土壤中石油烴與降解菌群的相互作用研究

左麗敏，馬曉陽，李智民，余榮華，王 燕,馮 亮，劉 慧，彭正華

(1.中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國家重點實驗室，湖北 武漢 430074；2.中國地質(zhì)大學(xué) (武漢)環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430074；3.湖北省地質(zhì)局水文地質(zhì)工程地質(zhì)大隊，湖北 荊州 434020)

土壤中石油烴與降解菌群的相互作用研究

左麗敏1，2，馬曉陽1，2，李智民3，余榮華3，王 燕1，2,馮 亮2，劉 慧1，2，彭正華3

(1.中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國家重點實驗室，湖北 武漢 430074；2.中國地質(zhì)大學(xué) (武漢)環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430074；3.湖北省地質(zhì)局水文地質(zhì)工程地質(zhì)大隊，湖北 荊州 434020)

以江漢油田石油污染土壤為研究對象，通過室內(nèi)模擬修復(fù)試驗，向石油污染的土壤中添加降解菌群的營養(yǎng)液后，在不同處理時間檢測土壤中的石油烴含量、組成以及微生物的活性、多樣性和功能基因的變化，研究土壤中石油烴與微生物的相互作用規(guī)律。試驗結(jié)果表明：在添加LB培養(yǎng)基菌懸液的土壤中石油烴在35 d內(nèi)降低了30%，其中低分子量正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴先降解，高分子量正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴后降解，同時生成低分子物質(zhì);采用ARISA技術(shù)對DNA-ITS-PCR產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)，降解菌群添加至土壤后很快成為優(yōu)勢菌，但隨著時間的延長土壤微生物多樣性發(fā)生較大的變化，微生物功能基因多樣性檢測顯示，降解菌群處理土壤前期微生物可能主要以烷烴降解過程中生成的醇類等物質(zhì)為底物，而后期可能以芳香類降解過程中生成的酚羥類物質(zhì)為底物。

石油污染土壤；生物降解；微生物活性；微生物多樣性；功能基因多樣性

石油開采、冶煉、使用和運輸過程中遺漏事故等造成嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，它不僅降低了土壤的性能，而且其中有毒物質(zhì)還會污染地下水，進而對人類健康構(gòu)成威脅[1-2]。不僅如此，石油污染對微生物生態(tài)環(huán)境也具有較大的影響，有報道稱[3]，石油污染土壤對微生物的群落結(jié)構(gòu)及種群分布具有脅迫性，在污染程度不同的土壤中微生物的分布特征具有很大的差異。因此，石油污染土壤治理成為當(dāng)前亟待解決的問題。

石油污染土壤的治理早先多采用物理、化學(xué)等方法，而發(fā)展較晚的生物技術(shù)由于克服了物理、化學(xué)等方法的諸多缺點，以其經(jīng)濟、有效、安全、簡便、無二次污染的特點受到人們的青睞，已成為當(dāng)今石油污染土壤治理的主要途徑[4-7]。作為生物修復(fù)的主要角色，微生物的動態(tài)監(jiān)測極為重要，因此針對微生物多樣性的研究也越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。目前關(guān)于這方面的報道也相當(dāng)廣泛[8]，如末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)分析技術(shù)[9]、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)技術(shù)[10]、變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)[11-12]等。近年來，F(xiàn)isher和Triplett所創(chuàng)的ARISA技術(shù)[13]在國內(nèi)外也逐漸發(fā)展起來。ARISA全稱自動核糖體間隔基因分析(Automated ribosomal intergenic spacer analysis)，它通過可以分辨的熒光峰的總數(shù)代表被分析樣品中物種的總體數(shù)目，基因片段的大小也可以與基因庫中的數(shù)據(jù)進行比較，以得到更多生物信息。針對這一技術(shù)，多位學(xué)者對該技術(shù)所用引物也進行了研究，其成果顯著[14-16]。

據(jù)報道[17]，位于潛江境內(nèi)的江漢油田是著名的魚米之鄉(xiāng)，至20世紀(jì)七八十年代油田開發(fā)以來，由于開采過程中原油的滴漏以及油井廢棄造成的原油滲漏，使其在土壤中遷移，導(dǎo)致開采區(qū)及附近農(nóng)田遭受嚴(yán)重的石油污染，土壤中石油烴含量所占比例最高已達到24.67%[18]。為此，本文以江漢油田石油污染土壤為研究對象，擬通過室內(nèi)模擬修復(fù)試驗，研究石油污染土壤生物修復(fù)過程中石油烴的降解特點及其對土壤微生物多樣性的影響，旨在為江漢油田土壤原位生物修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原油：江漢油田采油廠。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，超純水1 L，pH值7.2。

無機培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO4·3H2O 1 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，CaCl20.02 g，NH4NO31 g ，pH值7.2，F(xiàn)eSO4痕量，MnSO4·H2O痕量，超純水1 L。

固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入15～20g/L瓊脂。以上液體培養(yǎng)基均需在121℃高壓滅菌20 min。

有機物檢測所需試劑：四氯化碳(環(huán)保級)；正己烷(色譜純)；二氯甲烷(色譜純)；正構(gòu)烷烴(C15～C34)標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mg/L(使用時將其逐級稀釋成所需濃度)；16種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)溶液200 mg/L(使用時將其逐級稀釋成所需濃度)。

PCR及凝膠電泳所需試劑：Master Mix；瓊脂糖；核苷酸膠體染料；Maker；Loading Buffer；50TAE(使用前稀釋50倍)；PCR特異性引物[19-20]見表1。

表1 PCR特異性引物信息

1.2 試驗方法

1.2.1 石油降解菌的培養(yǎng)和鑒定

從示范工程場地采集長期被石油污染的土壤，將其置于以場地原油為唯一碳源的富集培養(yǎng)基中進行馴化和篩選[4]，最終獲得能以石油為唯一碳源的微生物菌群。采用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌懸液中DNA，并將其置于-20℃下保存，盡量避免反復(fù)凍融。

以上述提取的DNA為模板，選擇27F和1492R通用引物進行16S-PCR擴增，25 μL的PCR反應(yīng)體系如下：12.5 μL Master Mix，0.5 μL引物F，0.5 μL引物R，1 μL DNA模板，10.5 μL ddH2O。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物送至上海生工公司檢測，并將所得序列信息輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析。

1.2.2 試驗設(shè)計

稱取示范工程場地中石油污染土壤(石油烴含量1.7%)250 g，向其中分別添加50 mL水菌懸液和LB培養(yǎng)基菌懸液，并以添加無菌水為對照，每組兩個平行，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適時噴灑無菌水，使其保持約30%的含水率，定期檢測污染土壤中石油烴含量與組成、微生物多樣性與活性、微生物功能基因多樣性等。

1.2.3 檢測方法

土壤總石油烴含量用四氯化碳作萃取劑進行萃取，并用紅外測油儀進行檢測。土壤有機物含量及組成經(jīng)二氯甲烷[21]萃取后，利用微波萃取-硅膠氧化鋁層析柱凈化，同時添加二氯甲烷和正己烷的混合溶液(1∶1)洗脫，洗脫液濃縮后用氣相色譜儀分析多環(huán)芳烴和正構(gòu)烷烴的含量。

微生物活性通過酶標(biāo)儀監(jiān)測48 h內(nèi)OD值得出其生長曲線。使用Power Soil DNA Isolation Kit試劑盒(深圳安必勝公司)對定期所取土樣的DNA進行提取后，用HEX熒光標(biāo)記引物ITSF(GTCGTAACAAGGTAGCCGTA)和ITSReub(GCCAAGGCATCCACC)[14]進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物送到上海生工公司采用ARISA技術(shù)檢測，檢測結(jié)果利用Peakscanner軟件分析。微生物功能基因多樣性則是將引物換成表1中所示的引物進行PCR擴增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，并根據(jù)條帶的有無確定降解基因的存在。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油烴的降解效果

本試驗采用無菌水菌懸液和LB菌懸液兩種方式制作修復(fù)菌劑，前者不含碳源和無機營養(yǎng)物質(zhì)，后者含有碳源和氮、磷、鉀等無機營養(yǎng)元素。

圖1為兩種菌劑方式對土壤中石油烴的降解效果。由圖1可知，不加菌水和添加水菌懸液的土壤中石油烴含量變化較小，兩者的趨勢相近；添加LB菌懸液的土壤中石油烴含量在前35 d下降較快，其降解率為30.2%，35 d后由于LB培養(yǎng)基中的營養(yǎng)消耗殆盡，從而石油烴停止降解。由此說明，微生物對有機物的作用存在共代謝。因此，使用降解菌群進行石油烴污染修復(fù)時，必須要考慮供給微生物生長繁殖所需的碳、氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素。

2.2 石油烴降解過程中脂肪烴組成的變化

經(jīng)LB菌懸液處理后石油烴降解過程中正構(gòu)烷烴的組成發(fā)生了變化(見圖2)，LB菌懸液處理土壤15 d后，較短碳鏈(C15～C25)的脂肪烴含量降低，說明較短碳鏈的脂肪烴較容易被降解；處理30 d后長鏈脂肪烴含量降低，短鏈脂肪烴含量增加，表明長鏈脂肪烴開始降解生成短鏈脂肪烴。

2.3 石油烴降解過程中多環(huán)芳烴組成的變化

經(jīng)LB菌懸液處理后石油烴降解過程中多環(huán)芳烴(PAHs)的組成也發(fā)生了明顯的變化(見圖3)，與正構(gòu)烷烴相似，LB菌懸液處理土壤15 d后，3環(huán)的菲和4環(huán)的熒蒽已降解；處理30 d后，6環(huán)的茚苯(1,2,3-cd)芘比例降低，5環(huán)的苯并(k)熒蒽和苯并(b)熒蒽比例增加?？偟膩碚f，少環(huán)的多環(huán)芳烴先發(fā)生降解，多環(huán)的多環(huán)芳烴向少環(huán)方向遷移。

2.4 修復(fù)菌劑對土壤中微生物活性的影響

土壤中微生物的生長曲線見圖4。由圖4可見：添加無菌水菌懸液處理后的土壤樣品中不同時間微生物生長曲線的變化趨勢相近，停滯期相同，中段對數(shù)增長期的趨勢相近[見圖4(a)];而添加LB菌懸液處理后的土壤樣品中生長曲線為多段式，表明微生物種類較為復(fù)雜[見圖4(b)]?？梢姡⑸锷L遲滯期隨菌懸液處理時間的延長而縮短，生長速率隨處理時間的延長而加快。由此說明，添加營養(yǎng)的菌懸液促進了土壤微生物的整體活性。

2.5 石油烴降解過程中微生物多樣性的變化

將提取的菌液DNA進行ARISA序列分析，得到的檢測結(jié)果見圖5。一般來講[12],每種微生物DNA長短(堿基對)是不同的，ARISA中可以分辨的熒光峰的大小，即基因片段的大小代表被分析樣品中物種的種類，因此一種微生物會有一個特定的熒光峰。由圖5可見，石油降解菌群中片段大小約550 bp的菌種占絕對優(yōu)勢，即為主要降解菌種。從菌種鑒定NCBI-Blastn比對結(jié)果可知，該菌種為假單胞桿菌屬Pseudomonas。

土壤中添加降解菌群之前，土壤微生物多樣性經(jīng)ARISA分析的結(jié)果見圖6。由圖6可見，LB菌懸液處理前，在550 bp處沒有明顯的特征峰，說明試驗所篩選出來的降解菌不是該土壤中原有的優(yōu)勢菌。

土壤中添加降解群之后，土壤微生物多樣性經(jīng)ARISA分析的結(jié)果見圖7。由圖7可見，當(dāng)土壤中添加LB菌懸液后，在550 bp處出現(xiàn)了明顯的特征峰，說明降解菌已接種至土壤中，且已成為優(yōu)勢菌之一；除此之外，LB菌懸液的加入也促使土壤中原有在260 bp、300 bp和370 bp處的三種菌也占據(jù)一定優(yōu)勢。

當(dāng)土壤中添加LB菌懸液30 d后，其微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化，見圖8。由圖8可見，在550 bp處的降解菌特征峰仍然存在，但其優(yōu)勢已不再明顯；土壤中原有的300 bp處的微生物特征峰已不明顯，而在400 bp處出現(xiàn)了一個新的特征峰。這些結(jié)果表明，在該階段土壤中優(yōu)勢菌已發(fā)生了改變。

2.6 石油烴降解過程中微生物功能基因的變化

表1中所列的D3、D5、D6、D7、C23均為海桿菌烷烴羥化酶基因的克隆PCR引物[22]，具有降解石油污染土壤中的海桿菌烷烴的特性。特異性引物GST為可降解芳香族化合物細菌中的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆引物；特異性引物PD39為酚羥化酶大亞基基因的克隆PCR引物，其作用是降解石油污染土壤中酚羥物質(zhì)，從而降低其污染程度。以上引物均可用于檢測微生物在降解石油烴時降解基因表達的變化。

土壤DNA提取后經(jīng)特異性引物D3、D5、D6、D7、GST、PD39、C23擴增后的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖9。由圖9可見：土壤經(jīng)LB菌懸液處理后0～49 d內(nèi)，海桿菌烷烴降解基因D3一直以優(yōu)勢存在；PD39酚羥物質(zhì)降解基因存在于處理0～15 d和49 d的土壤中，30 d時該基因片段消失，表明30 d時酚羥物質(zhì)降解菌從優(yōu)勢菌轉(zhuǎn)為非優(yōu)勢菌，49 d時再次轉(zhuǎn)為優(yōu)勢菌。由此說明，土壤處理30 d以前微生物可能主要以烷烴降解過程中生成的醇類等物質(zhì)為底物，而49 d后可能以芳香類降解過程中生成的酚羥類物質(zhì)為底物。

3 結(jié) 論

本文以江漢油田石油污染修復(fù)場地中采集的石油污染土壤為研究對象，通過室內(nèi)模擬修復(fù)試驗，研究了土壤中石油烴與降解菌群的相互作用規(guī)律，得到如下結(jié)論：

(1) 在土壤中同時添加LB溶液與石油降解菌，能有效地促進石油烴的降解，同時增加了微生物的活性。但使用降解菌群進行石油烴污染土壤修復(fù)時，必須要考慮供給微生物生長繁殖所需的碳、氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素。

(2) 石油烴主要包含烷烴、芳烴以及其他組成成分，在對石油烴的作用過程中，低分子量有機物如短碳鏈和少環(huán)芳烴等較容易被降解，先發(fā)生作用，高分子量有機物較難降解，后發(fā)生作用，同時會慢慢轉(zhuǎn)化為低分子量有機物。

(3) 通過對微生物多樣性分析可知，LB菌懸液處理前后土壤中的微生物群落具有顯著的差異，而且這種變化會隨著反應(yīng)時間的推移繼續(xù)改變，通過檢測到反應(yīng)期間PD39酚羥物質(zhì)降解基因的存在和消失，也能充分證明土壤中有機成分是影響微生物群落特征的重要因素。

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Research on Interaction between Petroleum Hydrocarbon and Degrading Bacteria Consortium in Soil

ZUO Limin1,2,MA Xiaoyang1,2,LI Zhimin3,YU Ronghua3,WANG Yan1,2, FENG Liang2,LIU Hui1,2,PENG Zhenghua3

(1.StateKeyLaboratoryofBiogeologyandEnvironmentalGeology,ChinaUniversityofGeosciences,Wuhan430074,China;2.SchoolofEnvironmentalStudies,ChinaUniversityofGeosciences,Wuhan430074,China;3.HubeiInstituteofHydrogeologyandEngineeringGeology,Jingzhou434020,China)

This paper takes the contaminated soil collected from the petroleum pollution repair site in jianghan oilfield as the research object and aims to study the interaction between petroleum hydrocarbon and microbes in soil through the indoor repair simulation experiment,which adds bacteria consortium to the oil-polluted soil and measures the content and composition of petroleum hydrocarbon,microbial activity and the diversity of microbes and functional genes in different processing time.The results show that petroleum hydrocarbon content decreases by 30% in 35 days in the soil treated with degrading bacteria consortium in LB media.Among the petroleum hydrocarbons,n-alkanes and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) with lower molecular weight decrease first,and then that with higher molecular weight degrades into smaller organic molecules.According to the results of DNA-ITS-PCR product analysis using ARISA,the degrading bacteria quickly becomes dominant species after entering into the soil.However,the microbial diversity changes much with culture time,and some new significant species appeare.The results of functional gene diversity showe that bacteria consortium mainly uses alcohols derived from the degradation of alkanes as substrate in the previous stage,and uses phenols-hydroxyls derived from the degradation of aromatic hydrocarbons as substrate.

petroleum-contaminated soil;biodegradation;biological activity;microbial diversity;functional gene diversity

1671-1556(2015)04-0063-06

2014-11-12

2015-04-03

國家國際科技合作專項項目(2013DFG92250)；資源枯竭型城市礦山地質(zhì)環(huán)境治理重點工程項目(財建[2011]414號文)

左麗敏(1990—)，女，碩士研究生，主要研究方向為有機污染化學(xué)生物學(xué)。E-mail：784903064@qq.com

X53；X74

A

10.13578/j.cnki.issn.1671-1556.2015.04.011

劉 慧(1971—)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境有機化學(xué)生物學(xué)、污染場地修復(fù)、環(huán)境影響評價等方面的研究。E-mail:hliu2009@cug.edu.cn