HIF-1a、COX-2在直腸癌組織中的表達及其臨床意義*

危芬蘭王勝德（江西省鷹潭市人民醫(yī)院腫瘤科 鷹潭 335000）

HIF-1a、COX-2在直腸癌組織中的表達及其臨床意義*

危芬蘭**王勝德
（江西省鷹潭市人民醫(yī)院腫瘤科 鷹潭 335000）

目的：探討HIF-1a、COX-2在直腸癌組織中的表達及其臨床意義。方法：收集手術(shù)切除的直腸癌組織標本69例作為研究組，同期收集癌旁正常直腸組織（直腸癌邊緣外＞6 cm）標本69例作為對照組，采用免疫組化方法檢測HIF-1a、COX-2表達，比較兩組HIF-1a、COX-2陽性表達率，分析兩者與直腸癌臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果：研究組HIF-1a、COX-2陽性表達率均明顯高于對照組（P＜0.05）；HIF-1a、COX-2表達與直腸癌Ducks分期、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)，Ducks分期越高、組織分化程度越低，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者直腸癌組織HIF-1a、COX-2陽性表達率顯著增高（P＜0.05）。結(jié)論：HIF-1a、COX-2在直腸癌組織中的高表達與臨床分期、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征顯著相關(guān)。

HIF-1a COX-2 直腸癌

缺氧誘導(dǎo)因子-1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）是在缺氧狀態(tài)下普遍存在于人類機體的核轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的意義[1]。環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）通過促進腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡等機制共同參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，促進惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究表明，COX-2、HIF-1a的表達與直腸癌治療效果具有緊密的關(guān)系[2]。但關(guān)于HIF-1a、COX-2在直腸癌組織中的表達及其與病理特征的關(guān)系研究報道甚少，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集我院2013年1月至2015年1月期間手術(shù)切除的直腸癌組織標本69例作為研究組。其中男45例，女24例，年齡39~77歲，平均年齡（62.38±6.01）歲；病理類型：乳頭狀腺瘤47例，管狀腺癌14例，黏液腺癌8例；臨床分期（參照Ducks分期標準[3]）：A+B期21例，C期32例，D期16例；組織分化程度：低分化16例，中分化33例，高分化20例。納入標準：全部患者均符合直腸癌的手術(shù)病理診斷標準[4]，術(shù)前未接受放射性治療、化療、免疫治療、中醫(yī)中藥治療、生物靶向治療和藥物等抗腫瘤治療措施，本研究通過倫理委員會審核。排除標準：具有腸癌根治術(shù)史，合并其他腫瘤、心肝腎功能衰竭、全身感染性疾病和精神性疾病患者。同期收集癌旁正常直腸組織（直腸癌邊緣外＞6 cm）標本69例作為對照組。

1.2 檢測方法

1） 試劑與儀器。鼠抗人HIF-1a單克隆抗體、鼠抗人COX-2單克隆抗體、免疫組化試劑盒、HE染色試劑盒（型號：BS115-SJH，中國武漢博士德公司）、DAB顯色劑、PBS緩沖液（北京中杉生物技術(shù)有限公司）、中性樹膠（產(chǎn)品編號：CW0128，北京康為世紀生物科技有限公司）、Zeiss Axioskop顯微鏡（德國）、Thermo scientific全自動封片機（英國）。

2） 操作步驟。采用免疫組化方法檢測HIF-1a、COX-2表達，術(shù)中采集直腸癌組織標本和癌旁正常直腸組織（直腸癌邊緣外＞6 cm）標本，甲醛固定石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片，60 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟3次，每次5 min，浸入無水乙醇、85%乙醇和75%乙醇各5 min，進入蒸餾水5 min水化；采用檸檬酸修復(fù)工作液對石蠟切片進行高壓修復(fù)，修復(fù)工作液加入高壓鍋中，待修復(fù)切片浸入修復(fù)液中，蓋上壓力鍋蓋，加熱至均勻噴氣，2 min后壓力鍋離開熱源，自動冷卻至室溫，蒸餾水淋洗后采用PBS緩沖液洗滌2次，每次3 min，滴加過氧化物酶封閉液，室溫下孵育10 min，PBS緩沖液充分淋洗，滴加封閉用羊血清工作液，室溫下孵育10 min，甩干，滴加HIF-1a（1∶100）、COX-2（1∶100），4℃冰箱孵育過夜，PBS緩沖液充分淋洗，滴加生物素羊抗兔二抗工作液，室溫下孵育10 min，PBS緩沖液充分淋洗，DAB顯色劑顯色1~5 min，顯微鏡下觀察顯色時間，當達到最佳顯色效果后蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)燃0.5~3 min，自來水沖洗復(fù)染液，PBS緩沖液浸泡3~5 min，細胞核返藍，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判定[5-6]

顯微鏡下觀察細胞膜、細胞漿或細胞核上出現(xiàn)棕黃褐色顆粒為陽性細胞，隨機選取5個400倍視野，當未見陽性細胞者評定為0分，當陽性細胞比例＜25%者評定為1分，當陽性細胞比例25%~75%者評定為2分，當陽性細胞比例＞75%者評定為3分；不顯色或顯色模糊者評定為0分，淺黃色者評定為1分，棕黃色者評定為2分，棕褐色者評定為3分，兩項相加即為最終判定結(jié)果。0~1分為陰性，2~3分為弱陽性，4~5分為中度陽性，＞5分為強陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，兩組間的計數(shù)資料采用χ2檢驗，Pearson相關(guān)性分析直腸癌組織HIF-1a、COX-2表達之間的關(guān)系，P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HIF-1a、COX-2陽性表達率比較

研究組HIF-1a、COX-2陽性表達率均明顯高于對照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 兩組HIF-1a、COX-2陽性表達率比較[陽性例數(shù)（%）]

2.2 HIF-1a、COX-2表達與直腸癌組織病理臨床因素的關(guān)系

HIF-1a、COX-2表達與直腸癌Ducks分期、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)，不同Ducks分期、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者直腸癌組織HIF-1a、COX-2陽性表達率比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Ducks分期越高，組織分化程度越低，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者直腸癌組織的HIF-1a、COX-2陽性表達率顯著增高（表2）。

表2 HIF-1a、COX-2表達與直腸癌組織病理臨床因素的關(guān)系

2.3 直腸癌組織HIF-1a、COX-2表達之間的關(guān)系

直腸癌組織中HIF-1a、COX-2表達均為陽性的為42例，均為陰性的為14例，HIF-1a陽性、COX-2陰性的為12例，HIF-1a陰性、COX-2陽性的為1例。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，直腸癌組織HIF-1a、COX-2表達之間具有明顯的正相關(guān)（r=0.759，P＜0.01）。

3 討論

HIF-1a通過調(diào)控糖酵解作用增強機體對低氧的耐受程度，為腫瘤細胞供應(yīng)能量[7]。當腫瘤細胞體積擴大時，HIF-1a通過調(diào)控血管生成調(diào)節(jié)氧運輸能力，為腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲提供條件。關(guān)于HIF-1a在直腸癌中的調(diào)控分子機制尚有待進一步的研究探討。

COX-2是一種誘導(dǎo)型蛋白酶，正常生理狀況下，機體COX-2表達活性較低。近期研究顯示，COX-2不僅在炎癥中發(fā)揮重要的作用，且通過促進細胞增殖、抑制細胞凋亡和促進腫瘤新生血管形成等作用，在參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的價值[8]。目前研究顯示，COX-2在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤組織中的表達均顯著性上調(diào)[9]。COX-2表達與胃癌組織分化程度、浸潤深度、臨床TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移等臨床病理特征顯著相關(guān)[10]。

本研究結(jié)果顯示，直腸癌組織HIF-1a、COX-2陽性表達率均明顯高于正常直腸黏膜組織，兩者比較差異具有顯著性。HIF-1a、COX-2表達與直腸癌Ducks分期、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)，Ducks分期越高，組織分化程度越低，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者直腸癌組織HIF-1a、COX-2陽性表達率顯著增高。因此，HIF-1a、COX-2參與了直腸癌發(fā)生和發(fā)展過程，其陽性表達率越高，直腸癌臨床分期、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度加重。

侵襲和轉(zhuǎn)移是直腸癌的重要生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致直腸癌患者死亡的主要原因之一。惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多因子、多基因共同參與的病理過程。相關(guān)研究顯示，COX-2通過對花生四烯酸催化作用，導(dǎo)致血栓烷形成，激活HIF-1a，增加惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移活性。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析直腸癌組織HIF-1a、COX-2表達之間具有明顯的正相關(guān)，與相關(guān)研究結(jié)果具有一致性[11-12]。因此，HIF-1a、COX-2在直腸癌臨床發(fā)生和發(fā)展的生物學(xué)過程中發(fā)揮促進作用。

綜上所述，HIF-1α，COX-2在直腸癌組織中的顯著性高表達，且兩者與臨床分期、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征顯著相關(guān)。

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The expression of HIF-1α and COX-2 in colorectal cancer tissue and its clinical significance*

WEI Fenlan**, WANG Shengde
(Department of Oncology, The People’s Hospital of Yingtan City, Jiangxi Province, Yingtan 335000, China)

Objective: To investigate the expression of HIF-1a and COX-2 in colorectal cancer tissue and its clinical significance. Methods: Specimens from both the colorectal cancer tissue of operation resection and the adjacent normal rectal tissue (the edge of rectal cancer>6 cm) were selected as a study group and a control group with 69 cases each, respectively. The expression of both HIF-1a and COX-2 was detected by an immunohistochemical method and the positive rate of their expression was compared between two groups. The relationship between their expression and the clinical pathological factors of colorectal cancer were analyzed. Results: The positive rate of HIF-1a and COX-2 expression was significantly higher in the study group than in the control group (P<0.05) and their expression was closely related to Ducks staging, differentiation degree and lymph node metastasis. The higher Ducks stage was, the lower the differentiation degree was, and the positive rate of their expression in the colorectal cancer tissue complicated with lymph node metastasis was significantly increased (P<0.05). Conclusion: The over expression of HIF-1a and COX-2 in colorectal cancer tissue is significantly correlated with the clinical stage, tissue differentiation degree and lymph node metastasis.

HIF-1a; COX-2; colorectal cancer

R735.37

A

1006-1533(2015)19-0050-03

2015年江西省衛(wèi)生計生委科技計劃（項目編號：20151555）

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危芬蘭，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤研究。E-mail：124167059@qq.com

2015-04-15）