吡格列酮對尿毒癥ApoE－/－小鼠調(diào)節(jié)性和效應(yīng)T細(xì)胞平衡的影響*

申燕，肖嫣，王麗君，趙艷，田雨靈，梁瀟，尹愛萍(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病中心腎內(nèi)科，心內(nèi)科，西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實驗室，陜西西安7006)

吡格列酮對尿毒癥ApoE－/－小鼠調(diào)節(jié)性和效應(yīng)T細(xì)胞平衡的影響*

申燕1△，肖嫣2，王麗君3，趙艷2，田雨靈2，梁瀟2，尹愛萍1
(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1腎病中心腎內(nèi)科，2心內(nèi)科，
3西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實驗室，陜西西安710061)

目的:觀察吡格列酮對體外培養(yǎng)的有或無斑塊特異性抗原氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激的尿毒癥ApoE－/－小鼠調(diào)節(jié)性和效應(yīng)T細(xì)胞(Treg/Teff)水平和功能相關(guān)因子的影響及可能機(jī)制。方法:通過兩步外科手術(shù)法建立尿毒癥ApoE－/－小鼠的動物模型，以不同濃度吡格列酮(2μmol/L和20μmol/L)及PPARγ拮抗劑GW9662(5μmol/L)對有或無oxLDL(2 mg/L)刺激的尿毒癥模型鼠脾細(xì)胞作用12 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg及IFN-γ+CD4+Teff細(xì)胞水平，實時熒光定量PCR檢測Foxp3及IFNγ的mRNA表達(dá)。結(jié)果: oxLDL體外誘導(dǎo)尿毒癥ApoE－/－小鼠脾細(xì)胞Treg/Teff失衡。吡格列酮上調(diào)oxLDL抑制下的Treg及Foxp3的表達(dá)，此作用不能被GW9662拮抗;下調(diào)有或無oxLDL刺激下Teff及IFNγ的表達(dá)，此作用可被GW9662拮抗。結(jié)論:ox-LDL體外誘導(dǎo)尿毒癥模型鼠Treg/Teff失衡，吡格列酮通過PPARγ非依賴/依賴機(jī)制調(diào)整Treg/Teff失衡。

吡格列酮;過氧化物酶體增殖物激活受體γ;尿毒癥;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;效應(yīng)T細(xì)胞

［ABSTRACT］AIM:To investigate the effects of pioglitazone on the quantity and function-related factors of regulatory and effector T cells(Treg and Teff)of uremic apolipoprotein E knockoutmice in vitro with orwithout the stimulation of atherosclerotic plaque-specific antigen oxidized low-density lipoprotein(oxLDL).METHODS:Uremic apolipoprotein E knockoutmouse model was established by 2-step surgical procedure.After intervention with different concentrations(2 μmol/L and 20μmol/L)of pioglitazone and PPARγantagonistGW9662(5μmol/L)on splenocytes ofuremicmice for12 h in the presence or absence of oxLDL(2mg/L)，the levels of CD4+CD25+Foxp3+Treg and IFNγ+CD4+Teffwere determined by flow cytometry.ThemRNA expressions of Foxp3 and IFNγwas detected by real-time fluorescent quantitative PCR.RESULTS:In vitro，oxLDL induced a Treg/Teff imbalance in splenocytes from the uremic mice.Pioglitazone upregulated the level of Treg and mRNA expression of Foxp3 in the presence of oxLDL，which was not antagonized by GW9662.Meanwhile，pioglitazone downregulated the level of Teff and mRNA expression of IFNγin the presence or absence of oxLDL，which was reversed by GW9662.CONCLUSION:oxLDL induces a Treg/Teff imbalance in uremic apolipoprotein E knockoutmice.Pioglitazone modulates the Treg/Teff imbalance probably through PPARγ-independent and -dependentmechanisms.

［KEY WORDS］Pioglitazone;Peroxisome proliferator-activated receptorγ;Uremia;Regulatory T cells;Effector T cells

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是終末期腎病患者最常見的心血管并發(fā)癥之一，且其病變進(jìn)展快、范圍廣，已成為影響終末期腎病患者預(yù)后的重要因素［1］。但迄今為止，其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，傳統(tǒng)的抗AS治療藥物效果不佳。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AS是血管壁的慢性炎癥反應(yīng)，T細(xì)胞亞群的活化和狀態(tài)是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［2］。最近的研究表明效應(yīng)T細(xì)胞(effector T cells，Teff)促進(jìn)AS發(fā)展，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)則可抑制Teff而減緩AS進(jìn)程［3］。有研究發(fā)現(xiàn)Treg/Teff平衡失調(diào)是終末期腎病患者AS發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制［4］。改善Treg/Teff失衡有可能成為延緩終末期腎病患者AS進(jìn)展的新的治療靶點(diǎn)。我們最近的研究表明過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)的配體吡格列酮(pioglitazone，PIO)可減輕尿毒癥載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E knockout，ApoE－/－)小鼠AS的進(jìn)展并使斑塊的穩(wěn)定性增加［5］。因此本研究通過建立尿毒癥ApoE－/－小鼠模型，觀察氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，oxLDL)對模型鼠脾細(xì)胞Treg/Teff平衡的影響及PIO可否調(diào)控Treg/Teff平衡及可能機(jī)制，為PIO延緩終末期腎病、加速AS進(jìn)展的機(jī)制提供理論依據(jù)。

材料和方法

1實驗動物、主要試劑和儀器

C57BL/6J遺傳背景的ApoE－/－種鼠(B6.129P2-ApoEtm1Unc)購自中國南京大學(xué)模式動物遺傳研究中心，飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心層流室，出生后4周離乳，喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料:5%脂肪、18.9%蛋白質(zhì)、72.3%碳水化合物、1.01%鈣及0.65%磷。

鹽酸吡格列酮原藥由江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司饋贈;GW9662購自ALEXIS;oxLDL購自中山醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)實驗室;佛波酯、monensin、ionomycin和伴刀豆球蛋白A(concanavalin A，ConA)購自Sigma; RNAfast200總RNA極速抽取試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas;SYBR?Premix Ex TaqTMRT-PCR Kit購自TaKaRa;PE標(biāo)記抗小鼠干擾素γ(interferonγ，IFNγ)單克隆抗體和小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測試劑盒購自eBioscience。

FACScan流式細(xì)胞儀(BD)由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)

院中心實驗室提供;IQ5實時定量PCR儀(Bio-Rad)由西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實驗室提供;Hitachi706全自動生化分析儀由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科提供;932型電燒灼器由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院機(jī)能中心提供。

2方法

2.1尿毒癥ApoE－/－小鼠動物模型的建立取8周齡雄性ApoE－/－小鼠，參照Nikolov等［6］的方法，采用2步外科手術(shù)法建立尿毒癥模型:10%水合氯醛腹腔內(nèi)麻醉后行2 cm側(cè)腹切口，暴露右腎，仔細(xì)處理輸尿管及避免損傷腎上腺，電凝整個皮質(zhì)除了腎門周圍2 mm完整組織，縫合肌層和皮膚;2周后，通過相似切口暴露左腎，在雙結(jié)扎腎血管及輸尿管后左腎被摘除，縫合肌層和皮膚。對照組行假手術(shù):雙腎被膜剝離(8周暴露右腎，10周暴露左腎)。第2次手術(shù)后2周，尿毒癥和對照組ApoE－/－小鼠各8只采集血標(biāo)本檢測血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)、總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)。

2.2分離尿毒癥ApoE－/－小鼠脾細(xì)胞16周齡尿毒癥模型鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡5～10 min;左腹部朝上，剪開皮膚并分離筋膜，剪開肌肉層，暴露并分離脾臟;RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗脾臟，剔除筋膜組織，轉(zhuǎn)移至200目鋼濾網(wǎng)，用玻璃針芯充分研磨; RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗脾細(xì)胞至無菌培養(yǎng)皿中，收集脾細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液混勻靜置5 min，1 500 r/min離心7 min，棄上清;RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，1 500 r/min離心7 min，棄上清;重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為2.2×109/L。

2.3實驗分組及干預(yù)脾細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔1～1.5 mL，以含有PIO(或DMSO)的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋1倍，分別加入ConA(5 mg/L)、10%胎牛血清，按分組加或不加oxLDL和GW9662 (5μmol/L)。oxLDL干預(yù)濃度依據(jù)參考文獻(xiàn)［7］，以0、1、2、3及5 mg/L進(jìn)行預(yù)實驗，結(jié)果與文獻(xiàn)一致，CD4+CD25+T細(xì)胞呈劑量依賴性下降，故以濃度2 mg/L作為本次實驗干預(yù)濃度。

2.4流式細(xì)胞儀檢測CD4+IFNγ+Teff數(shù)目細(xì)胞孵育8 h后分別加入ionomycin(1 mg/L)、monensin (1.7 mg/L)和佛波酯(25μg/L)，繼續(xù)孵育4 h;收集細(xì)胞于EP管后1 500 r/min，4℃離心7 min，棄上清;流式緩沖液洗滌后重懸，加入含F(xiàn)ITC-CD4或FITC-IgG2b的流式緩沖液100μL，4℃避光孵育30 min;洗滌后加入固定/破膜工作液0.8 mL，4℃避光孵育45 min;1 500 r/min離心7 min，棄上清;緩沖液洗滌后加入PE-IFNγ抗體1μL，對照管加入PE-IgG1抗體1μL，4℃避光孵育30 min;洗滌后重懸至500 μL，流式細(xì)胞儀檢測。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg數(shù)目收集細(xì)胞于EP管后1 500 r/min，4℃離心7 min后洗滌;重懸后加入含F(xiàn)ITC-CD4抗體、PE-CD25抗體的流式緩沖液100μL，4℃避光孵育30 min;洗滌后加入固定/破膜工作液0.8 mL，4℃避光孵育90 min;1 500 r/min，離心7 min后洗滌;細(xì)胞重懸后加入APC-Foxp3抗體或APC-IgG2b 2μL，4℃避光孵育30 min;洗滌后重懸至500μL，流式細(xì)胞儀檢測。

2.6實時熒光定量PCR檢測尿毒癥ApoE－/－小鼠脾細(xì)胞IFNγ和Foxp3 mRNA的表達(dá)依據(jù)RNA fast 200試劑盒說明書提取總RNA;參照Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA;TaKaRa PCR試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR，擴(kuò)增反應(yīng)條件如下:95℃10 s;95℃5 s，58.5℃10 s，72℃10 s，40個循環(huán)。每個樣本均做3孔，GAPDH作為內(nèi)參照。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。IFNγ的上游引物為5’-ATTACTACCTTCTTCAGCAACAG-3’，下游引物為5’-CGAATCAGCAGCGACTCC-3’;Foxp3的上游引物為5’-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3’，下游引物為5’-TTCTCACAACCAGGCCATTTG-3’;GAPDH的上游引物為5’-TCAACGGCACAGTCAAGG-3’，下游引物為5’-ACTCCACGACATACTCAGC-3’。分析mRNA的相對表達(dá)量用2－ΔΔCt方法［8］。

3統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩樣本參數(shù)檢驗用t檢驗。多個樣本參數(shù)檢驗采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法，方差齊性用LSD檢驗，方差不齊用Dunnett’s C檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1成功建立尿毒癥ApoE－/－小鼠模型

造模后2周，尿毒癥ApoE－/－小鼠的尿素氮、肌酐較對照組明顯升高(P＜0.05)，提示造模成功。尿毒癥ApoE－/－小鼠與對照ApoE－/－小鼠相比，血清總膽固醇升高(P＜0.05)，甘油三酯的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1　對照與尿毒癥ApoE－/－小鼠腎功能和血脂的比較Table 1.Comparison of renal functional parameters and serum lipids between control and uremic ApoE－/－mice(Mean±SD.n=8)

2PIO對尿毒癥模型鼠Teff水平的影響

以CD4+T細(xì)胞設(shè)門，將IFNγ+CD4+細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的百分比視為Teff的水平。與溶劑對照組比較，2μmol/L和20μmol/L PIO均降低模型鼠脾細(xì)胞中Teff水平(P＜0.05)。在oxLDL作用下，模型鼠脾細(xì)胞中Teff水平明顯升高(P＜0.05)，2 μmol/L和20μmol/L PIO降低oxLDL刺激下Teff水平(P＜0.05)，PPARγ拮抗劑GW9662可逆轉(zhuǎn)PIO的作用(P＜0.05)，見圖1。

3PIO對尿毒癥模型鼠脾細(xì)胞IFNγm RNA表達(dá)的影響

oxLDL上調(diào)尿毒癥模型鼠脾細(xì)胞IFNγ的mRNA表達(dá)(P＜0.05)。2μmol/L和20μmol/L PIO降低模型鼠及oxLDL刺激的模型鼠脾細(xì)胞IFNγ的mRNA表達(dá)(P＜0.01)，GW9662可逆轉(zhuǎn)PIO的效應(yīng)(P＜0.01)，見圖2。

4PIO對尿毒癥模型鼠Treg水平的影響

以CD4+T細(xì)胞設(shè)門，將CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的百分比作為Treg的水平。PIO對模型鼠脾細(xì)胞Treg水平影響不顯著(P＞0.05)。在oxLDL作用下，Treg水平降低(P＜0.05)，2μmol/ L和20μmol/L PIO分別增加oxLDL抑制下的Treg水平(P＜0.01)，GW9662不能拮抗PIO的作用(P＞0.05)，見圖3。

5PIO對尿毒癥模型鼠脾細(xì)胞Foxp3 m RNA表達(dá)的影響

oxLDL下調(diào)尿毒癥模型鼠脾細(xì)胞Foxp3 mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。PIO對模型鼠脾細(xì)胞Foxp3的mRNA表達(dá)無明顯影響(P＞0.05)，但可上調(diào)oxLDL作用下的模型鼠脾細(xì)胞Foxp3 mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，且這一作用不被GW9662所拮抗(P＞0.05)，見圖4。

Figure 1.The effect of PIO on Teff level in the splenocytes of uremic ApoE－/－mice and the antagonism of GW9662 in vitro.Mean± SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs controlgroup;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs oxLDL group;#P＜0.05 vs PIO 2μmol/L group;▽P＜0.05 vs PIO 20μmol/L group;$P＜0.05 vs PIO 2μmol/L+oxLDL group;▲▲P＜0.01 vs PIO 20μmol/L+ oxLDL group.圖1　PIO對尿毒癥ApoE－/－小鼠脾細(xì)胞Teff水平的影響及GW 9662的拮抗作用

討論

心血管疾病是慢性腎功能不全特別是尿毒癥患者最常見的死亡原因，AS是引起心血管并發(fā)癥的主要原因，并且進(jìn)展更加迅速和嚴(yán)重。針對慢性腎衰患者高發(fā)的AS疾病，Lindner等［9］提出了“加速的AS”這一概念。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZD)類PPARγ配體PIO能延緩尿毒癥ApoE－/－小鼠主動脈加速發(fā)展的AS并使斑塊的穩(wěn)定性增加，與上調(diào)尿毒癥模型鼠體內(nèi)Treg數(shù)量和功能有關(guān)［5］。為了進(jìn)一步探索PIO對尿毒癥狀態(tài)下Treg/Teff平衡的影響及可能機(jī)制，我們進(jìn)行了此項體外實驗。

Figure 2.The effect of PIO on themRNA expression of IFNγin the splenocytes of uremic ApoE－/－mice and the antagonism of GW9662 in vitro.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;△△P＜0.01 vs oxLDL group;##P＜0.01 vs PIO 2μmol/L group;▽▽P＜0.01 vs PIO 20μmol/L group;$$P＜0.01 vs PIO 2μmol/L+oxLDL group;▲▲P＜0.01 vs PIO 20 μmol/L+oxLDL.圖2　PIO對尿毒癥ApoE－/－小鼠脾細(xì)胞IFNγmRNA表達(dá)的影響及GW 9662的拮抗作用

Figure 3.The effectof PIO on the Treg level in the splenocytes of uremic ApoE－/－mice and the antagonism of GW9662 in vitro.Mean ±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;△△P＜0.01 vs oxLDL group.圖3　PIO對尿毒癥ApoE－/－小鼠脾細(xì)胞Treg水平的影響及GW 9662的拮抗作用

目前已經(jīng)公認(rèn)AS病變實質(zhì)上是一種慢性炎癥反應(yīng)或自身免疫性疾病，T淋巴細(xì)胞在其中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［2］。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，具有抗炎和維持對自身抗原免疫耐受的作用，阻斷不同的免疫炎癥性疾病和抑制AS的進(jìn)展［10］。Foxp3是Treg特異性的標(biāo)志和發(fā)揮功能的關(guān)鍵因子［11］。效應(yīng)性T細(xì)胞主要包括Th1、Th2和新近發(fā)現(xiàn)的Th17，通過促進(jìn)免疫激活的不同方面而促進(jìn)AS的進(jìn)展［2］。病理性效應(yīng)性T細(xì)胞主要通過分泌功能性細(xì)胞因子IFNγ加重AS局部的免疫炎癥反應(yīng)。Treg可抑制Teff的致病免疫反應(yīng)，抑制AS的形成發(fā)展。最近的證據(jù)表明Treg與致病性Teff的失衡促進(jìn)免疫介導(dǎo)的AS進(jìn)展和斑塊的不穩(wěn)定［12-13］。在急性冠脈綜合癥患者中Treg數(shù)目減少、功能受損［14］。在動物模型中，獲得性轉(zhuǎn)移天然或抗原特異性的Treg緩解AS病變［7］。本研究發(fā)現(xiàn)oxLDL體外誘導(dǎo)尿毒癥ApoE－/－小鼠脾細(xì)胞Teff水平及其功能因子IFNγ表達(dá)上調(diào)，致Treg水平及其核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)下降，即Treg/Teff平衡失調(diào)。有報道在終末期腎病患者中oxLDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激使Treg對Fas介導(dǎo)凋亡的敏感性提高，線粒體依賴凋亡途徑發(fā)生［15］。慢性腎衰體內(nèi)存在氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)［16］。因此結(jié)合我們的研究結(jié)果可以得出結(jié)論:尿毒癥狀態(tài)下提高的氧化應(yīng)激使oxLDL產(chǎn)生增加，促進(jìn)Treg凋亡，阻斷Treg信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致外周Treg池的耗竭和Treg/Teff失衡。Treg數(shù)量功能的受損引起Teff功能增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能異常，促進(jìn)尿毒癥模型鼠AS的進(jìn)展。

Figure 4.The effectof PIO on themRNA expression of Foxp3 in the splenocytes of uremic ApoE－/－mice and the antagonism of GW9662 in vitro.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs oxLDL group.圖4　PIO對尿毒癥ApoE－/－小鼠脾細(xì)胞Foxp3 m RNA表達(dá)的影響及GW 9662的拮抗作用

如何調(diào)正Treg/Teff失衡成為預(yù)防和治療尿毒癥“加速AS”的關(guān)鍵所在。人AS斑塊處有PPARγ表達(dá)，提示PPARγ參與AS的病理過程。PPARγPIO屬于TZD類藥物，是PPARγ的藥理性配基。臨床試驗證實PIO治療可減輕2型糖尿病患者頸動脈AS病變［17］。本研究發(fā)現(xiàn)PIO抑制尿毒癥模型鼠脾細(xì)胞Teff水平及其功能性細(xì)胞因子IFNγ的表達(dá)，此作用可被PPARγ拮抗劑GW9662所逆轉(zhuǎn)，提示PIO通過PPARγ依賴途徑下調(diào)Teff水平和功能。本研究還發(fā)現(xiàn)PIO上調(diào)oxLDL抑制的尿毒癥模型鼠脾細(xì)胞Treg水平及其核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)，此作用不能被GW9662所逆轉(zhuǎn)，提示PIO通過非PPARγ依賴途徑上調(diào)Treg水平和功能。因此結(jié)合前期的研究，我們認(rèn)為PIO通過PPARγ非依賴機(jī)制促進(jìn)Treg的極化、PPARγ依賴機(jī)制抑制Teff的偏倚，調(diào)正Treg/Teff的失衡。PIO誘導(dǎo)尿毒癥模型鼠T細(xì)胞譜向抗AS方向轉(zhuǎn)化(更多的Treg及更少的Teff)，提高的Treg數(shù)量活性導(dǎo)致減少的Teff細(xì)胞介導(dǎo)的致病反應(yīng)，從而發(fā)揮延緩AS斑塊的進(jìn)展和穩(wěn)定斑塊的作用。

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Effect of pioglitazone on balance of regulatory and effector T cells of urem ic apolipoprotein E knockoutm ice in vitro

SHEN Yan1，XIAO Yan2，WANG Li-jun3，ZHAO Yan2，TIAN Yu-ling2，LIANG Xiao2，YIN Ai-ping1
(1Department of Nephrology，Center of Nephrology，2Department of Cardiovascular Medicine，The First Affiliated Hospital，Medical School of Xi，an Jiaotong University，Xi’an 710061，China;3 Key Laboratory of Ministry of Education for Environment and Genes Related to Diseases，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China.E-mail:shenyan66@126.com)

R363;R692

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.006

1000-4718(2015)05-0802-06

2015-01-26［修回日期］2015-03-17

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81200541);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金(No.xjj2012065)

Tel:029-85323952;E-mail:shenyan66@126.com