gene silencing on apoptosis of hepatocellular carcinoma Huh-7 cells.METHODS:RNA interference vectors of the targetgene GATA6 mediated by lentiviruswere constructed in vitro to transfect the hepatocellular carcinoma cell line Huh-7.The apoptotic rate of transfected cellswasmeasured by flow cytometry.The protein expression of GATA6，NF-κB and Bcl-2 in transfected cells was determined by Western blotting.RESULTS:The transfection efficiency was 57.4%.ThemRNA and protein expression of GATA6 reduced significantly after the carcinoma cell line Huh-7 being transfected by RNA interference vectorsmediated by lentivirus.The apoptotic rate of the carcinoma cellswith silent GATA6 genewas significantly increased(P＜0.05).The protein expression levels of NF-κB and Bcl-2 were also significantly decreased.CONCLUSION:Lentiviral vector-mediated RNA interference of GATA6 has an inhibitory effecton the expression of the gene itself，and promotes the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.Regulation of the apoptosis-related protein expression by the NF-κB signaling to influence the proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cellsmight be one of the possiblemechanisms.

［KEY WORDS］GATA6 gene;Lentivirus;RNA interference;Hepatocellular carcinoma

人類GATA結(jié)合蛋白6(GATA binding protein 6，GATA6)基因定位于18q11.1-q11.2，其編碼蛋白GATA6含有2個(gè)特殊的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)——鋅指結(jié)構(gòu)。這2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域能結(jié)合特定的核苷酸序列(A/T)GATA(A/T)［1］。在正常的個(gè)體發(fā)育階段，GATA6可直接與心肌組織的肌鈣蛋白轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)肌鈣蛋白的表達(dá);同時(shí)聯(lián)系經(jīng)典Wnt/β-catenin和非經(jīng)典Wnt/JNK信號(hào)通路［2］，促進(jìn)心肌組織成熟，在正常心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)特異性分化與器官形成中發(fā)揮重要促進(jìn)作用，是胚胎期發(fā)育中重要的調(diào)控基因［3］。

近年來，在膽管癌、卵巢癌等實(shí)體腫瘤中均發(fā)現(xiàn)GATA6的異常表達(dá)，且與腫瘤的分期和預(yù)后相關(guān)［4-5］。研究報(bào)道GATA6在結(jié)腸癌的發(fā)病及疾病進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。GATA6表現(xiàn)出作為腫瘤治療靶點(diǎn)潛在的可能性。本文旨在探討沉默GATA6后對(duì)Huh-7細(xì)胞的抑制作用及可能的途徑，為臨床上治療肝癌提供新的思路。

材料和方法

1細(xì)胞株和菌株

本實(shí)驗(yàn)采用人類肝細(xì)胞癌細(xì)胞株Huh-7(購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。慢病毒構(gòu)建及包裝中使用的腎上皮293T細(xì)胞和大腸桿菌菌株DH5α，均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司。293T細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。兔抗人GATA6多克隆抗體、鼠抗人NF-κB單克隆抗體和兔抗人Bcl-2單克隆抗體均為Santa Cruz產(chǎn)品。

2GATA6基因RNA干擾慢病毒載體制備及感染細(xì)胞

慢病毒載體質(zhì)粒PGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司。實(shí)驗(yàn)分3組:(1)隨機(jī)對(duì)照組(NC組);(2)空白對(duì)照組(control組);(3)實(shí)驗(yàn)組(shGATA6組)。構(gòu)建并合成shRNA干擾片段:正義鏈5’-GGGAAUUCAAACCAGGAAAUU-3’，反義鏈3’-UUCCCUUAAGUUUGGUCCUUU-5’，把合成的引物干粉溶解于退火緩沖液中，90℃水浴15 min，然后自然冷卻至室溫，形成帶黏性末端的雙鏈。將shRNA和PGCSIL-GFP進(jìn)行酶切連接，制備和鑒定克隆后，以Qiagen公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取慢病毒包裝系統(tǒng)中3種質(zhì)粒DNA，用293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。5 d后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，確定感染效率，流式細(xì)胞術(shù)定量。

3流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率

收集各組細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至5×108/L，加入500μL binding buffer懸浮細(xì)胞，分別加入10μL AnnexinV-FITC和10μL PI混勻，室溫避光孵育染色15 min，用FACS流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)，觀察凋亡細(xì)胞的百分比。

4RT-PCR法檢測(cè)GATA6 m RNA表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染細(xì)胞至24 h時(shí)，每組各取6孔細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，PCR儀擴(kuò)增。GATA6上游引物5’-CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT-3’，下游引物5’-GTCGAGGTCAGTGAACAGCA-3’。內(nèi)參照GAPDH上游引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。反應(yīng)條件:94℃5 min;40個(gè)循環(huán)，94℃45 s，57.5℃30 s，72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像。

5Western blotting檢測(cè)

分別取接種在6孔板的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的慢病毒感染后的Huh-7細(xì)胞，用經(jīng)過預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次。用濾紙吸凈PBS液后，每孔加入100μL RIPA裂解液+1μL PMSF。充分裂解后，用離心機(jī)于20 000×g、4℃下離心30min，上清液即為蛋白提取液。用BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)測(cè)定樣品蛋白濃度。將樣品煮沸10 min變性。蛋白上樣量50 μg，以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電泳轉(zhuǎn)移至NC膜，置于5%脫脂奶粉(TBST配制)中室溫封閉1 h。各轉(zhuǎn)染組分別加入GATA6抗體(1∶100)，NF-κB抗體(1∶500)，Bcl-2(1∶500)或GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃過夜。用TBST漂洗3次，每次10 min。加入HRP標(biāo)記羊抗鼠Ⅱ抗或羊抗兔Ⅱ抗，室溫下于搖床孵育2 h。再次用TBST洗膜后，ECL發(fā)光法顯色，X線片曝光。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

結(jié)果

1肝細(xì)胞癌Huh-7細(xì)胞株中GATA6干擾慢病毒的感染效率

為了研究肝癌細(xì)胞中GATA6基因的作用，我們選用GATA6基因表達(dá)水平較高的Huh-7細(xì)胞進(jìn)行GATA6基因沉默。Huh-7細(xì)胞鋪6孔板，24 h后加慢病毒感染。熒光顯微鏡下隨機(jī)選取視野，并對(duì)同一視野的細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行明視野和熒光視野的拍照，對(duì)比確定感染效率，利用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率為57.4%，見圖1。

Figure 1.Huh-7 cellswere infected with the GATA6-RNAi lentivirus for 96 h(×100).圖1　GATA6-RNAi慢病毒感染Huh-7細(xì)胞

2Western blotting和RT-PCR驗(yàn)證GATA6沉默的效率

為了了解感染了慢病毒的肝癌Huh-7細(xì)胞內(nèi)源性GATA6 mRNA和蛋白表達(dá)水平的改變，我們利用RT-PCR和Western blotting法對(duì)慢病毒感染的Huh-7細(xì)胞GATA6 mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢病毒感染Huh-7細(xì)胞后能有效降低內(nèi)源性GATA6 mRNA(圖2A)和蛋白(圖2B)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Figure 2.RT-PCR analysis of GATA6 mRNA levels(A)and Western blotting analysis of GATA6 protein levels(B)in NC group，control group and experimental group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group and control group.圖2　GATA6 m RNA及蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)

3慢病毒介導(dǎo)的GATA6沉默促進(jìn)肝癌Huh-7細(xì)胞凋亡

慢病毒介導(dǎo)的GATA6沉默組的細(xì)胞凋亡率為(27.10±2.75)%，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為(7.76±0.41)%和(7.70±0.45)%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

Figure 3.Flow cytometry of cell apoptosis in NC group，control group and experimental group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group and control group.圖3　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況

4慢病毒介導(dǎo)GATA6沉默可能通過NF-κB和Bcl-2途徑促進(jìn)Huh-7細(xì)胞凋亡

為了探討GATA6基因抑制凋亡的分子調(diào)控機(jī)制，慢病毒感染Huh-7細(xì)胞后，我們利用Western blotting法分析Huh-7細(xì)胞GATA6以及重要凋亡相關(guān)分子NF-κB和Bcl-2蛋白表達(dá)水平，以GAPDH蛋白作內(nèi)參照。結(jié)果顯示，GATA6沉默后，與對(duì)照組比較，GATA6、NF-κB和Bcl-2蛋白表達(dá)量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.Western blotting analysis of NF-κB and Bcl-2 proteins in NC group，control group and experimental group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group and control group.圖4　各組細(xì)胞NF-κB與BCL-2蛋白的表達(dá)

討論

NF-κB與基因啟動(dòng)子區(qū)的固定核苷酸序列結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄功能，從而調(diào)節(jié)許多重要的生理過程，包括急性期炎癥免疫反應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)凋亡和腫瘤的形成。NF-κB通過上調(diào)許多抗凋亡相關(guān)蛋白，比如Bcl-2蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［7］。Colo等［8］研究發(fā)現(xiàn)在人類慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞中GATA6敲除能引起NF-κB表達(dá)下調(diào)從而促進(jìn)凋亡的發(fā)生。

在人類大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，GATA6的表達(dá)增高是常見的事件。GATA6在人類胰腺上皮內(nèi)瘤變組織及胰腺癌組織中高表達(dá)，進(jìn)一步研究表明GATA6的拷貝數(shù)量與胰腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)［9］。在本研究中，我們成功構(gòu)建了抑制GATA6基因的慢病毒表達(dá)載體，并包裝成為病毒顆粒。再用病毒顆粒轉(zhuǎn)染肝癌Huh-7細(xì)胞，證實(shí)了轉(zhuǎn)染的效率，并發(fā)現(xiàn)Huh-7細(xì)胞中GATA6的表達(dá)下調(diào)。通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡比例增加。以上結(jié)果表明，下調(diào)GATA6的表達(dá)能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞凋亡。為了探討GATA6影響細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們從蛋白水平分析了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。Western blotting結(jié)果顯示NF-κB和Bcl-2蛋白水平明顯下降，以上結(jié)果表明:GATA6可能通過調(diào)控NF-κB和Bcl-2蛋白來影響細(xì)胞的凋亡過程。

90%以上的胰腺癌細(xì)胞，由于Wnt信號(hào)通路激活，提高了GATA6的表達(dá)，進(jìn)而加速EGFR和AKT的磷酸化，導(dǎo)致NF-κB的表達(dá)增加以及活性增強(qiáng)。持續(xù)活化的NF-κB促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的持續(xù)表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［10］。在部分結(jié)腸細(xì)胞中，抑癌因子microRNA-365表達(dá)受到抑制，從了促使了GATA6的激活，進(jìn)一步促進(jìn)了GPR49(G-protein coupled receptor 49)與NF-κB的活化，在結(jié)腸細(xì)胞的腫瘤化過程中起關(guān)鍵作用。GATA6作為一個(gè)促癌基因，當(dāng)它的表達(dá)受到抑制時(shí)，進(jìn)一步抑制NF-κB與Bcl-2的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的下降，抑制了細(xì)胞的凋亡進(jìn)程［4］。

在少數(shù)組織細(xì)胞中，GATA6表現(xiàn)為一個(gè)抑癌基因。研究表明，在人類惡性膠質(zhì)瘤組織中，導(dǎo)致GATA6基因失效的關(guān)鍵突變，而正常人類腦膠質(zhì)組織中未發(fā)現(xiàn)GATA6的突變。體外實(shí)驗(yàn)中，沉默膠質(zhì)細(xì)胞的GATA6基因，能夠增加VEGF表達(dá)，加速膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤化過程，GATA6表現(xiàn)出抑制腫瘤進(jìn)展的作用［11］。

GATA6作為一個(gè)促癌基因，其機(jī)制被廣泛討論。GATA6特異的鋅指結(jié)構(gòu)能與特異的G蛋白結(jié)合，促進(jìn)尿激酶型纖溶酶原激活物的活化，提高了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［12］。還有文獻(xiàn)報(bào)道，下調(diào)GATA6的表達(dá)，可以提高活性氧簇的生成，進(jìn)而阻滯胰腺癌細(xì)胞的增殖［13］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)GATA6基因在肝癌Huh-7細(xì)胞中起促癌作用，抑制肝癌Huh-7細(xì)胞凋亡的作用可能是促進(jìn)NF-κB與Bcl-2的表達(dá)，以上結(jié)果為肝癌基因治療提供新的靶點(diǎn)。

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Effects of GATA6 silencing mediated by lentivirus on apoptosis of human liver cancer Huh-7 cells

CAIJin-lin，Aliya，HE Qiang
(Department of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:lheqiang@hotmail.com)

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.030

1000-4718(2015)05-0938-05

2015-01-19［修回日期］2015-04-20

廣東省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No.2009B030801175)

Tel:020-87755766;E-mail:lheqiang@hotmail.com