丹參酮ⅡA對(duì)家兔急性心肌梗死后心肌鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ信號(hào)通路及室性心律失常的影響

周代星 王照華

基礎(chǔ)研究

丹參酮ⅡA對(duì)家兔急性心肌梗死后心肌鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ信號(hào)通路及室性心律失常的影響

周代星 王照華

目的 觀察丹參酮ⅡA對(duì)急性心肌梗死后鈣調(diào)蛋白（CaM）、鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）mRNA表達(dá)和室性心律失常的影響及發(fā)生機(jī)制。方法 36只家兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、心肌梗死組和丹參酮ⅡA組，每組12只。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立急性心肌梗死模型。氯化三苯基四氮唑染色測(cè)量心肌梗死面積，心電監(jiān)護(hù)儀持續(xù)監(jiān)測(cè)室性心律失常的發(fā)生并記錄，實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)左室CaM、CaMKⅡ mRNA的表達(dá)。結(jié)果 丹參酮ⅡA組心肌梗死面積[（38.15±4.03）%]、室性心律失常的發(fā)生率[（45.8±0.04）%]較心肌梗死組[（47.49±5.27）%、（95.8±0.02）%]明顯減少（P＜0.05），CaM、CaMKⅡ mRNA 表達(dá)較心肌梗死組明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 丹參酮ⅡA通過下調(diào)急性心肌梗死后心肌細(xì)胞CaM、CaMKⅡ mRNA表達(dá)，降低室性心律失常的發(fā)生，機(jī)制可能與其阻斷Ca2+/CaM-CaMKⅡ 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。

丹參酮ⅡA； 急性心肌梗死； 室性心律失常； 鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ

急性心肌梗死后心肌發(fā)生電生理重構(gòu)引起惡性室性心律失常是導(dǎo)致患者猝死的重要原因。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+/鈣調(diào)蛋白（CaM）依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是一種致心律失常的信號(hào)分子，可作為抑制心梗后惡性心律失常的新靶點(diǎn)[1]。丹參酮ⅡA是傳統(tǒng)中藥丹參的有效活性成分，臨床上廣泛用于冠心病治療。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能降低缺血性心臟病室性心律失常及心臟事件發(fā)生率[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA具有干預(yù)肥厚心肌電生理異常的作用[3]，但其作用機(jī)制尚未明了。本研究通過家兔急性心肌梗死模型，觀察丹參酮ⅡA對(duì)急性心肌梗死后CaM、CaMKⅡmRNA表達(dá)和室性心律失常發(fā)生率的影響，探討丹參酮ⅡA能否通過抑制CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響室性心律失常的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為健康新西蘭大白兔，體重2.0～2.5 kg，雌雄兼用，各18只，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。實(shí)驗(yàn)兔36只按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、心肌梗死組和丹參酮ⅡA組，每組12只。

1.2 試劑和儀器 主要試劑：丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液購自上海第一生化藥業(yè)有限公司，規(guī)格10 mg/2 ml，批號(hào)H31022558；氯化三苯基四氮唑（TTC）購自Sigma公司，RNAisoPlus提取液（日本TaKaRa公司）；RT-PCR試劑盒（Toyobo公司），PCR擴(kuò)增引物（上海申工）。

主要儀器：RM6420B/C生物信號(hào)采集系統(tǒng)（成都儀器廠）、TKR-200C小型動(dòng)物呼吸機(jī)（江西特力麻醉呼吸設(shè)備公司）、SP-Ⅲ心電監(jiān)護(hù)儀（美國COLIN公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ILLumina公司）、PCR儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）。

1.3 兔急性心肌梗死模型制作及標(biāo)本保存 新西蘭大白兔36只，其中24只以3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）和 30%烏拉坦（300 mg/kg）耳緣靜脈注射，麻醉良好后，在動(dòng)物呼吸機(jī)的支持下，經(jīng)開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，建立急性心肌梗死模型。結(jié)扎線以下近心尖的左室前壁出現(xiàn)心肌青紫，心肌收縮力降低，心電圖呈ST段弓背向上抬高0.5 mV且30 min內(nèi)不回落，為模型制作成功。將成模家兔隨機(jī)分為心肌梗死組和丹參酮ⅡA組，分別于心梗后1 h、8 h從耳緣靜脈給予生理鹽水5 ml、丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液3 ml/kg[溶于生理鹽水（1 ml/kg）中]；記錄家兔心電圖，12 h后處死，迅速取出心臟，經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗后，去除心房和右心室，將左室及室間隔于-80℃保存。假手術(shù)組家兔開胸但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，余同心肌梗死組。

1.4 TTC染色法測(cè)量心肌梗死面積 將左室于-80℃冰凍5 min，然后沿左室長(zhǎng)軸將心室水平切為厚2～3 mm的心肌片，再置于1%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（pH8.5）中，37 ℃孵育 30 min，正常組織被染成紅棕色，梗死區(qū)未著色，以梗死心肌占左室心肌重量的百分比作為梗死面積。

1.5 心肌組織CaM、CaMKⅡmRNA表達(dá)水平檢測(cè) 取左室游離心肌組織約5 μg立即放入預(yù)冷（4℃）勻漿液中，使用特別電極制成組織勻漿，然后低溫離心（4 ℃，12 000 r/min，20 min），取上清液置于Ep管中待測(cè)。按照RNAiso Plus提取液操作說明提取上述收集上清液總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板加入引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CAM引物序列：上游為5′-GCTGCCTCTTCAAAATCGCC-3′， 下 游 為 5′-CTCTGCACTGTGTACCTCGG-3′。CaMKⅡ引物序列：上游為 5′-TCTCACCACCATGCTGGCTAC-3′，下游為 5′-TTCCTGTTTCCGCACTTTGG-3′。PCR反應(yīng)體系（20 μl）包括：cDNA 工作液 4 μl，上游引物及下游引物 （100 μl） 各 0.4 μl，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix（2×）10 μl及高壓滅菌去離子水5.2 μl反應(yīng)條件如下：50℃ 2 min，95℃10 min后進(jìn)入循環(huán)（95℃ 30 s，60℃ 30 s，循環(huán)40次）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳（0.5×TBE電泳液），拍照后經(jīng)美國Bio-Rad蛋白凝膠分析軟件Quantity One對(duì)電泳條帶進(jìn)行吸光度掃描分析，以內(nèi)參β-actin吸光度值進(jìn)行校正。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示，計(jì)量資料以±s表示，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組心肌梗死面積和室性心律失常發(fā)生情況比較 假手術(shù)組未出現(xiàn)心律失常，心肌梗死組、丹參酮組均出現(xiàn)各種室性心律失常（均P<0.01），丹參酮組心肌梗死面積及室性心律失常的發(fā)生均較心肌梗死組明顯減少（P<0.05）。見表1。

2.2 三組心肌CaM、CaMKⅡ表達(dá)水平比較 心肌梗死組、丹參酮組心肌CaM、CaMK mRNA表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組（P<0.05，P<0.01），而丹參酮組心肌CaM、CaMK mRNA表達(dá)明顯低于心肌梗死組（P<0.05，P<0.01）。見表 2。

表1 三組心肌梗死面積和室性心律失常發(fā)生情況比較（±s）

表1 三組心肌梗死面積和室性心律失常發(fā)生情況比較（±s）

注：OVPBS：偶發(fā)性室性早搏；FVPBS：頻發(fā)室性早搏；VT：室性心動(dòng)過速；VF：心室顫動(dòng)。與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與心肌梗死組比較，bP<0.05

組別 例數(shù) OVPBS FVPBS VT VF 梗死面積（%）假手術(shù)組 12 0 0 0 0 0心肌梗死組 12 12a 12a 12a 10a 47.49±5.27a丹參酮組 12 6ab 6ab 5ab 5ab 38.15±4.03b

表2 三組心肌CaM、CaMKⅡmRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 三組心肌CaM、CaMKⅡmRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：CaM mRNA：鈣調(diào)蛋白mRNA；CaMKⅡ mRNA：鈣調(diào)蛋白依懶性蛋白激酶ⅡmRNA。與假手術(shù)組比較，aP<0.01，bP<0.05；與心肌梗死組比較，cP<0.05

組別 例數(shù) CaM mRNA CaMKⅡmRNA假手術(shù)組 12 1.00±0.00 1.00±0.00心肌梗死組 12 1.89±0.05a 2.34±0.19a丹參酮組 12 1.44±0.02bc 1.61±0.08ac

3 討論

研究表明，Ca2+/CaM-CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在心肌重構(gòu)及產(chǎn)生室性心律失常的過程中起著重要作用[4,5]。Ca2+作為胞漿內(nèi)第二信使，與CaM形成Ca2+-CaM復(fù)合物后，進(jìn)一步激活CaMKⅡ。CaMKⅡ被認(rèn)為是一個(gè)分子開關(guān)，在靜息狀態(tài)時(shí)，存在自身抑制區(qū)封閉催化部位而處于非活化狀態(tài)。急性心肌梗死后心肌細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，Ca2+-CaM復(fù)合物與CaMKⅡ的自身抑制區(qū)結(jié)合，改變CaMKⅡ酶的構(gòu)象，同時(shí)CaMKⅡ發(fā)生自身磷酸化，從而使CaMKⅡ激活[6]。CaMKⅡ激活后的作用底物非常廣，包括多種與鈣調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白，如L型鈣通道[7]、肌漿網(wǎng)上ryanodine受體[8,9]，進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。一方面Ca2+通過L型鈣通道內(nèi)流，另一方面肌漿網(wǎng)鈣離子大量釋放，從而加重Ca2+超載。嚴(yán)重鈣超載可誘發(fā)心肌細(xì)胞后除極，導(dǎo)致室性心律失常的發(fā)生[10]。

在高血壓小鼠模型、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎小鼠模型及主動(dòng)脈狹窄小鼠模型中，都有心肌肥大和CaMKⅡ表達(dá)和（或）活性的上調(diào)[5,11]。轉(zhuǎn)基因抑制CaMKⅡ可顯著改變交感神經(jīng)興奮和心肌梗死后心臟的不利重構(gòu)，抑制心肌細(xì)胞肥大和凋亡，降低肌漿網(wǎng)Ca2+負(fù)荷[12,13]，增加復(fù)極鉀電流而縮短動(dòng)作電位時(shí)程[14]，延長(zhǎng)有效不應(yīng)期，拮抗心律失常的發(fā)生[15]。這些研究結(jié)果表明，CaMKⅡ信號(hào)通路在心臟的結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)中都起著重要作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死后心肌細(xì)胞CaM、CaMKⅡmRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，各種室性心律失常發(fā)生率明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)Ca2+/CaM-CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與急性心肌梗死后室性心律失常的發(fā)生密切相關(guān)。

丹參酮ⅡA磺酸鈉為傳統(tǒng)中藥丹參的有效成分，已經(jīng)被廣泛用于臨床治療缺血性心臟病。既往研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能夠部分阻斷TGFβ胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少其誘導(dǎo)的下游細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，抑制心肌纖維化[17]。丹參酮ⅡA對(duì)肥厚心肌細(xì)胞中存在的電生理異常有明確干預(yù)作用，它能減少Ca2+內(nèi)流和恢復(fù)Ito鉀電流活性，起到預(yù)防心律失常的作用[3]。近來一些研究認(rèn)為，丹參酮ⅡA可以通過抑制miR-1的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)鈣來發(fā)揮對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用，同時(shí)它也能夠通過對(duì)miR-1和細(xì)胞通道表達(dá)的影響來發(fā)揮抗心律失常的作用[18,19]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮能縮小心肌梗死面積，下調(diào)心肌細(xì)胞CaM及CaMKⅡmRNA的表達(dá)，降低室性心律失常的發(fā)生。因此，我們推測(cè)丹參酮ⅡA可通過減輕心肌細(xì)胞鈣超載、抑制心肌細(xì)胞內(nèi)CaM的活化，進(jìn)而抑制心肌CaMKⅡ活性，避免由鈣穩(wěn)態(tài)失衡誘發(fā)的室性心律失常，從而起到心肌保護(hù)作用。

總之，丹參酮ⅡA對(duì)缺血心肌具有良好的抗心律失常作用，可能與其阻斷鈣Ca2+/CaM-CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。

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Effect of TanshinoneⅡA on myocardial calmodulin-dependent protein kinaseⅡsignal pathway and ventricular arrhythmia induced by acute myocardial infarction in rabbit

Effect of TanshinoneⅡA on myocardial calmodulin-dependent protein kinaseⅡ signal pathway and
ventricular arrhythmia induced by acute myocardial infarction in rabbit

ZHOU Dai-xing，WANG Zhao-hua.Department of Emergency Medicine，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

：WANG Zhao-hua，E-mail：wangzhaohua726@163.com

ObjectiveTo explore the effect of tanshinone ⅡA（TSNⅡA）on mRNA expression of calmodulin（CaM）and calmodulin-dependent protein kinaseⅡ（CaMKⅡ）and ventricular arrhythmia induced by acute myocardial infarction （AMI）in rabbits and its possible mechanisms.MethodsThirty six rabbits were randomly divided into sham group，AMI group and TSNⅡA group.AMI model in rabbits was established by ligation of the left anterior descending coronary antery.The size of AMI was measured by TTC dyeing,ventricular arrhythmias were recorded，and mRNA expression of CaM and CaMKⅡwere observed by real time RT-PCR after AMI for twelve hours.ResultsThe AMI size（38.15±4.03）%and incidence of ventricular（45.8±0.04）%in TSNⅡA group were significantly lower than AMI group（47.49±5.27）%，（95.8±0.02）%（P＜0.05），and mRNA expression of CaM and CaMKⅡ in TSNⅡA group were downregulated significantly（P＜0.05，P＜0.01）.ConclusionTSNⅡA could reduce incidence of ventricular arrhythmias by inhibition of calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡsignal pathway.

TanshinoneⅡA； Acute myocardial infarcfion； Ventricular arrhythmia； Calmodulin-dependent protein kinaseⅡ

國家自然青年基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：81001571）；湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2103CFB080）

作者單位：430030 湖北省武漢市，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院急診內(nèi)科

王照華，E-mail：wangzhaohua726＠163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．04．020

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2015）04-0368－04

2015-01-20）