香樟莖段組培快繁技術(shù)

張椿芳，王建軍，何月秋

(1.寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 寧波 315100； 2.寧波林業(yè)局林特種苗繁育中心，浙江 寧波 315012)

香樟莖段組培快繁技術(shù)

張椿芳1，王建軍2，何月秋1

(1.寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 寧波 315100； 2.寧波林業(yè)局林特種苗繁育中心，浙江 寧波 315012)

以多年生香樟莖段為外植體，進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)和快速繁殖試驗(yàn)。結(jié)果表明：無菌莖段接種至MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.07 mg·L-1的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，腋芽明顯萌動(dòng)并伸長(zhǎng)展葉，且萌發(fā)率為100%；在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1可形成大量叢生芽，平均有效芽數(shù)可達(dá)5.2個(gè)；在1/2 MS+IBA 0.05 mg·L-1生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后，叢生芽全部生根，移栽成活率可達(dá)90%。

香樟；莖段；組織培養(yǎng)；再生體系

樟樹(Cinnamomumcaphora)又名香樟，為樟科樟屬的亞熱帶常綠闊葉喬木，廣泛分布于中國(guó)、日本，同時(shí)作為園林樹種和資源樹種被引種到多個(gè)國(guó)家種植。其生長(zhǎng)迅速，枝繁葉茂，四季常綠，葉形秀麗而又散發(fā)濃香，既是珍貴的芳香油類樹種又是城市重要的景觀和綠化樹種。同時(shí)香樟種子遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定，后代可分化出多種基因型，經(jīng)過選育可形成多種新品種。目前獲得國(guó)家授權(quán)的品種‘涌金’[1]、‘霞光’系種子變異后代，具有較高的觀賞價(jià)值，但是‘涌金’、‘霞光’母株僅有1株，需要通過無性繁殖方法保持其遺傳特性并擴(kuò)大其數(shù)量。然而，扦插和嫁接繁殖方式的成活率低。普通香樟資源豐富，開展其組培研究可為變異品種的組培技術(shù)開發(fā)提供借鑒。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)香樟組培研究取得了一定的成果，國(guó)內(nèi)一些學(xué)者分別利用香樟伐根萌條[2-3]、不同齡期的莖段[4-12]、莖尖[13]、種子[14]、離體胚[15]、幼葉[16]、嫩芽[17-20]等作為外植體進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究工作并誘導(dǎo)出完整植株；K.Nirmal Babu等[21]也報(bào)道香樟莖段組織培養(yǎng)技術(shù)的研究成果，目前雖然有不少香樟組織培養(yǎng)獲得成功的報(bào)道，但不同學(xué)者間的觀點(diǎn)還存在一定的分歧，對(duì)香樟的組培體系的建立對(duì)成年香樟組培再生體系中增殖環(huán)節(jié)出現(xiàn)落葉[3，8]、生根率不高等問題，尚需加強(qiáng)其高效組培再生體系建立的研究，為進(jìn)一步規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2014年8月于寧波市林業(yè)局種苗中心邱隘基地采集腋芽尚未萌發(fā)的多年生的香樟新梢，帶回試驗(yàn)室備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的處理 取香樟發(fā)育充實(shí)、半木質(zhì)化的側(cè)梢和頂梢部分，去除葉片，剪成帶有1～2個(gè)腋芽的莖段，用洗潔精清洗4～5 min，流水沖洗30 min 以上。在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精消毒3 min，無菌水沖洗3次，再用 0.1%升汞根據(jù)莖段直徑大小消毒 8～12 min，無菌水沖洗4～5次。濾紙吸干水分，切去莖段褐化部分，接種至MS培養(yǎng)基中，選擇無菌材料進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)試驗(yàn)。

1.2.2 外植體誘導(dǎo)試驗(yàn) 以MS作為基本培養(yǎng)基添加不同類型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA 0.5、1.0、2.0 mg·L-1；IBA 0.05、0.07，0.1 mg·L-1。采用不同濃度的正交組合形式，以篩選出適宜的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每個(gè)試驗(yàn)號(hào)接種30 個(gè)莖段，重復(fù)3 次，30 d以后觀察腋芽生長(zhǎng)情況。

1.2.3 增殖試驗(yàn) 以MS為基本培養(yǎng)，添加6-BA 0.5、1.0、3.0 mg·L-1；NAA 0.02、0.05，0.10 mg·L-1。采用不同濃度正交組合形式，以篩選出適宜的腋芽繼代與增殖的培養(yǎng)基，每個(gè)試驗(yàn)號(hào)接種30個(gè)芽莖段，重復(fù)3次，30 d統(tǒng)計(jì)腋芽增殖與增殖形成的叢生芽的生長(zhǎng)情況。

1.2.4 生根試驗(yàn) 選擇培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)一致、莖芽高2.0 cm的幼苗進(jìn)行生根試驗(yàn)。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基添加IBA 0.05、0.07、0.1 mg·L-1，每處理接種30株試管苗，重復(fù)3次，30 d統(tǒng)計(jì)叢生芽的生根及生長(zhǎng)情況。

1.3 培養(yǎng)條件

經(jīng)過滅菌處理后的離體材料培養(yǎng)于10 mL的試管中，得到無菌材料后接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。誘導(dǎo)、增殖的基本培養(yǎng)基為MS，白糖為30 g·L-1；生根基本培養(yǎng)基為1/2 MS，白糖為15 g·L-1。所有培養(yǎng)基pH值均為5.8，培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度為40 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間為12 h·d-1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

萌發(fā)率=腋芽生長(zhǎng)外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；平均有效芽數(shù)=30 d統(tǒng)計(jì)總芽數(shù)/接種芽數(shù)(高度為1 cm以上為有效芽)；生根率=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 (SE)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，均值比較采用單因子方差分析，不同處理方式顯著差異性采用Duncan′s新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)方法(SSR，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腋芽萌發(fā)

多數(shù)學(xué)者[4-12]認(rèn)為6-BA與NAA組合有利于香樟腋芽誘導(dǎo)，然而前期研究表明莖段在添加NAA的培養(yǎng)基中極易產(chǎn)生愈傷組織、腋芽斷裂。在添加有適宜濃度的6-BA與IBA培養(yǎng)基中，無菌化后的莖段15 d后腋芽開始萌動(dòng)、抽長(zhǎng)并長(zhǎng)出新葉。由表1可知，低濃度的6-BA、IBA有利于香樟腋芽的誘導(dǎo)，這與彭東輝[5]、龔崢等[19]報(bào)道的結(jié)果一致。當(dāng)6-BA>1 mg·L-1、IBA>0.1 mg·L-1時(shí)香樟莖段腋芽的誘導(dǎo)率降低、莖段切口形成愈傷組織，進(jìn)而褐化、死亡。當(dāng)6-BA為0.5 mg·L-1、IBA為0.05～0.1 mg·L-1時(shí)，香樟莖段腋芽均可全部萌發(fā)，與其他組合相比，萌芽率達(dá)到顯著水平(P<0.05)。然而IBA濃度較低則出現(xiàn)腋芽生長(zhǎng)緩慢，而IBA>0.07 mg·L-1時(shí)萌發(fā)的腋芽出現(xiàn)新葉脫落，不利于進(jìn)一步發(fā)育。綜合分析表明，培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.07 mg·L-1較為適合香樟腋芽的啟動(dòng)培養(yǎng)。

表1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)莖段腋芽誘導(dǎo)的影響

*：不同字母為差異顯著(P<0.05，Duncan′s新復(fù)極差檢驗(yàn))。下同。

2.2 腋芽增殖

由表2可知，香樟腋芽在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代時(shí)叢生芽難以增殖，同時(shí)容易出現(xiàn)葉片死亡、生長(zhǎng)勢(shì)逐漸衰弱進(jìn)而出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象。而在添加不同濃度的6-BA和NAA的培養(yǎng)基中，腋芽增殖形成的叢生芽可正常生長(zhǎng)。當(dāng)NAA為0.02～0.10 mg·L-1，6-BA為0.5 mg·L-1時(shí)腋芽可大量增殖，平均有效芽數(shù)最高可達(dá)到5.2；6-BA增加到1 mg·L-1時(shí)，雖然平均有效芽數(shù)有所提高，最高可達(dá)到5.4，顯著高于6-BA為0.5 mg·L-1、3 mg·L-1時(shí)的平均有效芽數(shù)(P<0.05)，但切口基部愈傷組織增加，分化的叢芽變得細(xì)小，嚴(yán)重的出現(xiàn)葉片脫落和褐化；當(dāng)6-BA增加到3 mg·L-1時(shí)，平均有效芽數(shù)急劇下降，愈傷化嚴(yán)重，叢芽發(fā)育不良夾雜死苗，表明高外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不利于香樟叢生芽的繼代與增殖。不同培養(yǎng)基配方對(duì)腋芽增殖效果進(jìn)行分析表明，在培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1中腋芽增殖達(dá)到的平均有效芽數(shù)可達(dá)到5.2以上，且形成的叢生芽生長(zhǎng)狀態(tài)好。因此，該培養(yǎng)基是香樟腋芽適宜的繼代與增殖培養(yǎng)基。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，香樟叢生芽在增殖培養(yǎng)基中反復(fù)繼代6次以上，切口處容易形成大量白色膨松的愈傷組織，同時(shí)出現(xiàn)畸形苗和死苗，需要與無NAA的培養(yǎng)基隔代交替使用，以分化出更多生長(zhǎng)正常的叢生芽，以保證增殖體系。

表2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)叢生芽增殖的影響

2.3 植株再生

將生長(zhǎng)至2 cm高的香樟叢生芽轉(zhuǎn)移至大量元素減半、添加不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的生根培養(yǎng)基中。由表3可知，培養(yǎng)基無任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)叢生芽沒有生根，生根率極低；隨著IBA濃度的增加叢生芽的生根率逐漸增加。然而當(dāng)IBA為0.1 mg·L-1及以上時(shí)，叢生芽的切口愈傷組織增多，根從愈傷組織長(zhǎng)出，根的維管束組織與莖的維管束組織不相連，不利于生根苗的成活。同時(shí)形成的不定根大多數(shù)為5～6條，較少有側(cè)根形成(圖3、圖4)。叢生芽在1/2 MS+IBA 0.05 mg·L-1培養(yǎng)基中生根率、平均根數(shù)、苗高顯著高于其它生根培養(yǎng)基(P<0.05)，因此該培養(yǎng)基是香樟組培苗生根的適宜培養(yǎng)基。30 d后選擇健壯的再生植株進(jìn)行移栽。移栽前逐漸打開瓶蓋煉苗5～7 d，然后將小苗取出后，用水洗去根部殘留的瓊脂培養(yǎng)基，移栽于裝有蛭石與泥碳土等比例混合的基質(zhì)的容器內(nèi)，60 d后移栽成活率為90%左右。

表3 香樟組培苗的生根培養(yǎng)

圖3 樟樹組培苗生根培養(yǎng)圖4 樟樹再生植株

3 結(jié)論與討論

目前有不少香樟組織培養(yǎng)獲得成功，多數(shù)研究者在香樟組培過程中選用的基本培養(yǎng)基為MS、改良MS、1/2 MS并按照不同的培養(yǎng)階段進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，在腋芽誘導(dǎo)和增殖階段所使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度范圍為6-BA(1～2 mg·L-1)和NAA(0.05～0.5 mg·L-1)；繼代與增殖階段6-BA(3～5 mg·L-1)和IBA(0.2～0.1 mg·L-1)，對(duì)于最佳濃度組合不同學(xué)者的觀點(diǎn)存在一定的分歧[23]，這可能與外植體采集的時(shí)間、樹齡、基因型等諸多因素有關(guān)。本研究中香樟在再生體系建立過程中使用的基本培養(yǎng)基與其他學(xué)者基本一致，而使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度則表現(xiàn)出差異。本研究結(jié)果顯示，香樟腋芽對(duì)NAA非常敏感，低濃度即可使得切口處、葉柄與莖段連接處產(chǎn)生大量愈傷組織并且莖段過于膨大，而MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.07 mg·L-1有利于香樟腋芽誘導(dǎo)與生長(zhǎng)；在腋芽繼代與增殖階段6-BA與IBA的組合容易導(dǎo)致腋芽的生長(zhǎng)勢(shì)衰弱，而MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1則有利于腋芽的繼代與增殖。同時(shí)在腋芽生長(zhǎng)與增殖過程中最常見的問題是新生嫩芽褐化且嫩葉從上到下發(fā)生壞死現(xiàn)象，這與李乾振等[3]和索長(zhǎng)江等[13]報(bào)道的一致。李乾振等[3]和索長(zhǎng)江等[13]在研究普通香樟組培時(shí)認(rèn)為添加NaH2PO450 mg·L-1可降低此現(xiàn)象的發(fā)生，本研究則通過調(diào)整植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類及濃度可以避免。整個(gè)培養(yǎng)過程表明，高濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑容易導(dǎo)致腋芽的愈傷化并明顯抑制其發(fā)育，但本試驗(yàn)中香樟叢生芽生長(zhǎng)較慢，如何改善這一現(xiàn)狀并提高香樟組培體系的高效性尚需進(jìn)一步研究。在生根階段，叢生芽在添加有IBA 0.05 mg·L-1的培養(yǎng)基中組培苗的生根率可達(dá)到100%。

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Study on Tissue Culture and Plant Regeneration ofCinnamomumcaphora

ZHANG Chun-fang1，WANG Jian-jun2，HE Yue-qiu1

(1.NingboCityCollegeofVocationalTechnology，Ningbo315100，Zhejiang，China； 2.BreedingCenterofSpecialtyForestSeedlings，NingboForestryBureau，Ningbo315012，Zhejiang，China)

A micropropagation protocol was developed forCinnamomumcaphorausing as initial explant nodal segments from newly emerged laterals of trees.The results showed that bud inducement was initiated on a MS medium containing 0.5 mg·L-16-BA and 0.07 mg·L-1IBA.The inducement rate of valid buds reached to 100%.The shoots were subcultured and multiplied on an improved MS medium containing 0.5 mg·L-16-BA and 0.05 mg·L-1NAA and the effective bud per shoot was 5.2.Harvested shoots were rooted in vitro in 1/2 MS supplemented with 0.05 mg·L-1IBA for 30 days and the rooting rate was 100%.The survival rate was 90% when the rooting shoots were moved to the greenhouse.

Cinnamomumcaphora；nodal segments；tissue culture；plant regeneration

2014-12-11；

2015-02-25

寧波市林業(yè)科技項(xiàng)目(2011L05)；浙江省寧波市科技局農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2007C10009)

張椿芳(1977—)，女，貴州石阡人，寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，從事植物組織培養(yǎng)研究。E-mail：zhangchunfang@nbcc.cn。

何月秋。E-mail：heyueqiu@nbcc.cn。

10.13428/j.cnki.fjlk.2015.04.028

S723.1+32.6

A

1002-7351(2015)04-0128-05