人參皂苷Rg1通過調節(jié)脂肪代謝改善非酒精性脂肪肝病大鼠的肝功能*

彭璇，黃德斌，嚴米婭，彭世軍(湖北民族學院醫(yī)學院，恩施州中心醫(yī)院，湖北恩施445000)

人參皂苷Rg1通過調節(jié)脂肪代謝改善非酒精性脂肪肝病大鼠的肝功能*

彭璇1△，黃德斌1，嚴米婭1，彭世軍2
(1湖北民族學院醫(yī)學院，2恩施州中心醫(yī)院，湖北恩施445000)

目的:研究人參皂苷Rg1對高脂飲食(HFD)誘導的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠肝臟β-氧化的作用。方法:60只SD大鼠隨機分為對照組(CON)、HFD組、人參皂苷Rg1低、中、高劑量干預組(LDG、MDG及HDG)及陽性藥物熊去氧膽酸鈉治療組(PDT)。HFD 8周后成功復制NAFLD模型，之后用相應藥物治療，治療4周和8周后分別處死大鼠各半，收集肝臟做切片HE染色，同時檢測其肝功能和血脂指標，RT-PCR及Western blotting測定肝臟脂酰CoA合成酶1(CoASH1)、肉毒堿脂酰轉移酶I(CATI)及脂酰CoA氧化酶1(ACOX1)mRNA和蛋白的表達。結果:治療4周后，肝臟HE染色除HDG組有改善外，PDT組、LDG組及MDG組的脂肪肝浸潤現(xiàn)象沒有改善;治療8周后，PDT組與LDG組仍有少量脂肪顆粒聚集，而MDG組和HDG組則看不到脂滴浸潤現(xiàn)象;治療4周后，PDT組、LDG組、MDG組及HDG組與HFD組相比，肝功能指標AST、ALT、AKP以及血脂指標TC、TG、LDLC明顯降低(P＜0.05)，治療8周后進一步降低;治療4周后，4個治療組HDL-C均明顯升高，8周后幾乎恢復到CON組的水平;治療4周后4個治療組肝臟組織的CoASH1、CACTI及ACOX1表達均有顯著升高(P＜0.05)，治療8周后改善更為明顯，同時MDG組與HDG組表達要高于PDT組(P＜0.05)。結論:人參皂苷Rg1可通過調節(jié)大鼠β-氧化相關的酶改善脂肪代謝對NAFLD大鼠的肝損傷，從而發(fā)揮治療作用。

人參皂苷Rg1;非酒精性脂肪肝病;脂酰輔酶A合成酶1;肉毒堿脂酰轉移酶I;脂酰輔酶A氧化酶1

［ABSTRACT］AIM:To investigate whether ginsenoside Rg1 attenuates high-fat diet(HFD)-induced non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)by improvingβ-oxidation.METHODS:SD rats(n=60)were randomly divided into control group(CON)，HFD group，low-dose，medium-dose and high-dose ginsenoside Rg1 groups(LDG，MDG and HDG)and positive drug(sodium ursodeoxycholate)treatment group(PDT).High-fat dietwas given for 8 weeks to successfully establish an NAFLDmodel.The animalswere treated with the appropriatemedications for4 weeks and 8 weeks aftermodeling，and sacrificed to collect the liver tissues for observing the pathologic changeswith HE staining and for detecting liver functions and lipid levels.The expression of hepatic acyl-CoA synthetase 1(CoASH1)，carnitine acyltransferase I(CATI)and acyl-CoA oxidase 1(ACOX1)atmRNA and protein levels was determined by RT-PCR and Western blotting.RESULTS:After 4-week treatment，the fatty infiltration of the liver tissues in PDT group，LDG group and MDG group was not attenuated except HDG group.After 8 weeks of treatment，a small number of fat particles was observed in PDT group and LDG group，while no infiltration of lipid dropletwas found in MDG group and HDG group.Compared with HFD group，the levels of AST，ALT，AKP，TC，TG and LDL-Cwere significantly decreased after4-week treatment in PDT group，LDG group，MDG group and HDG group(P＜0.05)，these indexes were further reduced after 8-week treatment.After 4-week treatment，HDL-C was significantly increased in the 4 treatment groups and almost restored to the level ofCON group after 8-week treatment.The levels of CoASH1，CACTIand ACOX1 in the liver tissue of the 4 treatment groups were significantly increased after 4-week treatment(P＜0.05)and much improved after 8-week treatment，and those in MDG group and HDG group were better than those in PDT group(P＜0.05).CONCLUSION:Ginsenoside Rg1 regulates β-oxidation-related enzymes to improve the fatmetabolism，thus playing a therapeutic role in liver injury in the rats with NAFLD.

［KEY WORDS］Ginsenoside Rg1;Non-alcoholic fatty liver disease;Acyl-CoA synthetase 1;Carnitine acyltransferase I;Acyl-CoA oxidase 1

近年來隨著人們生活水平的提高以及飲食結構的改變，非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病率有逐年升高的趨勢。在我國城市地區(qū)，本病的發(fā)病率已經超過30%［1］，NAFLD在臨床上屬于一種沒有酒精及其它明確的肝臟損害因素所引起的一種肝臟脂代謝障礙型疾?。?］。本病疾病譜較廣，其包括由高脂飲食造成的單純性非酒精性脂肪肝病及后續(xù)發(fā)展形成的非酒精性脂肪肝炎、肝纖維化、肝硬化等［3］。人參皂苷Rg1為人參根部提取的一種單體活性物質［4］，有研究顯示人參皂苷Rg1具有促進海馬神經發(fā)生、增強學習、提高記憶力的作用［5］，同時其還有抗疲勞、輔助抗腫瘤、輔助治療糖尿病等［6］，但關于其是否可以改善NAFLD癥狀，國內外均鮮見研究報道［7］。

材料和方法

1動物、藥品與試劑

雄性SD大鼠60只，體重為160～180 g，大鼠、基礎飼料均由由湖北省實驗動物研究中心提供［生產許可證號為SCXK(鄂)2008-0005;使用許可證號為SCXK(鄂)2008-0014］;人參皂苷Rg1購于成都普菲德公司;豬油市場自購;膽固醇及膽酸鈉購自上海金穗生物公司;熊去氧膽酸鈉購于恩施州中心醫(yī)院藥房;總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、堿性磷酸酶(alkali phosphatase，AKP)等ELISA試劑盒購自Bio-Swamp;總RNA提取試劑盒購自上海寶曼生物科技有限公司;引物為上海生工生物股份有限公司設計;2× Master PCR Mix購于MBIFermentas;瓊脂糖購自Invitrogen;多克隆抗體肝臟脂酰CoA合成酶1(acyl-CoA synthetase 1，CoASH1)、肉毒堿脂酰轉移酶I (carnitine acyltransferase I，CATI)和脂酰CoA氧化酶1(acyl-CoA oxidase 1，ACOX1)、單克隆抗體β-actin以及ECL發(fā)光試劑盒購自Santa Cruz;相應羊抗鼠II抗購于中杉金橋公司。

2方法

2.1大鼠造模方法參考國際上通用的NAFLD造模飼料配方［8］配制大鼠高脂飼料，具體為20%的豬油、2%膽固醇與0.5%膽酸鈉加77.5%的常規(guī)飼料配成100%高脂飼料，大鼠由其自由飲食，時間為8周，之后取肝臟行病理學HE染色檢查，觀察是否造模成功。

2.2非酒精性脂肪肝模型的建立及給藥方法將60只SD大鼠隨機分為對照組(control，CON)、高脂飲食組(high-fat diet，HFD)、人參皂苷Rg1低、中、高劑量干預組(LDG、MDG、HDG)及陽性藥物熊去氧膽酸鈉治療組(positive drug treatment，PDT)，每組分別為10只。造模成功后CON組及HFD組均以生理鹽水灌胃作為對照;LDG組、MDG組和HDG組分別灌胃人參皂苷Rg1針劑5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/ kg進行治療，連續(xù)灌胃8周，每日1次;PDT組經灌胃熊去氧膽酸鈉針劑10 mg/kg進行治療，連續(xù)灌胃8周，每日1次。

2.3標本采集處死大鼠前，手術臺進行嚴格消毒，所有操作人員要求戴手套及口罩，之后按不同組別稱取大鼠體重、3%水合氯醛腹腔內注射3mL麻醉大鼠;大鼠在麻醉后立即綁定在解剖板上;暴露腹腔迅速取出肝臟，之后用10mL注射器心臟心尖處緩慢抽血;取出血液后4 000 r/min離心，收集血清，最后將血清和肝臟置于－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4病理學檢查方法取出肝臟500 mg，用4%中性福爾馬林浸泡24 h，之后取出用乙醇作為脫水劑從低濃度到高濃度緩慢給予肝臟組織脫水，脫水后消除組織中殘余水分，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟病理學改變。

2.5生化指標檢測方法總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白的測定方法為酶法，天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶及堿性磷酸酶測試方法為雙抗體夾心法。

2.6RT-PCR檢測mRNA的表達從低溫冰箱中取出肝臟組織，用微量天平稱取30 mg，稱取后立即用總RNA提取試劑盒提取總RNA，提取總RNA后立即定量，定量后每組各取2μg逆轉錄cDNA，其余總RNA置于超低溫冰箱保存，用逆轉錄試劑盒提供的配置液行PCR反應擴增，PCR擴增的條件完全按照引物說明書進行，目的片段擴增后在110 V、1μL GeneFinder以及1.6%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，電泳完成后用凝膠成像儀拍照收集條帶圖像，采集圖像后用ImageJ計算各條帶熒光值，全部實驗均用βactin作內參照，每組實驗重復3次。

β-actin的上游引物為5’-GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3’，下游引物為5’-ACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGTGG-3’，產物長度為123 bp; CoASH1的上游引物為5’-CTTCGGTCGTGATGAAAGGA-3’，下游引物為5’-ATAGCTGACGGTTGCCGTAC-3’，產物長度為158 bp;CATI的上游引物為5’-CTTGCATGGCTGTGAGAAGA-3’，下游引物為5’-AGTCGGACTGCCTTCAGTGA-3’，產物長度為188 bp。ACOX1的上游引物為5’-GTTACGTGGCGCATTGAAGA-3’，下游引物為5’-TAGTTCCTCGCGGGAACGAT-3’，產物長度為169 bp。

2.7Western blotting檢測蛋白表達稱取肝臟組織100 mg，稱重后立即放入組織裂解液，電動勻漿機制作勻漿，勻漿液磨好后，4 000 r/min離心，收集上清液，BCA法定量，定量后取各樣本60μg進行SDSPAGE，其余流程均按照常規(guī)方法操作，暗室內與ECL發(fā)光試劑反應，曝光洗片，掃描圖像后用ImageJ計算各條帶熒光值，全部試驗均用β-actin(1∶800)作內參照，羊抗鼠II抗?jié)舛葹?∶2 000。每組實驗重復3次。

3統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)處理分析均用SPSS 19.0軟件，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間計量資料比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1肝臟切片的HE染色觀察

肝臟切片HE染色結果，CON在治療4周和8周后均無任何脂滴浸潤現(xiàn)象;HFD組在治療4周后和治療8周后脂肪空泡數(shù)量仍然較多，同時有不同程度的細胞變性及炎癥反應;治療4周后，4個治療組的脂肪空泡明顯減少，治療8周后4個治療組的脂肪空泡進一步減少，PDT組仍然有一定的脂肪空泡，但沒有炎癥反應;而LDG組略有一定量的空泡外還有輕微的炎癥反應;MDG組以及HDG組幾乎看不到脂肪空泡及炎癥反應，見圖1。

Figure 1.The pathological changes of liver tissues in the rats with different treatments for differentweeks(HE staining，×200).圖1　不同治療周數(shù)肝臟HE染色切片

2肝功能的變化

治療4周后，HFD組與CON組相比，AST、ALT及AKP的水平明顯增高(P＜0.05)，說明HFD組造模成功;PDT組、LDG組、MDG組及HDG組與HFD組相比，AST、ALT及AKP的水平明顯降低(P＜0.05)，同時可看出PDT組的改善沒有LDG組、MDG組及HDG組明顯;治療8周后，PDT組、LDG組、MDG組及HDG組與HFD組相比，AST、ALT及AKP相較于4周前各組進一步降低，已經基本接近于CON組的水平，同時可發(fā)現(xiàn)PDT組的AST、ALT及AKP水平與LDG和MDG組相近但仍然沒有HDG組降低的幅度大，見表1。

表1　不同治療處理對大鼠肝功能的影響Table 1.The changes of the liver functions in the ratswith different treatments(U/L.Mean±SD.n=5)

3血脂的變化

治療4周后，HFD組與CON組相比，TC、TG以及LDL-C的水平明顯增高(P＜0.05)，與此同時，HLD-C的水平明顯降低(P＜0.05)，進一步說明HFD組造模成功;PDT組、LDG組、MDG組及HDG組與HFD組相比，TC、TG及LDL-C的水平明顯降低，與此同時，HLD-C的水平明顯增高(P＜0.05);同時可看出PDT組的改善沒有LDG組、MDG組及HDG組明顯;治療8周后，PDT組、LDG組、MDG組及HDG組與HFD組相比，TC、TG及LDL-C相較于4周各組進一步降低同時HLD-C的水平明顯增高，已經基本接近于CON組的水平，還發(fā)現(xiàn)PDT組的TC、TG、HLD-C和LDL-C水平與LDG和MDG組相近但仍然沒有HDG組降低的幅度大，見表2。

表2　血清脂代謝生化指標的比較Table 2.The biochemical parameters of lipid metabolism of the ratswith different treatments at different time points(mmol/L.Mean ±SD.n=5)

4CoASH1、CATI以及ACOX1蛋白表達的變化

治療4周后，PDT組、LDG組、MDG組及HDG組與HFD組相比，CoASH1、CATI及ACOX1蛋白的表達均明顯升高(P＜0.05)，MDG組及HDG組的CoASH1、CATI及ACOX1蛋白表達均高于PDT組(P＜0.05);治療8周后，CoASH1、CATI及ACOX1蛋白呈現(xiàn)明顯的升高，同時分析可見，PDT組低于LDG組、MDG組及HDG組，與MDG組及HDG組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2～3。

Figure 2.The protein expression of CoASH1，CATIand ACOX1 in the rat liver tissues after 4 weeks of treatment.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs HFD group;#P＜0.05 vs PDT group.圖2　治療4周后大鼠肝組織CoASH 1、CATI及ACOX1的蛋白表達

Figure 3.The protein expression of CoASH1，CATIand ACOX1 in the rat liver tissues after 8 weeks of treatment.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs HFD group;#P＜0.05 vs PDT group.圖3　治療8周后大鼠肝組織CoASH1、CATI及ACOX1的蛋白表達

5CoASH1、CATI及ACOX1 m RNA表達的變化

mRNA與蛋白表達的變化趨勢基本相似，但也有一些不同。治療4周后，PDT組、LDG組、MDG組及HDG組與HFD組相比，CoASH1、CATI及ACOX1 mRNA表達均明顯升高(P＜0.05)，MDG組及HDG組的CoASH1、CATI及ACOX1 mRNA表達均高于PDT組(P＜0.05);治療8周后，CoASH1、CATI以及ACOX1 mRNA表達明顯升高，而PDT組低于LDG組、MDG組及HDG組(P＜0.05);PDT組的CoASH1及ACOX1 mRNA表達低于MDG組及HDG組(P＜0.05)，PDT組的CATImRNA表達低于HDG組，見圖4～5。

討論

當前NAFLD已經成為嚴重威脅人們健康的一大疾?。?］。一般而言，臨床上NAFLD輕度患者沒有什么特殊癥狀，只有約25%的患者可出現(xiàn)疲乏感，但如果本病不加以干預、不注意飲食，任其繼續(xù)發(fā)展，可形成中度甚至重度NAFLD，中度與重度NAFLD則會給患者帶來諸如全身乏力、肝區(qū)隱痛、長期腹瀉等影響［10］，甚至有可能導致患者病情進一步發(fā)展，最終形成肝纖維化、肝硬化以及肝癌等。當前大多數(shù)專家認為NAFLD不應以藥物治療為主，而應該通過改變生活方式進行干預，但最新的研究顯示消除或控制NAFLD相關的因素在NAFLD的治療中不容忽視［11］。

本實驗中NAFLD發(fā)生時，大鼠肝臟聚集著大量的脂肪空泡，同時伴有一定的炎癥反應，其肝功能也會發(fā)生明顯的異常［12］。本文治療前后結果顯示，肝臟切片HE染色顯示CON組在治療4周和8周后均無任何脂滴浸潤現(xiàn)象;HFD組在治療4周后和治療8周后脂肪空泡數(shù)量很多，同時伴有不同程度的細胞變性及炎癥反應，而4個治療組在治療4周后，脂肪空泡明顯減少、治療8周后脂肪空泡進一步減少，同時MDG組和HDG組幾乎看不到脂肪空泡。治療4周后，PDT組、LDG組、MDG組及HDG組與HFD組相比，AST、ALT以及AKP的水平明顯降低，但PDT組的改善沒有LDG組、MDG組及HDG組明顯。這提示大鼠肝臟發(fā)生了明顯的病變，同時肝功能受到影響。而熊去氧膽酸鈉以及人參皂苷Rg1均可以清除大鼠肝臟中聚集的脂滴，同時也可以調節(jié)肝功能，另外人參皂苷Rg1治療效果要優(yōu)于熊去氧膽酸鈉。

Figure 4.The mRAN expression of CoASH1，CATI and ACOX1 in the rat liver tissues after 4 weeks of treatment． Mean ± SD． n = 3．*P＜0.05 vs HFD group;#P＜0.05 vs PDT group．圖4　治療4周后大鼠肝臟提取液CoASH1、CATI及ACOX1的mRNA表達

Figure 5.The mRNA expression of CoASH1，CATI and ACOX1 in the rat liver tissues after 8 weeks of treatment． Mean ± SD． n = 3．*P＜0.05 vs HFD group;#P＜0.05 vs PDT group．圖5　治療8周后大鼠肝臟提取液CoASH1、CATI以及ACOX1的mRNA表達

一般而言，在氧供充足的條件下，肝臟中的脂肪酸可經β-氧化分解為乙酰CoA，最終徹底氧化分解為CO2和H2O并釋放出大量的能量，其具體過程首先是脂肪酸在CoASH1的催化下活化，生成脂酰CoA，之后在CATI的作用下，脂酰CoA進入線粒體開始其氧化分解，最后脂肪酸經過一系列的反應在ACOX1作用下生成2分子乙酰CoA進而分解代謝成能量［13-15］。本文研究CoASH1、CATI以及ACOX1這3個β-氧化關鍵酶，RT-PCR與Westernblot的實驗結果顯示，治療4周后，PDT組、LDG組、MDG組及HDG組與HFD組相比，CoASH1、CATI及ACOX1的酶蛋白和mRNA表達均明顯升高，MDG組以及HDG組3個酶的mRNA表達均高于PDT組;治療8周后，上述3個酶蛋白和mRNA表達明顯升高。另外大鼠在治療后，血脂4個關鍵指標均有明顯的改善，提示熊去氧膽酸鈉以及人參皂苷Rg1均可以通過調節(jié)大鼠β-氧化途徑來改善其脂代謝，而人參皂苷Rg1治療效果要好于熊去氧膽酸鈉。

本研究的結果提示，用高脂飲食8周所建立的NAFLD大鼠模型具有明顯的脂代謝紊亂及肝功能異常;人參皂苷Rg1不僅可通過調節(jié)大鼠β-氧化相關的酶，進而改善脂肪代謝對大鼠非酒精性脂肪肝的肝損傷發(fā)揮治療作用，但是其作用機制亟待研究;本次研究還發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1具有降低血脂的功能，但是其是否具有減肥效果以及其機理并未涉及。

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Ginsenoside Rg1 im proves liver function by regulating fat metabolism in rats w ith non-alcoholic fatty liver disease

PENG Xuan1，HUANG De-bin1，YAN Mi-ya1，PENG Shi-jun2
(1Medical School of HubeiMinzu University，2The Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture，Enshi445000，China.E-mail:5932347@qq.com)

R575.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.017

1000-4718(2015)05-0864-07

2014-10-27

2015-03-03

國家自然科學基金資助項目(No.81360654)

Tel:0718-8437479;E-mail:5932347@qq.com