Amiloride通過(guò)抑制缺氧誘導(dǎo)的NHE1表達(dá)而延緩calpain介導(dǎo)的ABCA1降解*

莫顯剛， 張 莉， 張洛超， 王 龍， 向 凝， 楊 涓， 宋 翔

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，貴州貴陽(yáng)550004)

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中缺氧普遍存在，缺氧參與動(dòng)脈粥樣斑塊形成發(fā)展［1-2］。膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)在泡沫細(xì)胞及動(dòng)脈粥樣斑塊形成中起重要作用，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(adenosine triphosphate-binding cassette transporter A1，ABCA1)是細(xì)胞膽固醇外流重要門(mén)戶(hù)［3］。研究表明缺氧導(dǎo)致ABCA1轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平下調(diào)［2，4］。但缺氧是否引起ABCA1降解加速而導(dǎo)致蛋白水平下調(diào)尚未見(jiàn)研究。ABCA1蛋白被鈣蛋白酶(Ca2+-dependent cysteine proteinase，calpain)特異性結(jié)合而降解，抑制calpain依賴(lài)ABCA1蛋白降解可能是抗動(dòng)脈粥樣硬化治療重要靶點(diǎn)［3］。我們既往研究發(fā)現(xiàn)缺氧導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞鈉氫交換體1(sodium-hydrogen exchanger 1，NHE1)表達(dá)及 calpain活性增加［5］，由此推測(cè)缺氧導(dǎo)致 NHE1表達(dá)及 calpain活性改變，進(jìn)而加速ABCA1降解。為此，我們以RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象，探討缺氧對(duì)ABCA1降解的影響。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)干預(yù)及分組

RAW264.7細(xì)胞(中科院細(xì)胞所)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12(Hyclone)培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80% ～90%時(shí)，0.25%胰酶消化離心細(xì)胞，常規(guī)傳代。實(shí)驗(yàn)分為3部分:(1)缺氧處理:使用1%O2、5%CO2及94%N2飽和濕度下培養(yǎng)，按缺氧時(shí)間將RAW264.7細(xì)胞分為缺氧0 h(對(duì)照組)、12 h、24 h及48 h共4組，繼而檢測(cè)細(xì)胞活力、NHE1表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(［Ca2+］i)及calpain活性;(2)檢測(cè)ABCA1降解:將缺氧24 h的細(xì)胞按文獻(xiàn)［6］使用放線菌酮(cycloheximide;終濃度100 mg/L;Sigma)抑制細(xì)胞蛋白表達(dá)，并給予或不給予NHE1抑制劑阿米洛利(amiloride;終濃度100 μmol/L;Sigma)干預(yù)，分為對(duì)照組、缺氧組及缺氧+amiloride組，免疫印跡檢測(cè)3組在0 h、6 h及12 h ABCA1蛋白的相對(duì)含量;(3)為探討NHE1參與ABCA1降解的機(jī)制是否與calpain相關(guān)，以常氧培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照，給予calpain抑制劑ALLN(終濃度100 μmol/L;Sigma)及胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM(終濃度100 μmol/L;Sigma)缺氧細(xì)胞干預(yù)12 h，共分為對(duì)照組、amiloride組、缺氧組、缺氧+amiloride組、缺氧 +ALLN組、缺氧+ALLN+amiloride組、缺氧+BAPTA組和缺氧+BAPTA+amiloride組共8個(gè)組，免疫印跡法檢測(cè)ABCA1蛋白的相對(duì)含量及calpain活性。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以每孔5×103密度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁之后，給予缺氧不同時(shí)間，隨后每孔加入20 μL MTT(Sigma)，在二氧化碳培養(yǎng)箱37℃孵育4 h后，棄去上清，每孔加人150 μL DMSO，振蕩后使用酶標(biāo)儀于492 nm處檢測(cè)吸光度(A)值，正常缺氧0 h組作為對(duì)照組，僅加入150 μL DMSO的孔作為空白對(duì)照。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值－空白組A值)/(對(duì)照組A值－空白組A值)。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 缺氧不同時(shí)間的RAW264.7細(xì)胞，提取總RNA，提取過(guò)程嚴(yán)格按照總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作。Realtime PCR 25 μL反應(yīng)體系包括 SYBR Green Real-Time PCR Master Mix 12.5 μL、cDNA 模板 1 μL、NHE-1或β-actin上下游引物各0.5 μL。PCR進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，所有樣本的CT值均由熒光定量PCR擴(kuò)增儀GeneAmp 7300(Applied Biosystems)讀取，得到樣本中NHE-1和β-actin的Ct值。結(jié)果分析以βactin作為內(nèi)參照，NHE1相對(duì)表達(dá)量采用2－ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

2.3 Western blot檢測(cè)NHE1及ABCA1蛋白的表達(dá)按試劑盒提取不同處理RAW264.7細(xì)胞蛋白。將細(xì)胞消化離心收集細(xì)胞，同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解細(xì)胞10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，振蕩混勻，BCA法測(cè)蛋白濃度，將蛋白分裝－80℃保存。20～60 μg蛋白與上樣緩沖液混勻后煮沸10 min，SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5% 脫脂牛奶封閉2 h，孵育 I抗(NHE1，1∶500，Abcam;ABCA1，1∶1 000，Abcam)，4 ℃ 孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min，孵育II抗，37℃孵育1 h，TBST洗3次，顯影、定影。使用ImageJ分析軟件進(jìn)行分析。

2.4 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的測(cè)定［7］取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按每孔2.5×105接種6孔板，取缺氧不同時(shí)間的RAW264.7細(xì)胞，PBS沖洗2遍，加入終濃度5 μmol/L Fluo-3/AM(碧云天生物工程)的PBS避光37℃下干預(yù)60 min，每10 min振蕩細(xì)胞1次，用PBS沖洗細(xì)胞3次之后避光靜置20 min以保證細(xì)胞內(nèi)的Fluo-3/AM完全變成Fluo-3，僅加入PBS的細(xì)胞作為空白對(duì)照之后，使用倒置熒光顯微鏡拍照。細(xì)胞干預(yù)后使用胰蛋白酶消化加入Fluo-3/AM進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5 Calpain活性的測(cè)定 按calpain活性檢測(cè)試劑盒(Promega)操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)不同處理因素干預(yù)RAW264.7細(xì)胞中加入無(wú)鈣裂解液，取50 μL蛋白上清液用來(lái)檢測(cè)calpain活性。每個(gè)樣品分別加入含鈣或無(wú)鈣的緩沖液，再加入特異性熒光底物Suc-LLVY-aminoluciferin，37℃反應(yīng)4 h，在酶標(biāo)儀上讀數(shù)(激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為355和460 nm)，其活性用含鈣樣品的讀數(shù)減無(wú)鈣樣品的讀數(shù)計(jì)算。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，單因素方差分析后，組間差異比較用SNK-q檢驗(yàn)或Tamhane T2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同缺氧時(shí)間對(duì)RAW264.7缺氧細(xì)胞活力及細(xì)胞死亡比率的影響

相對(duì)于對(duì)照組，其余各組細(xì)胞存活率均降低，缺氧24 h較缺氧12 h組差異不顯著，48 h較0 h、12 h及24 h組均明顯降低(P＜0.05)。臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)示檢測(cè)缺氧增加死亡細(xì)胞比率(P＜0.05)，48 h較0 h、12 h及24 h 3組明顯增加(P＜0.05)，24 h與12 h比較差異不顯著，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effects of hypoxia on cell viability and cell survival.A:the results of MTT assay;B:the results of Trypan blue staining assay.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs 0 h;#P＜0.05 vs 12 h;△P＜0.05 vs 24 h.圖1 缺氧對(duì)細(xì)胞活力及細(xì)胞死亡的影響

2 不同時(shí)間缺氧NHE1表達(dá)結(jié)果

RAW264.7細(xì)胞缺氧后NHE1表達(dá)較非缺氧組上調(diào)，缺氧12 h mRNA升高較明顯，隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，mRNA升高幅度減小(P＜0.05)。缺氧后的蛋白水平，12 h升高，隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)NHE1蛋白表達(dá)升高，但48 h與24 h比較差異不顯著。結(jié)合細(xì)胞活力結(jié)果，以下實(shí)驗(yàn)選擇缺氧24 h的細(xì)胞檢測(cè)ABCA1降解，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effect of hypoxia on the expression of NHE1 at mRNA and protein levels.A:the results of real-time PCR;B:the results of Western blot.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs 0 h;#P＜0.05 vs 12 h;△P＜0.05 vs 24 h.圖2 缺氧對(duì)NHE1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

3 缺氧對(duì)［Ca2+］i及calpain活性影響結(jié)果

在缺氧不同時(shí)間給予鈣離子敏感熒光染料，結(jié)果顯示隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，鈣離子濃度升高;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)亦顯示缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，鈣離子濃度升高。隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，calpain活性升高，見(jiàn)圖3。

Figure 3.［Ca2+］iand calpain activity affected by hypoxia.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs 0 h;#P＜0.05 vs 12 h;△P＜0.05 vs 24 h.圖3 缺氧對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及calpain活性的影響

4 Amiloride對(duì)缺氧24 h細(xì)胞ABCA1降解的影響

缺氧24 h細(xì)胞給予cycloheximide抑制蛋白合成6 h及12 h，同時(shí)給予或不給予amiloride干預(yù)，提取蛋白行Western blot檢測(cè)ABCA1的蛋白水平。結(jié)果顯示amiloride干預(yù)組的ABCA1量隨時(shí)間進(jìn)行性降低，下降幅度較未干預(yù)組及對(duì)照組緩慢，見(jiàn)圖4。

5 ALLN及BAPTA對(duì)ABCA1降解的影響

為探討amiloride延緩ABCA1降解機(jī)制是否與calpain相關(guān)，給予或不給予 ALLN及 BAPTA，檢測(cè)ABCA1蛋白量。結(jié)果顯示給予calpain抑制劑ALLN組ABCA1蛋白量高于無(wú)ALLN組(單純?nèi)毖踅M)，而給予細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA干預(yù)，結(jié)果類(lèi)似于ALLN干預(yù)作用;在amiloride聯(lián)合ALLN或 BAPTA干預(yù)可進(jìn)一步升高ABCA1蛋白量，但與單純amiloride干預(yù)的蛋白量相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不論是單純給予amiloride或ALLN或BAPTA干預(yù)缺氧24 h的細(xì)胞，還是amiloride聯(lián)合ALLN或BAPTA處理，calpain的活性較缺氧組顯著降低。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)常氧條件下amiloride組與對(duì)照組比較，蛋白水平及calpain活性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。

討 論

缺氧導(dǎo)致細(xì)胞ABCA1蛋白量降低及膽固醇外流異常［2，4］。本研究旨在探討缺氧處理的 RAW264.7細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平降低之外，是否存在ABCA1蛋白降解增加。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧可增加NHE1表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及calpain活性;NHE1抑制劑延緩缺氧細(xì)胞 ABCA1蛋白降解，提示缺氧誘導(dǎo)NHE1可能通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及calpain活性改變參與ABCA1蛋白降解。

Figure 4.The effect of amiloride on ABCA1 protein levels.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs hypoxia;△P＜0.05 vs 0h;▲P＜0.05 vs 6 h.圖4 Amiloride對(duì)ABCA1蛋白量的影響

Figure 5.The effects of ALLN and BAPTA on ABCA1 degradation and calpain activity.Con:control;Am:amiloride;H:hypoxia;AL:ALLN;BA:BAPTA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Am;#P＜0.05 vs H;△P＜0.05 vs H+AL;▲P＜0.05 vs H+BA.圖5 ALLN及BAPTA對(duì)ABCA1蛋白降解及calpain活性的影響

細(xì)胞缺氧導(dǎo)致核因子HIF-1α積聚，后者啟動(dòng)下游靶基因激活轉(zhuǎn)錄。NHE1啟動(dòng)子中存在HIF-1α的缺氧反應(yīng)元件，缺氧可以誘導(dǎo)NHE1表達(dá)升高。本研究也發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NHE1表達(dá)升高，這與我們以前的研究及其它研究一致［5，8-9］，表明在心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞細(xì)胞系中均發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)上述細(xì)胞NHE1表達(dá)增加。本研究發(fā)現(xiàn)隨缺氧時(shí)間增加，NHE1的mRNA表達(dá)有升高后再降低趨勢(shì)，可能是隨缺氧時(shí)間增加，缺氧細(xì)胞整體功能呈降低趨勢(shì)。研究亦表明NHE1蛋白隨缺氧時(shí)間逐漸升高，可能原因系NHE1蛋白降解半衰期長(zhǎng)［10］，提示缺氧誘導(dǎo)NHE1可能在細(xì)胞復(fù)氧時(shí)仍將細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的氫離子排除細(xì)胞外，對(duì)細(xì)胞生存極為重要。

NHE1在結(jié)構(gòu)上包括細(xì)胞內(nèi)起調(diào)節(jié)功能結(jié)構(gòu)域及構(gòu)成離子通道跨膜域，被認(rèn)為是細(xì)胞膜上重要的支架蛋白。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)眾多細(xì)胞信號(hào)通路相聯(lián)系，調(diào)節(jié)或參與眾多細(xì)胞功能如細(xì)胞增殖、分化、遷徙、凋亡、血管生成、代謝調(diào)節(jié)等［11］。本研究還發(fā)現(xiàn)缺氧后鈣離子濃度增加及激活calpain活性。這與在內(nèi)皮細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞中研究類(lèi)似，其可能機(jī)制是NHE1激活，通過(guò)氫鈉交換，細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度增加，激活鈉鈣交換，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加［12-13］。Calpain是鈣離子依賴(lài)的蛋白酶，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高激活calpain。NHE1/calpain激活參與細(xì)胞生理及病理生理功能活動(dòng)如細(xì)胞凋亡、運(yùn)動(dòng)等。

既往研究表明缺氧可降低ABCA1轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平表達(dá)［2，4］，而本研究重點(diǎn)是探討缺氧能否參與ABCA1降解。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)提示缺氧+NHE1抑制劑干預(yù)對(duì)細(xì)胞活力影響極大(結(jié)果未提供)，鑒于NHE1蛋白降解半衰期長(zhǎng)，采用缺氧后復(fù)氧細(xì)胞進(jìn)行研究。研究中cycloheximide抑制蛋白合成翻譯過(guò)程，排除新蛋白產(chǎn)生對(duì)研究的影響，對(duì)ABCA1蛋白降解研究方法比較可靠。常氧條件下amiloride干預(yù)未能顯著改變蛋白水平及calpain活性，提示ABCA1蛋白水平及calpain活性改變可能與缺氧誘導(dǎo)NHE1密切相關(guān)。本研究的重要發(fā)現(xiàn)是相對(duì)于對(duì)照組，NHE1抑制劑可以延緩缺氧后RAW264.7細(xì)胞中ABCA1降解;calpain抑制劑ALLN及細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑 BAPTA亦可升高 ABCA1蛋白水平，但是amiloride基礎(chǔ)上ALLN或BAPTA干預(yù)，ABCA1蛋白水平并未高于單純給予amiloride組蛋白水平;給予amiloride、ALLN或BAPTA都顯著降低calpain活性。ABCA1降解存在calpain依賴(lài)或非依賴(lài)2種降解方式［6］。本研究結(jié)果還提示缺氧誘導(dǎo)NHE1及calpain活性增加，至少部分參與ABCA1降解加速過(guò)程，導(dǎo)致缺氧后ABCA1蛋白水平下降。除此之外，缺氧誘導(dǎo)ABCA1降解可能存在calpain非依賴(lài)降解方式，具體機(jī)制有待進(jìn)一步明確。

除缺氧外，血管緊張素系統(tǒng)［14］、高糖［15］及脂多糖等致動(dòng)脈粥樣硬化的因子也可激活或誘導(dǎo)NHE1，或許能增加calpain活性及促進(jìn)ABCA1降解，對(duì)于進(jìn)一步探討動(dòng)脈粥樣硬化形成機(jī)制提供新的思路。另外ABCA1與HDL關(guān)系極其密切，呼吸暫停低氧血癥綜合征患者發(fā)生冠心病幾率增加，并有血脂代謝紊亂，其中重要改變是HDL水平降低［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧導(dǎo)致ABCA1降解加速，在一定程度上可部分解釋上述HDL水平降低的發(fā)病機(jī)制。

本研究仍存在一些不足。缺氧時(shí)間僅選擇12 h、24 h及48 h，尚未完全闡明缺氧對(duì)NHE1時(shí)空表達(dá)，如短暫缺氧對(duì)非轉(zhuǎn)錄水平的影響。本研究尚需對(duì)NHE1活性做進(jìn)一步研究。NHE1抑制劑藥物濃度選擇需更為細(xì)化。

總之，本研究缺氧誘導(dǎo)NHE1表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及calpain活性，進(jìn)而加速ABCA1降解。表明缺氧誘導(dǎo)NHE1表達(dá)可能是ABCA1降解的重要機(jī)制。本研究為進(jìn)一步探討缺氧導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常以及NHE1參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成機(jī)制有重要意義。

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