慢性皮質(zhì)酮注射對小鼠抑郁樣行為及腦糖原水平的影響*

張繪宇， 趙玉男， 王中立

抑郁癥(depression)是一種以顯著而持久的心境低落為主要臨床表現(xiàn)的情感障礙性疾病，其發(fā)病率隨著人們生活水平的提高、工作生活壓力的增加呈逐年上升趨勢。到2020年可能成為僅次于心臟病的第2大疾患。大量的臨床資料顯示當(dāng)機體受到長期強烈身心應(yīng)激刺激時，神經(jīng)內(nèi)分泌活動增強，表現(xiàn)為下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary bodyadrenal gland，HPA)軸的功能亢進(jìn)，糖皮質(zhì)激素水平急劇升高。抑郁癥患者皮質(zhì)醇水平增高，使患者產(chǎn)生認(rèn)知功能障礙和情感障礙［1］。在嚙齒類動物，長期皮下注射皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)可誘導(dǎo)出抑郁樣行為［2］，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性指標(biāo)突觸素(synaptophysin，SYP)表達(dá)下調(diào)［3］，海馬 CA3 區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)降低［4］，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙［5］。這可能是長期CORT注射誘導(dǎo)了抑郁樣行為。然而，神經(jīng)元功能障礙的機制尚不清楚。

目前的研究結(jié)果表明，神經(jīng)元的活動所需能量依賴于腦糖原。腦糖原是非常重要的腦能量儲備。腦糖原不僅為星形膠質(zhì)細(xì)胞的生存和功能提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，還為神經(jīng)元的活動和生存提供能量［6］，腦糖原是神經(jīng)元活動的主要能量來源。因此腦糖原代謝異?？赡苁菓?yīng)激致海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性損傷的早期重要環(huán)節(jié)。為了進(jìn)一步闡明抑郁樣行為的發(fā)病機制，本研究采用慢性應(yīng)激抑郁模型，從而探討慢性皮質(zhì)酮注射對腦糖原水平的影響。

材料和方法

1 實驗動物、藥品與試劑

健康成年雄性ICR級C57BL/6N小鼠，體重在18～20 g之間，購于揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號為SCXK(蘇)2012-0004。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)溫度為(25±1)℃，標(biāo)準(zhǔn)的12 h等分動物房(光照從早上6 h到下午6 h)，動物可以自由飲食進(jìn)水。被用于實驗和其它科學(xué)用途的脊椎動物根據(jù)中國動物保護(hù)公約制定飼養(yǎng)環(huán)境和實驗操作規(guī)則，動物實驗遵守國際實驗動物倫理學(xué)要求。

皮質(zhì)酮、淀粉葡萄糖苷酶、己糖激酶、尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸、1，6-二磷酸葡萄糖、腺嘌呤核糖核苷酸、葡萄糖磷酸變位酶、丙酮酸激酶均購自Sigma;腺嘌呤核苷三磷酸和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶購自Solarbio;乳酸脫氫酶購自 Generay;β-actin和SYP單克隆抗體、BDNF多克隆抗體購自Abcam;HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG購自Gene Script;其它試劑均為分析純，購自南京化學(xué)試劑公司。

2 方法

2.1 CORT注射誘導(dǎo)小鼠慢性應(yīng)激性抑郁模型 40只C57BL/6N小鼠均為雄性，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。動物隨機分為2組，每組10只，稱重。根據(jù)文獻(xiàn)［2］給予小鼠皮下注射CORT，制備慢性應(yīng)激性抑郁模型。模型組按20 mg·kg－1·d－1劑量給予皮下注射CORT混懸液(混懸液濃度為2 g/L)，對照組每天皮下注射相同劑量的溶劑，連續(xù)注射4周后稱量體重，進(jìn)行行為學(xué)測試。最后抽血檢測CORT并行Western blot、糖原及其酶的含量測定實驗。

2.2 小鼠強迫游泳實驗 強迫游泳實驗(forced swim test，F(xiàn)ST)采用上海吉量軟件科技有限公司的JLBehv-FSG-4型小鼠強迫游泳測試分析系統(tǒng)進(jìn)行測試，將小鼠分別放入加有15 cm水深的5 000 mL的大燒杯中(水溫25℃)，使小鼠強迫游泳6 min，計算機自動記錄小鼠在實驗后4 min內(nèi)累計不動時間。不動時間被界定為沒有主動逃脫行為，比如游泳、跳躍、躬起身體、探查和水下動作等。每只動物實驗后更換器皿內(nèi)的水以保持水的清潔，去除動物糞便及氣味的干擾。

2.3 小鼠曠場實驗 曠場實驗(open field test，OFT)采用上海吉量軟件科技有限公司的DigBehv動物行為分析系統(tǒng)進(jìn)行測試，將小鼠分別放入一個底部為直徑30 cm、高40 cm的開放場區(qū)域內(nèi)的底面中心，使用攝像機進(jìn)行記錄隨后6 min內(nèi)的小鼠自主活動情況，包括運動總路程、自主活動次數(shù)。每只小鼠測試結(jié)束后對箱底進(jìn)行清潔，去除動物糞便及氣味的干擾。

2.4 血清CORT的測定 1%戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠，采用心臟穿刺取血約0.8 mL，靜止30 min后以3 000 r/min離心15 min，收集血清備用。采用定量競爭酶聯(lián)免疫法測定血清CORT。在96孔板中先預(yù)涂多克隆CORT特異性抗體，分別加入標(biāo)準(zhǔn)的血清樣品25 μL和25 μL生物素標(biāo)記的CORT孵育2 h，沖洗后加入鏈霉親和素-過氧化物酶50 μL孵育30 min，顯色后采用波長450 nm的酶標(biāo)儀進(jìn)行讀板。每個標(biāo)準(zhǔn)血清和樣本均取3個復(fù)孔的平均值進(jìn)行計算，樣品濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測得。

2.5 Western blot實驗 取海馬組織100 mg加1 mL的組織裂解緩沖液，冰浴勻漿至組織完全裂解，10 000 r/min離心3 min，收集離心上清液。在95℃水浴中變性5 min。分裝放置－20℃?zhèn)溆?。制備好電泳膠后用微量加樣器將樣品加入各個泳道，經(jīng)10%SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜漂洗后浸于含5% 脫脂奶粉的25 mL PBST緩沖液中，37℃輕搖1 h以封閉膜上的非特異結(jié)合。浸入 PBST稀釋的 I抗［β-actin(1∶1 000)、SYP(1∶500)、BDNF(1∶200)］4 ℃ 靜置過夜。漂洗后加入HRP標(biāo)記的PBST稀釋的 II抗(1∶2 000)以結(jié)合I抗室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光、顯影，將膠片上目的條帶掃描進(jìn)電腦，用Bandscan軟件進(jìn)行灰度分析，以各樣本灰度值與內(nèi)參照β-actin灰度值的比值作為所測樣品中目的蛋白相對含量。

2.6 腦糖原測定 腦糖原檢測采用Kong等［7］報道的方法，將小鼠投入液氮中處死，取出后迅速剝離大腦，于液氮中把海馬組織研磨成粉后，用6%高氯酸勻漿滅活各代謝酶的活性。取適量勻漿液用2×104U/L淀粉葡萄糖苷酶10 μL室溫消化16 h，使糖原徹底分解成葡萄糖。加入6%高氯酸終止反應(yīng)離心取上清，用3 mol/L KOH溶液調(diào)節(jié)pH值，使pH=7。在96孔加樣板中加入200 μL的反應(yīng)體系，以355 nm激發(fā)、480 nm發(fā)射、420 nm的截止波長，采用螢光酶法測定葡萄糖的含量。加入0.3 U己糖激酶50 μL讀取總數(shù)值。同時，按上述操作不加淀粉葡萄糖苷酶，測出組織中所含的內(nèi)源性葡糖糖量，用總葡萄糖含量減去內(nèi)源性葡萄糖的含量，即為糖原分解所得到的葡萄糖。基于這個數(shù)值，從糖原含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可計算得出組織中糖原的含量。

2.7 糖原合酶檢測 在海馬組織中加入預(yù)冷勻漿液5 mL/g，在冰上徹底勻漿備用。在20 μL樣品中加入尿苷二磷酸葡萄糖反應(yīng)液50 μL，38℃水浴60 min。取出后加入10 μL反應(yīng)終止液，室溫下放置30 min。加入l mL尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸反應(yīng)液室溫放置20 min后，以激發(fā)光340 nm、發(fā)射光460 nm測定熒光吸光值。同時，按上述操作不加2 mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖和5 mmol/L 6-磷酸葡萄糖測出組織空白值，再用總糖原合酶熒光值減去組織空白熒光值，最終在尿苷二磷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對應(yīng)值。

2.8 糖原磷酸化酶檢測 在180 μL30℃和pH=6.8的磷酸鹽緩沖液中加入20 μL樣本勻漿液。加入2 g/L的糖原開始反應(yīng)。糖原被糖原磷酸化酶分解產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，再經(jīng)磷酸葡萄糖變位酶作用生成葡萄糖-6-磷酸，在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶反應(yīng)體系中，我們可通過測定 NADP(低吸收峰)轉(zhuǎn)化為NADPH(高吸收峰)，即在340 nm波長處所產(chǎn)生的吸光值的變化，來定量分析糖原磷酸化酶的特異活性。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間數(shù)據(jù)差異用t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 體重及行為學(xué)檢測結(jié)果

小鼠皮下注射CORT，4周后模型組的體重顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。在強迫游泳實驗中表現(xiàn)出不動時間顯著延長，出現(xiàn)抑郁樣行為特征。模型組小鼠強迫游泳的靜止時間較正常組明顯延長(P＜0.01)。在曠場實驗中表現(xiàn)動物的自發(fā)活動明顯減少，出現(xiàn)抑郁樣行為特征。模型組小鼠運動的總路程減少、活動次數(shù)明顯下降(P＜0.01)，見表 1。

表1 模型組與正常組小鼠體重及行為學(xué)檢測結(jié)果Table 1.The weight and behavior of mice in control and CORT group(Mean±SD.n=20)

2 皮質(zhì)酮檢測結(jié)果

實驗進(jìn)行4周后，與正常組小鼠相比，模型組小鼠血清的CORT水平顯著升高(P＜0.01)，見圖1。

Figure 1.Serum corticosterone levels in control and CORT-injected mice.Mean ±SD.n=10.＊＊P ＜0.01 vs control.圖1 正常組與模型組血清皮質(zhì)酮濃度的比較

3 神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白含量的變化

模型組的SYP和BDNF蛋白條帶密度顯著下降，與正常組相比，模型組小鼠海馬組織內(nèi)的2種蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P＜0.01)，見圖2。

4 腦糖原及其相關(guān)酶含量的變化

小鼠皮下注射CORT 4周后，型組與正常對照組相比，腦糖原和腦糖原合酶含量明顯降低(P＜0.05)。但模型組腦糖原磷酸化酶含量高于正常對照組(P ＜0.05)，見圖3。

討 論

Figure 2.The effects of CORT injection on the protein levels of SYP and BDNF in the mouse hippocampal tissues.Mean±SD.n=10.＊＊P ＜0.01 vs control.圖2 CORT注射對小鼠海馬組織內(nèi)SYP和BDNF蛋白表達(dá)的影響

Figure 3.The effects of CORT injection on the levels of brain glycogen，glycogen synthase and glycogen phosphorylase in the mouse hippocampal tissues.Mean±SD.n=10.*P ＜0.05 vs control.圖3 CORT注射對小鼠海馬組織糖原、糖原合酶和糖原磷酸化酶含量的影響

本實驗根據(jù)前期研究成果［2］連續(xù)4周小鼠皮下注射CORT后，采用計算機圖像實時分析檢測系統(tǒng)，動態(tài)分析動物的活動軌跡。慢性應(yīng)激組小鼠食欲減退，體重降低。在強迫游泳和曠場2個行為學(xué)實驗中，小鼠靜止不動的時間明顯延長，小鼠自主活動能力降低，反映小鼠的自主活動能力降低、情緒低落、興趣喪失、絕望狀態(tài)、認(rèn)知和記憶能力減退，與抑郁癥患者出現(xiàn)的情緒低落和易疲勞等癥狀相似。以上結(jié)果證明慢性皮質(zhì)酮注射成功誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為。在嚙齒類動物重復(fù)注射CORT已經(jīng)被認(rèn)為是一個可靠的研究慢性應(yīng)激性抑郁障礙的動物模型［8］。

Figure 4.A model for energy substrate supply pathways of the neuron.圖4 神經(jīng)元的能量底物供給途徑模型

SPY是位于突觸前膜囊泡上與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的鈣結(jié)合膜蛋白，參與突觸小泡膜與突觸前膜的融合和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，還參與了神經(jīng)元間信息傳遞。因此突觸素既是突觸發(fā)生的標(biāo)志，又是突觸傳遞效能的反映，其定量和定性分布可以準(zhǔn)確反映突觸的分布與密度［9］。Yau 等［10］發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)酮可以抑制神經(jīng)系統(tǒng)的形成，從而降低海馬樹突棘密度而引起空間學(xué)習(xí)障礙。本研究的數(shù)據(jù)表明，長期注射CORT，神經(jīng)系統(tǒng)突觸發(fā)生和成熟標(biāo)志性蛋白SYP的水平均明顯下降。提示CORT升高影響突觸的形成與成熟，突觸數(shù)目的減少與功能降低將影響神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞。

星形膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)元功能的維持至關(guān)重要，而其中最多的是BDNF。BDNF基因位于11q13，主要促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞生長、分化，維持神經(jīng)元生存，參與調(diào)控海馬神經(jīng)重塑，拮抗神經(jīng)元受損，并與長時程學(xué)習(xí)、記憶功能有關(guān)［11］。臨床尸檢研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者腦組織中BDNF水平顯著降低，抗抑郁劑治療后患者抑郁癥狀緩解，血清BDNF水平可恢復(fù)正常［12］，且經(jīng)過抗抑郁治療的患者腦組織中BDNF也恢復(fù)正常。BDNF下調(diào)可能降低神經(jīng)元可塑性而促進(jìn)神經(jīng)元死亡。有研究表明［13］，長期注射皮質(zhì)酮或慢性應(yīng)激能降低大鼠海馬BDNF表達(dá)，并且海馬區(qū)和前額區(qū)BDNF的mRNA水平下降，從而影響海馬結(jié)構(gòu)可塑性，誘導(dǎo)了抑郁樣行為，并且敲除動物齒狀回BDNF基因使其抑郁樣行為增加。Yu等［14］的研究表明，BDNF已被證明能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)，慢性應(yīng)激降低腦組織BDNF水平，使神經(jīng)樹突棘密度降低從而誘導(dǎo)了抑郁樣行為。近年來，動物模型和臨床研究均提示，海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF缺乏可能與抑郁發(fā)生密切相關(guān)。我們的研究驗證了這一結(jié)論，長期注射CORT損傷海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，下調(diào)小鼠海馬的BDNF表達(dá)，小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。

糖原由葡萄糖單位組成的具有高度分支結(jié)構(gòu)的大分子多糖，是人和動物體內(nèi)主要的葡萄糖儲存形式。當(dāng)機體需能增加而葡萄糖減少時，糖原可以迅速分解為葡萄糖或生成乳酸，為機體提供能量。腦糖原是非常重要的腦能量儲備，幾乎全部儲存在星形膠質(zhì)細(xì)胞中［15］，是神經(jīng)元活動的主要能量來源。腦糖原不均勻地分布在整個大腦，電子顯微鏡的研究表明，腦糖原集中的區(qū)域也是突觸密度最高的腦區(qū)，也許這意味著在突觸傳遞的能量依賴性［16］。由于神經(jīng)元對能量危機非常敏感，而神經(jīng)元的能量儲存又很有限，因此，糖原能量是正常神經(jīng)元的功能和生存的關(guān)鍵。神經(jīng)元的神經(jīng)能量底物有2個主要來源，一是血液循環(huán)中的葡萄糖直接供給，葡萄糖進(jìn)入神經(jīng)元后發(fā)生氧化代謝。除了葡萄糖直接進(jìn)入神經(jīng)元外，第2個來源是葡萄糖首先進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞，并以糖原的形式儲存起來，當(dāng)神經(jīng)元活動增加需要能量時，糖原可迅速分解代謝成乳酸，作為能量底物轉(zhuǎn)運給神經(jīng)元［17］(圖4)。神經(jīng)元的活性依賴于乳酸，為高效能的突觸傳遞提供能量需求。研究表明［18］在海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中糖原源性乳酸也是神經(jīng)元空間工作記憶的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，當(dāng)神經(jīng)元需求能量增加時，星形膠質(zhì)細(xì)胞存儲的糖原提供了一個充足的能量儲備。

因為腦糖原是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最大的能源儲備，星形膠質(zhì)細(xì)胞的糖原含量的變化可能會顯著影響大腦的能量代謝。糖原水平的減少會直接影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的代謝和功能。星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元起到重要的營養(yǎng)作用。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞本身的變化也會直接影響神經(jīng)元的代謝和功能。如果星形膠質(zhì)細(xì)胞不能及時為大腦提供糖原能量，將導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的萎縮和死亡。一旦中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的糖原含量減少，神經(jīng)遞質(zhì)和動作電位也會立即受到嚴(yán)重影響。因此，腦糖原的缺乏可以直接影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞萎縮，從而又會進(jìn)一步加重神經(jīng)元的能源危機，增加細(xì)胞凋亡的風(fēng)險，減少神經(jīng)元的興奮性，誘導(dǎo)抑郁樣行為。糖皮質(zhì)激素可以直接影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的糖原代謝，糖皮質(zhì)激素顯著降低的時候，可促進(jìn)糖原合成。體外培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究表明，皮質(zhì)酮可以顯著降低星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)糖原含量［19］。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，束縛應(yīng)激導(dǎo)致小鼠糖代謝紊亂，糖原含量降低［20］。我們的研究表明，與對照組相比小鼠長期注射CORT，海馬糖原含量顯著降低，從而降低了神經(jīng)元的興奮性，誘導(dǎo)了小鼠的抑郁樣行為。

動物實驗和組織細(xì)胞培養(yǎng)表明，糖原受多因素影響，包括葡萄糖、胰島素、神經(jīng)遞質(zhì)以及神經(jīng)元的激活等。腦糖原合成與降解受2個關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)，分別為糖原合酶和糖原磷酸化酶。葡萄糖合成糖原取決于糖原合酶和糖原分支酶的活性;降解發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，通過糖原磷酸化酶和分支酶的作用。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)慢性注射皮質(zhì)酮增加糖原磷酸化酶的活性，表明增加糖原分解。并且慢性注射皮質(zhì)酮降低糖原合酶活性，使糖原合成減少，結(jié)果使糖原含量下降。糖皮質(zhì)激素可抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運到神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，減少糖原合成。因此，慢性應(yīng)激可能是通過增加下丘腦-垂體-腎上腺活動的情況下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞的糖原儲存。海馬糖原水平的降低是因為糖原合酶的減少以及糖原磷酸化酶的增加。高濃度的糖皮質(zhì)激素作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞會損害糖原的補充，消耗的能量儲備，減少乳酸運輸，減少能量的供給，這將引起神經(jīng)元的功能障礙，從而引起抑郁樣行為。

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