• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    英夫利西單抗治療克羅恩病黏膜愈合的血清差異蛋白質(zhì)表達研究*

    2015-11-08 02:28:14廖詩樂陳白莉胡坤華饒佩斯黎明濤陳旻湖曾志榮
    中國病理生理雜志 2015年5期
    關(guān)鍵詞:斑點凝膠蛋白質(zhì)

    廖詩樂, 陳白莉, 胡坤華, 饒佩斯, 何 瑤, 黎明濤, 陳旻湖, 曾志榮△

    克羅恩病(Crohn’s disease,CD)在我國日益多見[1]。英夫利西單抗(infliximab,IFX)是目前唯一能改變CD自然病程的藥物,其主要作用是可以誘導(dǎo)獲得黏膜愈合(mucosal healing,MH),MH的CD患者住院率及手術(shù)率降低[2]。然而,IFX價格昂貴,如何能在治療前明確哪些患者經(jīng)IFX治療能達到MH,將具有明顯的經(jīng)濟效益比。基于此,本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析IFX獲得MH和未獲得MH患者血清蛋白表達的差異,為將來篩選預(yù)測的生物標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。

    材料和方法

    1 研究對象

    2012年9月~2013年9月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases,IBD)中心確診的CD患者共14例。診斷標(biāo)準采取我國的共識意見[3]?;颊呓o予 IFX 5 mg/kg,第 0、2 、6、14 周靜脈滴注給藥。于第10周復(fù)查腸鏡,根據(jù)克羅恩病內(nèi)鏡嚴重程度指數(shù)(Crohn’s disease endoscopic index of severity,CDEIS)情況,將病人分為MH和黏膜未愈(non-MH)。MH定義為內(nèi)鏡下未見潰瘍和(或)CDEIS評分<3分,non-MH定義為內(nèi)鏡下無應(yīng)答,即CDEIS評分較前下降<5分,潰瘍?nèi)匀淮嬖冢?]。采集7例MH患者治療前0周(A組)和治療后14周(B組)的靜脈血以及7例non-MH的CD患者0周(C組)和14周(D組)的靜脈血3 mL,4℃冰箱放置4 h,以3 000×g離心10 min,取上清樣本凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

    2 主要方法

    2.1 血清樣本處理 去除大部分高豐度清蛋白、IgG和純化、定量蛋白。然后按說明書,每400 pmol的Dye熒光染料標(biāo)記50 μg的蛋白質(zhì),Cy2標(biāo)記內(nèi)參照。采取混合樣本策略以消除個體差異,Cy3和Cy5交叉標(biāo)記樣本,以消除不同熒光染料染色效力的誤差。A、B、C、D各組血清均在相同條件下重復(fù)4次。2.2 雙向差異凝膠電泳 (2D-DIGE) 上樣至固相pH值干膠條(IPGstrip pH 4~7,24 cm),對血清樣品進行第1向等電聚焦(isoelectric focusing,IEF)電泳。IEF后,將完成平衡的IPG膠條放置于12.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel,SDS-PAG)上緣,進行第 2向SDS-PAG電泳至溴酚藍達凝膠下緣。

    2.3 2D-DIGE圖像分析 使用 Typhoon Scanner Control 5.0掃描儀軟件采集膠內(nèi)蛋白差異圖像,采用DeCyder 6.0軟件對圖像進行自動分析,選取表達差異大于1.5倍、t檢驗P<0.05的斑點作為差異表達蛋白質(zhì)斑點行進一步質(zhì)譜鑒定。

    2.4 差異蛋白的MALDI-TOF/TOF-MS鑒定 Ettan全自動凝膠斑點處理工作站進行蛋白質(zhì)斑點的切取、脫色、干燥、酶解。使用 Ultraflex III質(zhì)譜儀(Bruker)對酶解液進行MALDI-TOF/TOF-MS分析,得到各斑點的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting,PMF)和串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry,MS/MS)。使用Biotools軟件,以MASCOT(Matrix Science)為搜索引擎,在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中檢索所獲的圖譜。

    3 繪制STRING網(wǎng)絡(luò)功能圖

    在 STRING 數(shù)據(jù)庫(http://www.string-db.org)提交蛋白質(zhì)登記名,將所有差異表達的蛋白質(zhì)都納入功能網(wǎng)絡(luò)分析,研究差異表達蛋白質(zhì)所參與的路徑。

    4 統(tǒng)計學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析患者資料,正態(tài)分布的變量用均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示,非正態(tài)分布的資料用中位數(shù),極差(median,range)表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney U檢驗,治療前后比較采用配對t檢驗或Wilcoxon檢驗。分類變量比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 一般情況

    MH患者男性5例,女性2例,年齡(21.86±8.40)歲;non-MH患者男性4例,女性3例,年齡(19.14±5.90)歲。2組患者性別構(gòu)成比、年齡、病程、疾病部位、疾病行為、用藥史、腸外表現(xiàn)等臨床特征均無統(tǒng)計學(xué)差異。2組超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)和紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)在0周時均無顯著差異,治療后MH組上述指標(biāo)顯著低于non-MH組,也顯著低于MH組治療前0周的水平。CD活動指數(shù)(Crohn’s disease activity index,CDAI)在0 周時呈輕中度活動,2組無顯著差異;在14周時MH組達臨床緩解,與0周相比有顯著差異,且non-MH組與MH組相比有顯著差異。2組CDEIS評分在0周時無顯著差異,治療后存在顯著差異,見圖1、表1。

    Figure 1. Typical colonoscopic images.A:MH(0 week),CDEIS 22.4;B:MH(10 weeks),CDEIS 1.4;C:non-MH(0 week),CDEIS 18.6;D:non-MH(10 weeks),CDEIS 15.2.圖1 典型腸鏡圖像

    表1 患者的臨床資料Table 1.Clinical characteristics of CD patients with IFX therapy(n=7)

    2 凝膠圖像差異分析

    經(jīng)DeCyder 6.0軟件處理后Cy2、Cy3和Cy5染色在圖像中分別為藍色、綠色和紅色。經(jīng)DeCyder 6.0軟件分析檢測到1 505±177個蛋白質(zhì)斑點,獲得的凝膠間匹配率為72.0%±0.2%。以斑點平均體積差異大于1.5倍(表達差異上調(diào)或下調(diào)1.5倍),t檢驗P<0.05的蛋白質(zhì)點為有顯著差異的蛋白質(zhì)點,經(jīng)軟件統(tǒng)計分析,A組與B組之間、C組與D組之間、A組與C組之間以及B組與D組之間比較分別存在36、3、10和31個差異表達的蛋白質(zhì)斑點,共計發(fā)現(xiàn)44個顯著差異表達的蛋白質(zhì)斑點。顯著差異的蛋白斑點在2DDIGE凝膠上的具體位置見圖2。

    Figure 2.Merged image of 2D-DIGE.圖2 融合的2D-DIGE凝膠圖像

    3 質(zhì)譜分析結(jié)果

    差異表達的44個蛋白質(zhì)點進行MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜分析,以Mascot得分≥56分認為是可信結(jié)果,共鑒定出與27個差異點對應(yīng)的19種蛋白質(zhì),見表2。

    A組和B組比較鑒定出與25個差異點相對應(yīng)的17種差異蛋白質(zhì),其中在B組上調(diào)表達的蛋白有6種,包括中心體蛋白57 kD樣1(centrosomal protein 57kD-like 1,CEP57L1)、角蛋白 2e(keratin,type II cytoskeletal 2 epidermal,CK-2e)、白蛋白(albumin,ALB)、載脂蛋白 E(apolipoprotein E,APOE)、載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,APOA1)和甲基化CpG結(jié)合域蛋白 4(methyl-CpG-binding domain protein 4,MBD4),在B組下調(diào)表達的蛋白有11種,包括補體因子H(complement factor H,CFH)、銅藍蛋白(ceruloplasmin,CP)、α1-抗胰蛋白酶(alpha-1-antitrypsin,SERPINA1)等。

    C組和D組比較鑒定出與3個差異點對應(yīng)的2種差異蛋白質(zhì),CEP57L1和ALB均在D組上調(diào)表達;A組和C組比較鑒定出與2個差異點相對應(yīng)的2種差異蛋白,Mago-Nashi同源蛋白(Mago-Nashi homolog protein,MAGOH)在A組上調(diào)表達,觸珠蛋白(haptoglobin,HP)在A組下調(diào)表達;B組和D組比較鑒定出與21個差異點對應(yīng)的15種差異蛋白質(zhì),其中在B組上調(diào)表達的蛋白有6種,包括血清中α2-巨球蛋白(alpha-2-macroglobulin,A2M)、CK-2e、ALB、APOE、APOA1和MBD4,在B組的下調(diào)蛋白有9種,包括CFH、CP、原肌球蛋白α4鏈(tropomyosin alpha-4 chain,TPM4)等。

    表2 經(jīng)IFX治療的CD患者血清中的差異表達蛋白質(zhì)Table 2.Differentially expressed proteins in the serum of CD patients with IFX treatment

    4 蛋白質(zhì)功能網(wǎng)絡(luò)分析

    分別繪制得A-B之間和B-D之間差異表達蛋白相互作用的功能網(wǎng)絡(luò)圖,其中涉及APOA1以及周邊共12種蛋白的相互關(guān)系。不同顏色的線段表示不同類型的證據(jù),見圖3。

    討 論

    CD的發(fā)病與遺傳、環(huán)境及腸道菌群有關(guān)[5],系腸黏膜的慢性全層性炎癥。既往采用5-氨基水楊酸(5-ASA)、激素及免疫抑制劑治療,盡管臨床癥狀好轉(zhuǎn),但腸道炎癥仍然持續(xù),住院率及手術(shù)率高。1998年開始采用IFX治療CD。IFX促腸道黏膜的愈合,MH的獲得可以減少手術(shù)率和住院率,從而改變CD的自然病程。然而,IFX治療僅使約30%的患者獲得MH[6],而且價格十分昂貴。因此,治療前如果能預(yù)測其MH,就有望解決目前臨床的需求。

    本研究在國內(nèi)首次運用蛋白質(zhì)組學(xué)探究與IFX治療CD獲得MH可能相關(guān)的蛋白質(zhì)。2D-DIGE圖像提示IFX的應(yīng)用改變了CD患者的血清蛋白質(zhì)表達圖譜,MALDI-TOF/TOF-MS鑒定得19種差異表達的蛋白質(zhì)。

    CFH、CP、TPM4、補體因子 B(complement factor B,CFB)、α1-抗胰糜蛋白酶(alpha-1-antichymotrypsin,ACT)、HP、MAGUK p55 亞家族成員 3(MAGUK p55 subfamily member 3,MPP3)和鋅指蛋白268(zinc finger protein 268,ZNF268)這8種蛋白質(zhì)在A-B比較及B-D比較中均為B組下調(diào)表達,這些蛋白質(zhì)可能與黏膜炎癥相關(guān),下調(diào)表達提示 MH。CK-2e、ALB、APOE、APOA1和 MBD4這5種蛋白質(zhì)在 A-B比較及B-D比較中均為在B組上調(diào)表達,可能與炎癥抑制和黏膜修復(fù)相關(guān),上調(diào)表達提示MH。此外,SERPINA1和補體C4A在A-B比較中表現(xiàn)為B組下調(diào)表達,A2M僅表現(xiàn)為B組較D組上調(diào)表達,血清淀粉樣 P成分(serum amyloid P-component,SAP)僅表現(xiàn)為D組較B組上調(diào)表達,MAGOH蛋白在A-B比較及A-C比較中均為在A組上調(diào)表達,CEP57L1蛋白則不論MH與否均呈現(xiàn)在治療后上調(diào)表達。

    Figure 3.The networks of proteins differentially expressed between A-B(left)and B-D(right).C4A:complement C4-A;CFB:complement factor B;HP:haptoglobin;CP:ceruloplasmin;HPX:hemopexin;APOA1:apolipoprotein A-I;APOE:apolipoprotein E;ALB:albumin;CFH:complement factor H;SERPINA1:α-1-antitrypsin;APCS:serum amyloid P-component;A2M:α-2-macroglobulin.圖3 A-B、B-D組間差異表達蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀功能圖

    從功能網(wǎng)絡(luò)圖中可以看到APOA1與周邊蛋白的相互作用,2D-DIGE顯示其表達水平在IFX治療獲得MH組上調(diào);同家族APOE的表達水平也呈現(xiàn)相同趨勢的變化。既往研究報道過兒童CD患者脂蛋白的組成發(fā)生變化[7]。Takeuchi等[8]曾對接受IFX治療的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者的研究中發(fā)現(xiàn)血清APOA1在治療后上調(diào)。近年Serada等[9]運用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),對自身免疫性疾病患者接受IFX治療前后血清分析發(fā)現(xiàn)IFX治療前載脂蛋白家族水平明顯低于治療后12 周,包括 APOE、APOA1、APOA2、APOM 等。Haber man等[10]通過對共359例未接受治療的兒童 CD、UC患者以及健康人的核心基因表達譜及微生物群落比較,發(fā)現(xiàn)CD患者2個基因(DUOX2和APOA1)的表達發(fā)生了改變。DUOX2上調(diào)表達和APOA1下調(diào)表達促進氧化應(yīng)激和Th1細胞極化,腸道黏膜病變更嚴重的患者中變化更顯著。本研究與以上研究結(jié)果相符,載脂蛋白表達水平上調(diào)可能提示經(jīng)IFX治療后較輕的疾病狀態(tài)。然而,希臘Gazouli等[11]的研究卻顯示原發(fā)性無應(yīng)答或部分應(yīng)答的CD患者中,APOA1和APOE所對應(yīng)的蛋白質(zhì)斑點表達上調(diào),而緩解組中APOA1和APOE無明顯變化。不一致的研究結(jié)果可能與納入研究對象的年齡、病程、判斷療效時間點的不同有關(guān)。APOE在其它炎癥性疾病的血清中表達亦發(fā)生變化[12],脂類代謝與炎癥反應(yīng)以及IFX治療效果的關(guān)系值得進一步研究。

    綜上所述,這項研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),發(fā)現(xiàn)獲得MH者與未獲得MH者血清蛋白質(zhì)存在19種蛋白質(zhì)表達差異,為下一步篩選預(yù)測MH的生物標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。

    [1] Zeng Z,Zhu Z,Yang Y,et al.Incidence and clinical characteristics of inflammatory bowel disease in a developed region of Guangdong Province,China:a prospective population-based study[J]. J Gastroenterol Hepatol,2013,28(7):1148-1153.

    [2] Schnitzler F,F(xiàn)idder H,F(xiàn)errante M,et al.Mucosal healing predicts long-term outcome of maintenance therapy with infliximab in Crohn’s disease[J].Inflamm Bowel Dis,2009,15(9):1295-1301.

    [3] 中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病學(xué)組.炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)[J].中華內(nèi)科雜志,2012,51(10):818-831.

    [4] Hebuterne X,Lemann M,Bouhnik Y,et al.Endoscopic improvement of mucosal lesions in patients with moderate to severe ileocolonic Crohn’s disease following treatment with certolizumab pegol[J].Gut,2013,62(2):201-208.

    [5] Renz H,von Mutius E,Brandtzaeg P,et al.Gene-environment interactions in chronic inflammatory disease[J].Nat Immunol,2011,12(4):273-277.

    [6] Colombel JF,Sandborn WJ,Reinisch W,et al.Infliximab,azathioprine,or combination therapy for Crohn’s disease[J].N Engl J Med,2010,362(15):1383-1395.

    [7] Levy E,Rizwan Y,Thibault L,et al.Altered lipid profile,lipoprotein composition,and oxidant and antioxidant status in pediatric Crohn disease[J].Am J Clin Nutr,2000,71(3):807-815.

    [8] Takeuchi T,Nakanishi T,Tabushi Y,et al.Serum protein profile of rheumatoid arthritis treated with anti-TNF therapy(infliximab)[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2007,855(1):66-70.

    [9] Serada S,F(xiàn)ujimoto M,Ogata A,et al.iTRAQ-based proteomic identification of leucine-rich alpha-2 glycoprotein as a novel inflammatory biomarker in autoimmune diseases[J].Ann Rheum Dis,2010,69(4):770-774.

    [10] Haberman Y,Tickle TL,Dexheimer PJ,et al.Pediatric Crohn disease patients exhibit specific ileal transcriptome and microbiome signature[J].J Clin Invest,2014,124(8):3617-3633.

    [11] Gazouli M,Anagnostopoulos AK,Papadopoulou A,et al.Serum protein profile of Crohn’s disease treated with infliximab[J].J Crohns Colitis,2013,7(10):e461-e470.

    [12]曾 花,蔡道章,陳郁鮮,等.人膝骨關(guān)節(jié)炎血清生物學(xué)標(biāo)志物的篩選[J].中國病理生理雜志,2012,28(5):884-888.

    猜你喜歡
    斑點凝膠蛋白質(zhì)
    可可愛愛斑點湖
    大自然探索(2024年1期)2024-02-29 09:10:30
    可愛的小斑點
    蛋白質(zhì)自由
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:48
    人工智能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)
    海外星云(2021年9期)2021-10-14 07:26:10
    斑點豹
    纖維素氣凝膠的制備與應(yīng)用研究進展
    超輕航天材料——氣凝膠
    軍事文摘(2020年20期)2020-11-16 00:31:56
    保暖神器——氣凝膠外套
    “凍結(jié)的煙”——氣凝膠
    豬身上起紅斑點怎么辦?
    99久久99久久久精品蜜桃| 99香蕉大伊视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产一区有黄有色的免费视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 美女国产高潮福利片在线看| 老司机亚洲免费影院| 亚洲国产欧美网| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久久精品94久久精品| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | av免费在线观看网站| 国产成人精品久久二区二区免费| 免费在线观看日本一区| 一级毛片精品| 国产免费视频播放在线视频| 丁香六月欧美| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 不卡av一区二区三区| 我要看黄色一级片免费的| 又黄又粗又硬又大视频| 超碰成人久久| 欧美激情久久久久久爽电影 | 建设人人有责人人尽责人人享有的| 精品福利观看| 亚洲色图av天堂| 在线观看舔阴道视频| 久久精品国产综合久久久| 成人精品一区二区免费| 丁香六月欧美| 在线观看免费高清a一片| 欧美国产精品一级二级三级| 国产男女内射视频| 91麻豆av在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 日韩有码中文字幕| 最黄视频免费看| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产欧美日韩一区二区精品| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 日韩有码中文字幕| 99热国产这里只有精品6| 久久香蕉激情| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 黄色怎么调成土黄色| 久久久精品94久久精品| 日日夜夜操网爽| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日韩免费高清中文字幕av| 中文字幕高清在线视频| 咕卡用的链子| 99久久99久久久精品蜜桃| 美国免费a级毛片| 国产精品国产高清国产av | 午夜激情av网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品国产亚洲在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 在线观看免费午夜福利视频| 伦理电影免费视频| 久久青草综合色| 一级毛片电影观看| 精品少妇内射三级| 曰老女人黄片| 不卡一级毛片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久亚洲精品不卡| 午夜福利在线免费观看网站| 国产av又大| 成年人黄色毛片网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 99热网站在线观看| 久久久精品94久久精品| 又黄又粗又硬又大视频| 韩国精品一区二区三区| 91精品三级在线观看| 1024视频免费在线观看| 国产97色在线日韩免费| 天堂8中文在线网| 日日爽夜夜爽网站| 午夜日韩欧美国产| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 动漫黄色视频在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲,欧美精品.| 中文字幕人妻丝袜制服| 波多野结衣一区麻豆| 国产激情久久老熟女| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲五月色婷婷综合| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 日韩精品免费视频一区二区三区| 黄色视频,在线免费观看| 中亚洲国语对白在线视频| 最黄视频免费看| 多毛熟女@视频| 婷婷丁香在线五月| 色视频在线一区二区三区| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美日韩一级在线毛片| 狂野欧美激情性xxxx| svipshipincom国产片| svipshipincom国产片| 国产精品电影一区二区三区 | 日日夜夜操网爽| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产精品熟女久久久久浪| 大型黄色视频在线免费观看| 久久久精品免费免费高清| 黑丝袜美女国产一区| 色精品久久人妻99蜜桃| 最黄视频免费看| 在线av久久热| 最近最新中文字幕大全电影3 | 91老司机精品| 水蜜桃什么品种好| 高清av免费在线| 欧美精品av麻豆av| 高清在线国产一区| 高清在线国产一区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| av电影中文网址| 97人妻天天添夜夜摸| 婷婷成人精品国产| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 两个人免费观看高清视频| 岛国毛片在线播放| 香蕉丝袜av| 一级,二级,三级黄色视频| 人人妻人人澡人人看| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲精品国产色婷婷电影| 窝窝影院91人妻| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品亚洲一级av第二区| 男女午夜视频在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美乱妇无乱码| 亚洲一区二区三区欧美精品| 黑丝袜美女国产一区| 国产成人精品在线电影| 久久精品91无色码中文字幕| 精品久久蜜臀av无| 亚洲精品国产色婷婷电影| 香蕉久久夜色| 成人特级黄色片久久久久久久 | 久热这里只有精品99| 捣出白浆h1v1| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久国产精品人妻蜜桃| 一级毛片精品| 老司机亚洲免费影院| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 蜜桃国产av成人99| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久热这里只有精品99| 大陆偷拍与自拍| av网站免费在线观看视频| 国产精品偷伦视频观看了| 两性夫妻黄色片| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产亚洲欧美精品永久| 美女福利国产在线| www日本在线高清视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 丝袜喷水一区| 久久久久精品人妻al黑| 性色av乱码一区二区三区2| 中文欧美无线码| 美女扒开内裤让男人捅视频| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美精品啪啪一区二区三区| 黄色 视频免费看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲精品国产区一区二| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 成人免费观看视频高清| 母亲3免费完整高清在线观看| 午夜福利在线观看吧| 亚洲欧洲日产国产| av电影中文网址| 好男人电影高清在线观看| 黄片小视频在线播放| 人成视频在线观看免费观看| 人人妻人人澡人人看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| netflix在线观看网站| 欧美大码av| 国产成人免费观看mmmm| 国产av精品麻豆| 日韩大码丰满熟妇| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久人妻福利社区极品人妻图片| a级毛片黄视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美黑人精品巨大| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品亚洲av一区麻豆| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 中文字幕制服av| 国产伦理片在线播放av一区| 午夜福利在线观看吧| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 12—13女人毛片做爰片一| 日韩视频在线欧美| 黄色视频,在线免费观看| 波多野结衣一区麻豆| 午夜免费鲁丝| 国产精品98久久久久久宅男小说| 在线观看免费视频网站a站| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| e午夜精品久久久久久久| 成人精品一区二区免费| 欧美日韩亚洲高清精品| 蜜桃在线观看..| 精品福利永久在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 一级毛片女人18水好多| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产不卡一卡二| 满18在线观看网站| 免费不卡黄色视频| 在线观看免费高清a一片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久亚洲精品不卡| 视频在线观看一区二区三区| 黑人猛操日本美女一级片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 午夜视频精品福利| 国产三级黄色录像| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产亚洲精品一区二区www | 丁香欧美五月| 亚洲七黄色美女视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 午夜视频精品福利| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 窝窝影院91人妻| 亚洲专区中文字幕在线| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲人成电影免费在线| 成人影院久久| 亚洲精品在线美女| 亚洲久久久国产精品| 人人妻人人澡人人看| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久精品国产a三级三级三级| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产成人影院久久av| 国产高清国产精品国产三级| 国产亚洲av高清不卡| 日韩欧美三级三区| 国产精品偷伦视频观看了| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产精品九九99| 热99re8久久精品国产| 精品卡一卡二卡四卡免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 窝窝影院91人妻| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 两人在一起打扑克的视频| av电影中文网址| 国产在线观看jvid| av网站免费在线观看视频| av网站在线播放免费| 91九色精品人成在线观看| 午夜免费成人在线视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 视频区图区小说| 亚洲精品av麻豆狂野| 天堂俺去俺来也www色官网| 一二三四社区在线视频社区8| 日本一区二区免费在线视频| 窝窝影院91人妻| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 狂野欧美激情性xxxx| 久热爱精品视频在线9| 宅男免费午夜| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 黄频高清免费视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| av在线播放免费不卡| 国产精品偷伦视频观看了| 国产成人免费无遮挡视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 啦啦啦 在线观看视频| 99热网站在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 最近最新免费中文字幕在线| 高潮久久久久久久久久久不卡| 美女视频免费永久观看网站| 国产精品.久久久| 亚洲免费av在线视频| 激情在线观看视频在线高清 | 黄片小视频在线播放| 精品熟女少妇八av免费久了| 窝窝影院91人妻| 久久久国产一区二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 免费观看人在逋| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产xxxxx性猛交| 日本av免费视频播放| 香蕉久久夜色| 国产真人三级小视频在线观看| 1024视频免费在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久久久网色| 在线观看人妻少妇| 久久亚洲真实| 黄色丝袜av网址大全| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产午夜精品久久久久久| 国产单亲对白刺激| 国产视频一区二区在线看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产免费视频播放在线视频| 日本黄色视频三级网站网址 | 国产片内射在线| 国产成+人综合+亚洲专区| 精品亚洲成国产av| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲avbb在线观看| 丰满少妇做爰视频| 咕卡用的链子| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 成年人午夜在线观看视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久久久国内视频| 91大片在线观看| 久久久久久久国产电影| 黄频高清免费视频| 午夜久久久在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲av电影在线进入| 一级片'在线观看视频| 国产精品熟女久久久久浪| 深夜精品福利| 极品人妻少妇av视频| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲,欧美精品.| 国产精品偷伦视频观看了| 真人做人爱边吃奶动态| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲成国产人片在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 嫩草影视91久久| 欧美精品一区二区大全| 精品高清国产在线一区| 男女无遮挡免费网站观看| 最黄视频免费看| av电影中文网址| 精品少妇黑人巨大在线播放| 成人手机av| 国产在视频线精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲国产av新网站| 国产视频一区二区在线看| 国产成人精品在线电影| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日本五十路高清| 18在线观看网站| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲精品国产区一区二| 日本a在线网址| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 考比视频在线观看| 人人妻人人澡人人看| 午夜两性在线视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品福利观看| 大香蕉久久网| 高清在线国产一区| 午夜福利视频在线观看免费| 18在线观看网站| 欧美激情久久久久久爽电影 | 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 极品教师在线免费播放| 一级毛片电影观看| 中文字幕制服av| 在线看a的网站| xxxhd国产人妻xxx| 在线永久观看黄色视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲色图av天堂| 久久中文字幕人妻熟女| 啦啦啦中文免费视频观看日本| h视频一区二区三区| aaaaa片日本免费| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲精品自拍成人| 一本综合久久免费| 国产精品二区激情视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 免费看a级黄色片| 大香蕉久久成人网| 丝瓜视频免费看黄片| 搡老熟女国产l中国老女人| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一个人免费看片子| 亚洲人成伊人成综合网2020| 在线观看www视频免费| 久久99一区二区三区| 在线观看舔阴道视频| 十八禁网站免费在线| 国产精品国产高清国产av | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲中文字幕日韩| 电影成人av| 在线 av 中文字幕| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲第一青青草原| 男女高潮啪啪啪动态图| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲国产av影院在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 老司机深夜福利视频在线观看| 极品教师在线免费播放| 色播在线永久视频| 国产精品.久久久| xxxhd国产人妻xxx| 日韩欧美三级三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 美女午夜性视频免费| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲熟女毛片儿| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 中文亚洲av片在线观看爽 | 美女主播在线视频| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精华国产精华精| 精品福利观看| 满18在线观看网站| 热99国产精品久久久久久7| 大陆偷拍与自拍| 国产精品一区二区在线观看99| www.熟女人妻精品国产| 日韩视频在线欧美| 色综合欧美亚洲国产小说| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲天堂av无毛| 在线观看免费视频日本深夜| 一级片免费观看大全| 久久九九热精品免费| 亚洲色图av天堂| 69av精品久久久久久 | 午夜福利,免费看| 黄片播放在线免费| 宅男免费午夜| 黄色丝袜av网址大全| 国产主播在线观看一区二区| 国产激情久久老熟女| 美女午夜性视频免费| av又黄又爽大尺度在线免费看| 丁香欧美五月| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲精品在线美女| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一二三四在线观看免费中文在| 久久精品91无色码中文字幕| 国产精品一区二区精品视频观看| 啦啦啦 在线观看视频| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 久久中文字幕一级| 亚洲中文日韩欧美视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| aaaaa片日本免费| 丝袜在线中文字幕| 国产黄色免费在线视频| 怎么达到女性高潮| 国产av一区二区精品久久| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久狼人影院| 国产亚洲欧美精品永久| 搡老岳熟女国产| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产又爽黄色视频| 大片电影免费在线观看免费| 国产在线观看jvid| 成人三级做爰电影| 国产淫语在线视频| 午夜成年电影在线免费观看| 久久狼人影院| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲国产看品久久| 国产精品免费大片| 精品人妻在线不人妻| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 丁香六月天网| 十分钟在线观看高清视频www| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲国产av新网站| 97在线人人人人妻| 桃花免费在线播放| 国产亚洲精品第一综合不卡| 女人精品久久久久毛片| 韩国精品一区二区三区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 免费看a级黄色片| 一本色道久久久久久精品综合| 国产一区有黄有色的免费视频| 精品国产一区二区久久| videos熟女内射| 大码成人一级视频| 两个人免费观看高清视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 99国产精品免费福利视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产男女超爽视频在线观看| 超碰成人久久| 天天操日日干夜夜撸| 又紧又爽又黄一区二区| 1024视频免费在线观看| 亚洲精品在线美女| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 自线自在国产av| 国产一区二区在线观看av| 国产成人系列免费观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 精品少妇黑人巨大在线播放| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 黑丝袜美女国产一区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 水蜜桃什么品种好| 99riav亚洲国产免费| 妹子高潮喷水视频| 日本一区二区免费在线视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 成人国语在线视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 最近最新中文字幕大全电影3 | 免费在线观看日本一区| 十八禁网站免费在线| 黄色毛片三级朝国网站| 极品教师在线免费播放| 欧美精品啪啪一区二区三区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产一区二区三区视频了| 99久久国产精品久久久| 91成人精品电影| 人妻久久中文字幕网| 欧美午夜高清在线| 亚洲色图综合在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产欧美日韩一区二区精品| av天堂在线播放| 狂野欧美激情性xxxx| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久人妻av系列| 一个人免费在线观看的高清视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产成人影院久久av| 日韩免费av在线播放| 国产97色在线日韩免费| 国产不卡一卡二| 伦理电影免费视频| 亚洲熟妇熟女久久| 一区二区三区乱码不卡18| 天天操日日干夜夜撸| 欧美日韩黄片免| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年|