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    英夫利西單抗治療克羅恩病黏膜愈合的血清差異蛋白質(zhì)表達研究*

    2015-11-08 02:28:14廖詩樂陳白莉胡坤華饒佩斯黎明濤陳旻湖曾志榮
    中國病理生理雜志 2015年5期
    關(guān)鍵詞:斑點凝膠蛋白質(zhì)

    廖詩樂, 陳白莉, 胡坤華, 饒佩斯, 何 瑤, 黎明濤, 陳旻湖, 曾志榮△

    克羅恩病(Crohn’s disease,CD)在我國日益多見[1]。英夫利西單抗(infliximab,IFX)是目前唯一能改變CD自然病程的藥物,其主要作用是可以誘導(dǎo)獲得黏膜愈合(mucosal healing,MH),MH的CD患者住院率及手術(shù)率降低[2]。然而,IFX價格昂貴,如何能在治療前明確哪些患者經(jīng)IFX治療能達到MH,將具有明顯的經(jīng)濟效益比。基于此,本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析IFX獲得MH和未獲得MH患者血清蛋白表達的差異,為將來篩選預(yù)測的生物標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。

    材料和方法

    1 研究對象

    2012年9月~2013年9月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases,IBD)中心確診的CD患者共14例。診斷標(biāo)準采取我國的共識意見[3]?;颊呓o予 IFX 5 mg/kg,第 0、2 、6、14 周靜脈滴注給藥。于第10周復(fù)查腸鏡,根據(jù)克羅恩病內(nèi)鏡嚴重程度指數(shù)(Crohn’s disease endoscopic index of severity,CDEIS)情況,將病人分為MH和黏膜未愈(non-MH)。MH定義為內(nèi)鏡下未見潰瘍和(或)CDEIS評分<3分,non-MH定義為內(nèi)鏡下無應(yīng)答,即CDEIS評分較前下降<5分,潰瘍?nèi)匀淮嬖冢?]。采集7例MH患者治療前0周(A組)和治療后14周(B組)的靜脈血以及7例non-MH的CD患者0周(C組)和14周(D組)的靜脈血3 mL,4℃冰箱放置4 h,以3 000×g離心10 min,取上清樣本凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

    2 主要方法

    2.1 血清樣本處理 去除大部分高豐度清蛋白、IgG和純化、定量蛋白。然后按說明書,每400 pmol的Dye熒光染料標(biāo)記50 μg的蛋白質(zhì),Cy2標(biāo)記內(nèi)參照。采取混合樣本策略以消除個體差異,Cy3和Cy5交叉標(biāo)記樣本,以消除不同熒光染料染色效力的誤差。A、B、C、D各組血清均在相同條件下重復(fù)4次。2.2 雙向差異凝膠電泳 (2D-DIGE) 上樣至固相pH值干膠條(IPGstrip pH 4~7,24 cm),對血清樣品進行第1向等電聚焦(isoelectric focusing,IEF)電泳。IEF后,將完成平衡的IPG膠條放置于12.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel,SDS-PAG)上緣,進行第 2向SDS-PAG電泳至溴酚藍達凝膠下緣。

    2.3 2D-DIGE圖像分析 使用 Typhoon Scanner Control 5.0掃描儀軟件采集膠內(nèi)蛋白差異圖像,采用DeCyder 6.0軟件對圖像進行自動分析,選取表達差異大于1.5倍、t檢驗P<0.05的斑點作為差異表達蛋白質(zhì)斑點行進一步質(zhì)譜鑒定。

    2.4 差異蛋白的MALDI-TOF/TOF-MS鑒定 Ettan全自動凝膠斑點處理工作站進行蛋白質(zhì)斑點的切取、脫色、干燥、酶解。使用 Ultraflex III質(zhì)譜儀(Bruker)對酶解液進行MALDI-TOF/TOF-MS分析,得到各斑點的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting,PMF)和串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry,MS/MS)。使用Biotools軟件,以MASCOT(Matrix Science)為搜索引擎,在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中檢索所獲的圖譜。

    3 繪制STRING網(wǎng)絡(luò)功能圖

    在 STRING 數(shù)據(jù)庫(http://www.string-db.org)提交蛋白質(zhì)登記名,將所有差異表達的蛋白質(zhì)都納入功能網(wǎng)絡(luò)分析,研究差異表達蛋白質(zhì)所參與的路徑。

    4 統(tǒng)計學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析患者資料,正態(tài)分布的變量用均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示,非正態(tài)分布的資料用中位數(shù),極差(median,range)表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney U檢驗,治療前后比較采用配對t檢驗或Wilcoxon檢驗。分類變量比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 一般情況

    MH患者男性5例,女性2例,年齡(21.86±8.40)歲;non-MH患者男性4例,女性3例,年齡(19.14±5.90)歲。2組患者性別構(gòu)成比、年齡、病程、疾病部位、疾病行為、用藥史、腸外表現(xiàn)等臨床特征均無統(tǒng)計學(xué)差異。2組超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)和紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)在0周時均無顯著差異,治療后MH組上述指標(biāo)顯著低于non-MH組,也顯著低于MH組治療前0周的水平。CD活動指數(shù)(Crohn’s disease activity index,CDAI)在0 周時呈輕中度活動,2組無顯著差異;在14周時MH組達臨床緩解,與0周相比有顯著差異,且non-MH組與MH組相比有顯著差異。2組CDEIS評分在0周時無顯著差異,治療后存在顯著差異,見圖1、表1。

    Figure 1. Typical colonoscopic images.A:MH(0 week),CDEIS 22.4;B:MH(10 weeks),CDEIS 1.4;C:non-MH(0 week),CDEIS 18.6;D:non-MH(10 weeks),CDEIS 15.2.圖1 典型腸鏡圖像

    表1 患者的臨床資料Table 1.Clinical characteristics of CD patients with IFX therapy(n=7)

    2 凝膠圖像差異分析

    經(jīng)DeCyder 6.0軟件處理后Cy2、Cy3和Cy5染色在圖像中分別為藍色、綠色和紅色。經(jīng)DeCyder 6.0軟件分析檢測到1 505±177個蛋白質(zhì)斑點,獲得的凝膠間匹配率為72.0%±0.2%。以斑點平均體積差異大于1.5倍(表達差異上調(diào)或下調(diào)1.5倍),t檢驗P<0.05的蛋白質(zhì)點為有顯著差異的蛋白質(zhì)點,經(jīng)軟件統(tǒng)計分析,A組與B組之間、C組與D組之間、A組與C組之間以及B組與D組之間比較分別存在36、3、10和31個差異表達的蛋白質(zhì)斑點,共計發(fā)現(xiàn)44個顯著差異表達的蛋白質(zhì)斑點。顯著差異的蛋白斑點在2DDIGE凝膠上的具體位置見圖2。

    Figure 2.Merged image of 2D-DIGE.圖2 融合的2D-DIGE凝膠圖像

    3 質(zhì)譜分析結(jié)果

    差異表達的44個蛋白質(zhì)點進行MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜分析,以Mascot得分≥56分認為是可信結(jié)果,共鑒定出與27個差異點對應(yīng)的19種蛋白質(zhì),見表2。

    A組和B組比較鑒定出與25個差異點相對應(yīng)的17種差異蛋白質(zhì),其中在B組上調(diào)表達的蛋白有6種,包括中心體蛋白57 kD樣1(centrosomal protein 57kD-like 1,CEP57L1)、角蛋白 2e(keratin,type II cytoskeletal 2 epidermal,CK-2e)、白蛋白(albumin,ALB)、載脂蛋白 E(apolipoprotein E,APOE)、載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,APOA1)和甲基化CpG結(jié)合域蛋白 4(methyl-CpG-binding domain protein 4,MBD4),在B組下調(diào)表達的蛋白有11種,包括補體因子H(complement factor H,CFH)、銅藍蛋白(ceruloplasmin,CP)、α1-抗胰蛋白酶(alpha-1-antitrypsin,SERPINA1)等。

    C組和D組比較鑒定出與3個差異點對應(yīng)的2種差異蛋白質(zhì),CEP57L1和ALB均在D組上調(diào)表達;A組和C組比較鑒定出與2個差異點相對應(yīng)的2種差異蛋白,Mago-Nashi同源蛋白(Mago-Nashi homolog protein,MAGOH)在A組上調(diào)表達,觸珠蛋白(haptoglobin,HP)在A組下調(diào)表達;B組和D組比較鑒定出與21個差異點對應(yīng)的15種差異蛋白質(zhì),其中在B組上調(diào)表達的蛋白有6種,包括血清中α2-巨球蛋白(alpha-2-macroglobulin,A2M)、CK-2e、ALB、APOE、APOA1和MBD4,在B組的下調(diào)蛋白有9種,包括CFH、CP、原肌球蛋白α4鏈(tropomyosin alpha-4 chain,TPM4)等。

    表2 經(jīng)IFX治療的CD患者血清中的差異表達蛋白質(zhì)Table 2.Differentially expressed proteins in the serum of CD patients with IFX treatment

    4 蛋白質(zhì)功能網(wǎng)絡(luò)分析

    分別繪制得A-B之間和B-D之間差異表達蛋白相互作用的功能網(wǎng)絡(luò)圖,其中涉及APOA1以及周邊共12種蛋白的相互關(guān)系。不同顏色的線段表示不同類型的證據(jù),見圖3。

    討 論

    CD的發(fā)病與遺傳、環(huán)境及腸道菌群有關(guān)[5],系腸黏膜的慢性全層性炎癥。既往采用5-氨基水楊酸(5-ASA)、激素及免疫抑制劑治療,盡管臨床癥狀好轉(zhuǎn),但腸道炎癥仍然持續(xù),住院率及手術(shù)率高。1998年開始采用IFX治療CD。IFX促腸道黏膜的愈合,MH的獲得可以減少手術(shù)率和住院率,從而改變CD的自然病程。然而,IFX治療僅使約30%的患者獲得MH[6],而且價格十分昂貴。因此,治療前如果能預(yù)測其MH,就有望解決目前臨床的需求。

    本研究在國內(nèi)首次運用蛋白質(zhì)組學(xué)探究與IFX治療CD獲得MH可能相關(guān)的蛋白質(zhì)。2D-DIGE圖像提示IFX的應(yīng)用改變了CD患者的血清蛋白質(zhì)表達圖譜,MALDI-TOF/TOF-MS鑒定得19種差異表達的蛋白質(zhì)。

    CFH、CP、TPM4、補體因子 B(complement factor B,CFB)、α1-抗胰糜蛋白酶(alpha-1-antichymotrypsin,ACT)、HP、MAGUK p55 亞家族成員 3(MAGUK p55 subfamily member 3,MPP3)和鋅指蛋白268(zinc finger protein 268,ZNF268)這8種蛋白質(zhì)在A-B比較及B-D比較中均為B組下調(diào)表達,這些蛋白質(zhì)可能與黏膜炎癥相關(guān),下調(diào)表達提示 MH。CK-2e、ALB、APOE、APOA1和 MBD4這5種蛋白質(zhì)在 A-B比較及B-D比較中均為在B組上調(diào)表達,可能與炎癥抑制和黏膜修復(fù)相關(guān),上調(diào)表達提示MH。此外,SERPINA1和補體C4A在A-B比較中表現(xiàn)為B組下調(diào)表達,A2M僅表現(xiàn)為B組較D組上調(diào)表達,血清淀粉樣 P成分(serum amyloid P-component,SAP)僅表現(xiàn)為D組較B組上調(diào)表達,MAGOH蛋白在A-B比較及A-C比較中均為在A組上調(diào)表達,CEP57L1蛋白則不論MH與否均呈現(xiàn)在治療后上調(diào)表達。

    Figure 3.The networks of proteins differentially expressed between A-B(left)and B-D(right).C4A:complement C4-A;CFB:complement factor B;HP:haptoglobin;CP:ceruloplasmin;HPX:hemopexin;APOA1:apolipoprotein A-I;APOE:apolipoprotein E;ALB:albumin;CFH:complement factor H;SERPINA1:α-1-antitrypsin;APCS:serum amyloid P-component;A2M:α-2-macroglobulin.圖3 A-B、B-D組間差異表達蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀功能圖

    從功能網(wǎng)絡(luò)圖中可以看到APOA1與周邊蛋白的相互作用,2D-DIGE顯示其表達水平在IFX治療獲得MH組上調(diào);同家族APOE的表達水平也呈現(xiàn)相同趨勢的變化。既往研究報道過兒童CD患者脂蛋白的組成發(fā)生變化[7]。Takeuchi等[8]曾對接受IFX治療的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者的研究中發(fā)現(xiàn)血清APOA1在治療后上調(diào)。近年Serada等[9]運用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),對自身免疫性疾病患者接受IFX治療前后血清分析發(fā)現(xiàn)IFX治療前載脂蛋白家族水平明顯低于治療后12 周,包括 APOE、APOA1、APOA2、APOM 等。Haber man等[10]通過對共359例未接受治療的兒童 CD、UC患者以及健康人的核心基因表達譜及微生物群落比較,發(fā)現(xiàn)CD患者2個基因(DUOX2和APOA1)的表達發(fā)生了改變。DUOX2上調(diào)表達和APOA1下調(diào)表達促進氧化應(yīng)激和Th1細胞極化,腸道黏膜病變更嚴重的患者中變化更顯著。本研究與以上研究結(jié)果相符,載脂蛋白表達水平上調(diào)可能提示經(jīng)IFX治療后較輕的疾病狀態(tài)。然而,希臘Gazouli等[11]的研究卻顯示原發(fā)性無應(yīng)答或部分應(yīng)答的CD患者中,APOA1和APOE所對應(yīng)的蛋白質(zhì)斑點表達上調(diào),而緩解組中APOA1和APOE無明顯變化。不一致的研究結(jié)果可能與納入研究對象的年齡、病程、判斷療效時間點的不同有關(guān)。APOE在其它炎癥性疾病的血清中表達亦發(fā)生變化[12],脂類代謝與炎癥反應(yīng)以及IFX治療效果的關(guān)系值得進一步研究。

    綜上所述,這項研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),發(fā)現(xiàn)獲得MH者與未獲得MH者血清蛋白質(zhì)存在19種蛋白質(zhì)表達差異,為下一步篩選預(yù)測MH的生物標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。

    [1] Zeng Z,Zhu Z,Yang Y,et al.Incidence and clinical characteristics of inflammatory bowel disease in a developed region of Guangdong Province,China:a prospective population-based study[J]. J Gastroenterol Hepatol,2013,28(7):1148-1153.

    [2] Schnitzler F,F(xiàn)idder H,F(xiàn)errante M,et al.Mucosal healing predicts long-term outcome of maintenance therapy with infliximab in Crohn’s disease[J].Inflamm Bowel Dis,2009,15(9):1295-1301.

    [3] 中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病學(xué)組.炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)[J].中華內(nèi)科雜志,2012,51(10):818-831.

    [4] Hebuterne X,Lemann M,Bouhnik Y,et al.Endoscopic improvement of mucosal lesions in patients with moderate to severe ileocolonic Crohn’s disease following treatment with certolizumab pegol[J].Gut,2013,62(2):201-208.

    [5] Renz H,von Mutius E,Brandtzaeg P,et al.Gene-environment interactions in chronic inflammatory disease[J].Nat Immunol,2011,12(4):273-277.

    [6] Colombel JF,Sandborn WJ,Reinisch W,et al.Infliximab,azathioprine,or combination therapy for Crohn’s disease[J].N Engl J Med,2010,362(15):1383-1395.

    [7] Levy E,Rizwan Y,Thibault L,et al.Altered lipid profile,lipoprotein composition,and oxidant and antioxidant status in pediatric Crohn disease[J].Am J Clin Nutr,2000,71(3):807-815.

    [8] Takeuchi T,Nakanishi T,Tabushi Y,et al.Serum protein profile of rheumatoid arthritis treated with anti-TNF therapy(infliximab)[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2007,855(1):66-70.

    [9] Serada S,F(xiàn)ujimoto M,Ogata A,et al.iTRAQ-based proteomic identification of leucine-rich alpha-2 glycoprotein as a novel inflammatory biomarker in autoimmune diseases[J].Ann Rheum Dis,2010,69(4):770-774.

    [10] Haberman Y,Tickle TL,Dexheimer PJ,et al.Pediatric Crohn disease patients exhibit specific ileal transcriptome and microbiome signature[J].J Clin Invest,2014,124(8):3617-3633.

    [11] Gazouli M,Anagnostopoulos AK,Papadopoulou A,et al.Serum protein profile of Crohn’s disease treated with infliximab[J].J Crohns Colitis,2013,7(10):e461-e470.

    [12]曾 花,蔡道章,陳郁鮮,等.人膝骨關(guān)節(jié)炎血清生物學(xué)標(biāo)志物的篩選[J].中國病理生理雜志,2012,28(5):884-888.

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