血液制品中人細(xì)小病毒B19基因的檢測(cè)與分析

鄭榮斌　余燕

[摘要] 目的 檢測(cè)血液制品及原料血漿中人細(xì)小病毒B19，分析污染狀況，以評(píng)估人細(xì)小病毒B19危險(xiǎn)性。 方法 對(duì)單人原料血漿、混合原料血漿、4種類型的血液制品提取核酸后分別進(jìn)行B19病毒核酸實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)篩查，對(duì)篩查結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到個(gè)人血漿陽(yáng)性率為0.267%、混合血漿感染5.45%、靜注人免疫球蛋白感染0、人纖維蛋白原感染5.67%、人凝血因子Ⅷ和人凝血酶原復(fù)合物陽(yáng)性率分別為7.41%和10.3%。 結(jié)論 盡管國(guó)內(nèi)在血液制品生產(chǎn)工藝中使用了滅活/去除B19病毒的方法，但在本研究中篩查的原料血漿及血液制品中仍檢測(cè)出了B19 DNA。

[關(guān)鍵詞] 血液制品；原料血漿；人細(xì)小病毒B19基因；熒光定量PCR

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）13-151-03

[Abstract] Objective To test human bocavirus B19 in blood products and source plasma， and evaluate the danger of human bocavirus B19 by analyzing its contamination status. Methods Real-time quantitative PCR testing and screening of B19 nucleic acid was made after extracting nucleic acid from single source plasma， mixed source plasma and four types' blood products， and the screening results were statistically analyzed. Results The results were tested in laboratory including 0.267% positive rate of single plasma， 5.15% of contamination in mixed plasma， 0 of contamination in intravenous injection of human immunoglobulin， 5.67% of contamination in human fibrinogen， 7.41% positive rate of human coagulation factor Ⅷ and 10.3% positive rate of human prothrombin complex. Conclusion Although the methods to inactivate or eliminate B19 virus in production process of blood products， B19 DNA is still tested in the screening source plasma and blood products in this research.

[Key words] Blood products； Source plasma； Human bocavirus B19 gene； Fluorescence quantitative PCR

近年來(lái)，血液制品在某些特定疾病的治療起著不可替代的作用，伴隨著血液制品越來(lái)越受到廣大患者的需求的同時(shí)，一些具有潛在危害的病毒漸漸引起人們的關(guān)注，這其中人細(xì)小病毒對(duì)長(zhǎng)期輸注血液制品的患者所引發(fā)的安全性危害問(wèn)題更加受到國(guó)際社會(huì)的密切關(guān)注。人細(xì)小病毒B19（Human Parvovirus B19）是目前已知導(dǎo)致人類致病的細(xì)小病毒之一。臨床表現(xiàn)為傳染性紅斑、短暫的關(guān)節(jié)炎疼痛、因慢性骨髓障礙導(dǎo)致慢性貧血等多種疾病[1-3]。人細(xì)小病毒B19由于其病毒顆粒直徑僅20～25nm、無(wú)膜包被的生物學(xué)特性使其很難在病毒滅活工藝中除去，并且它能夠抵抗多種生產(chǎn)中使用的病毒滅活方法，包括S/D法[4]、高溫滅活法。目前已有資料證明B19可經(jīng)由S/D法和一定干熱滅活法處理的血液制品傳播[5-7]。因此，對(duì)血液制品的檢測(cè)、篩查及B19篩查方法的建立對(duì)保護(hù)患者

的健康至關(guān)重要。本次實(shí)驗(yàn)擬采用B19核酸檢測(cè)試劑盒，對(duì)華南地區(qū)的原料血漿和血液制品隨機(jī)采樣進(jìn)行了檢測(cè)和分析，為進(jìn)一步了解華南地區(qū)的血液制品 B19病毒的感染和污染情況提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取2013年12月～2014年12月華南地區(qū)（以廣東省為主）的2家血液制品公司的血液制品（包含人凝血因子Ⅷ54批、人纖維蛋白原53批、人凝血酶原復(fù)合物58批、靜注人免疫球蛋白55批），在血液中心采取6000份個(gè)體血漿，在隨機(jī)抽取的2家血液制品公司生產(chǎn)用混合血漿65份[樣本的采集、運(yùn)輸及保存均符合《中國(guó)藥典》三部（2010版）生產(chǎn)用人血漿規(guī)程要求]。

1.2 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)采用試劑盒法對(duì)采取的樣品進(jìn)行小病毒核酸的提取。

主要儀器：美國(guó)ABI公司的PCR儀；VeritiTM96 Well Thermal Cycler，熒光定量PCR擴(kuò)增儀：7300 Real-Time PCR System，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（GE，GeneQuant1300），恒溫水浴箱、生物安全柜、高速離心機(jī)及高速冷凍離心機(jī)。

試劑盒：Nucleus Acid Isolation Kit（Spin Column Method）、人細(xì)小病毒B19病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ?，均?gòu)自上海科華生物工程股份有限公司。Premix Ex Taq TM（2x）購(gòu)自TaKaRa公司。endprint

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PCR引物探針 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于人細(xì)小病毒B19 DNA 的TaqMan探針及對(duì)應(yīng)的引物 [8]。用Primer Premie 5.0軟件對(duì)此探針和引物序列進(jìn)行評(píng)價(jià)。見(jiàn)表1。

1.3.2 細(xì)小病毒DNA的提取 血漿樣品用1.5mlEP管標(biāo)記后每份提取200μL，加入200μL緩沖液（現(xiàn)配）使用上海科華生物工程股份有限公司核酸提取試劑盒，在經(jīng)過(guò)78℃恒溫處理及分別經(jīng)過(guò)8000、12000rpm/min離心處理后，最終獲得每份DNA為50μL，樣品在-30℃保存?zhèn)溆?。血液制品各類樣品進(jìn)行濃縮后，同血漿樣品提取方法最終獲得50μL/份，-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)及參考廠家人細(xì)小病毒B19病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┱f(shuō)明書(shū)，最終確定反應(yīng)體系為PCR擴(kuò)增體系50μL：Premix Ex Taq TM（2x）25μL，引物各1μL（10mmol/L），探針1μL（10mmol/L）DNA模板2μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性30s，53℃退火30s，68℃延伸30s，共45個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min。

1.3.4 細(xì)小病毒DNA的檢測(cè) 在經(jīng)過(guò)對(duì)每份血漿及其制品的DNA提取之后，每份核酸樣品使用實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)復(fù)孔檢測(cè)，陽(yáng)性對(duì)照為上海科華生物工程股份有限公司人細(xì)小病毒B19病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┲凶詭ш?yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)無(wú)模板陰性對(duì)照（NTC）。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

陰性結(jié)果判定：熒光信號(hào)無(wú)增長(zhǎng)，沒(méi)有典型S型擴(kuò)增曲線；陽(yáng)性結(jié)果判定：熒光信號(hào)增長(zhǎng)明顯，典型的S型擴(kuò)增曲線。

2 結(jié)果

2.1 單人份血漿檢測(cè)結(jié)果

在血液中心隨機(jī)抽取的6000份個(gè)體血漿樣中，用熒光PCR技術(shù)檢測(cè)B19 DNA，檢出陽(yáng)性16份。

2.2 混合血漿檢測(cè)結(jié)果

在2家血液制品公司中隨機(jī)抽取的165份生產(chǎn)用混合血漿中，共檢出陽(yáng)性9份。

2.3 血液制品檢測(cè)結(jié)果

隨機(jī)抽取的55批靜注人免疫球蛋白樣品，B19病毒DNA 檢測(cè)結(jié)果均為陰性；在抽取的53批的人纖維蛋白原樣品中，有3批為陽(yáng)性；在54批次的人凝血因子Ⅷ樣品中，結(jié)果4批檢測(cè)為陽(yáng)性；抽取58批次的人凝血酶原復(fù)合物樣品中，檢測(cè)出6次為陽(yáng)性。見(jiàn)表2。

3 討論

目前，我國(guó)也無(wú)對(duì)血液制品人細(xì)小病毒的強(qiáng)制檢測(cè)規(guī)定。目前在國(guó)外已有B19 DNA污染血液制品的報(bào)道，然而B(niǎo)19 DNA在中國(guó)血液制品中的污染情況尚沒(méi)有展幵廣泛調(diào)查。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)華南地區(qū)血液制品的檢測(cè)篩查，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，使得人們更加直觀的了解到目前國(guó)內(nèi)血液制品所存在的安全性問(wèn)題。

血液制品在當(dāng)今臨床醫(yī)療急救中起到了不可替代的作用。然而，隨著血液制品的推廣使用，至今也時(shí)有血液病傳染的發(fā)生[9-11]。雖然現(xiàn)階段的采集血樣均經(jīng)過(guò)篩查、工藝消毒及逐步檢查管理，已經(jīng)大幅度的降低了病毒的感染，保證血液制品使用的安全性[12]。傳統(tǒng)的去除/滅活病毒工藝對(duì)包膜病毒（如HIV、HBV和HCV）是十分有效的，但不能去除/滅活非包膜病毒（如B19），因此B19污染血液制品的潛在風(fēng)險(xiǎn)仍然存在。原因有以下幾點(diǎn)：（1）原料血衆(zhòng)均為超過(guò)5000份/批次的混裝，存在很大的B19污染風(fēng)險(xiǎn)，更嚴(yán)重的是，在病毒血癥期，B19在感染者體內(nèi)濃度可達(dá)1010copies/mL以上。（2）B19病毒由于其耐熱性以及病毒顆粒微小的特性極易逃脫傳統(tǒng)病毒的去除/滅活（如熱處理法和過(guò)濾法）處[13-16]。（3）B19此類微小病毒具有耐熱性強(qiáng)、穿透性強(qiáng)的特點(diǎn)，在已知的過(guò)濾法及熱處理法中都不能有效去除該類病毒，為血液制品的使用安全流下隱患。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)采集的樣品進(jìn)行了針對(duì)B19病毒DNA的篩查，實(shí)驗(yàn)方法未能檢出靜注人免疫球蛋白樣品陽(yáng)性，個(gè)人血漿感染率為0.267%，而混合血漿及血液制品的陽(yáng)性污染達(dá)到了很高的概率。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道記載的混合血漿感染率略高于本次調(diào)查，這可能與地域有關(guān)。查閱美國(guó)文獻(xiàn)[17]報(bào)道原料血漿在經(jīng)過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)的血液制品中人細(xì)小病毒B19的感染率從原來(lái)的56%～100%降至13%～27%，說(shuō)明光定量PCR檢測(cè)方式可以起到一定的效果。

目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)明確檢查B19病毒核酸的方法，國(guó)內(nèi)在B19病毒方面的分布狀況研究尚不系統(tǒng)。因此針對(duì)國(guó)內(nèi)數(shù)據(jù)缺乏足夠的基礎(chǔ)理論。通過(guò)對(duì)華南地區(qū)血液制品進(jìn)行B19病毒核酸的檢測(cè)與分析，不僅可以分析目前國(guó)內(nèi)血液制品細(xì)小病毒的安全問(wèn)題，也可為今后的制定B19病毒核酸的篩查方式提供理論基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Miyagawa E，Yoshida T，Takahashi H，et al.Infection of the erythroid cell line，KU812 Ep6 with human parvovirus B19 and its application to titration of B19 infectivity[J].Journal of Virological Methods，1999，83：45-54.

[2] Gallinella G，Zuffi E，Gentilomi G，et al.Relevance of B19 markers in serum sample for a diagnosis of parvovirus B19 correlated diseases[J].Journal of Medical Virology，2003，71：135-139.

[3] Kaufmann B，Chipman PR，Kostyuchenko VA，et al. Visualization of the externalized VP2 N termini of infectious human parvovirus B19[J].Journal of Virology，2008，8：7306-7312.endprint

[4] Azzi ACS，Morfrni M，Mariani Q，et al.Human parvovirus B19 infection in hemophiliacs first infused with two high-purity， virally attenuated factor VIII concentrates[J].Am JHematol，1992，39（3）：228-230.

[5] Santagostino EMP，Azzi A，Morfini M.Eliminating parvovirus B19 from blood products[J].Lancet，1994，43（9）：798.

[6] Laurian YDE，Chalvon-Demersay A，d'Oiron R，et al.Transmission of human parvovirus B19 by plasma derived factor VIII concentrates[J].Nouv Rev Fr Hematol，1994，36（6）：449-453.

[7] Rollag H，Pattison JR，Degre M，et al.Glomstein A.Prevalence of antibodies against parvovirus B19 in Norwegians with congenitalcoagulation factor defects treated with plasma products from small donor pools[J].Scand J Infect Dis，1991，23（6）：675-679.

[8] SchmidtⅠ，Biomel J，Seit H，et al.LoWer J Parvovirus B19DNA in plasma pools and plasma derivatives[J].Vox Sanguinis，2001，81（4）：228-235.

[9] Ally AB，Nita S，Philip DM.Evaluation of different assays for the detection of parvovirus B19 DNA in human plasma[J].Journal of Virological Methods，2004，121（1）：7-16.

[10] Wang XM， Zhang GC，Liu F，et al.Prevalence of human parvovirus B19 DNA in cardiac tissues of patients with congenital heart diseases indicated by nested PCR and in situ hybridization[J].Journal of Clinical Virology，2004，31（1）：20-24.

[11] Kouki M，Yasuhiko M，Takako S.Intrantlyroidal persistence of human parvovirus B19 DNA in a patient with Hashimoto's thyroiditis[J].Journal of Infection，2007，55（2）：29-31.

[12] Expert committee on biological standardization.Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products[J].Geneva，2001，32（2）：11-15.

[13] Saldanha J，Minor P.Detection of human parvovirus B19 DNA in plasma pools and blood products derived from these pools：implications for efficiency and consistency of removal of B19 DNA during manufacture[J].Br J Haematol，1996，93（3）：714-719.

[14] Zakrzewska K.Human parvovirus B19 in clotting factor concentrates：B19 DNA detection by the nested polymerase chain reaction[J].Br J Haematol，1992，81（3）：407-412.

[15] McOmish F.Detection of parvovirus B19 in donated blood： a model system for screening by polymerase chain reaction[J].J Clin Microbiol，1993，31（2）：323-328.

[16] Lefrere JJ，Mariotti M，Thauvin M.B19 parvovirus DNA in solvent/detergent-treated anti-haemophilia concentrates[J].Lance，1994，343（8891）：211-222.

[17] Geng Y，Wu CG，Bhattacharyya SP，et al.Parvovirus B19 DNA in Factor Ⅷ concentrates effects of manufacturing procedures and B19 screening by nueleica eidtesting[J].Transfusion，2007，47（5）：883-889.

（收稿日期：2015-03-19）endprint