ABCE1基因沉默對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

李 強(qiáng)， 王九江， 羅水發(fā)， 朱俊杰

(寧波明州醫(yī)院泌尿外科，浙江寧波 315000)

膀胱癌是我國(guó)臨床泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，同時(shí)也是全身10大常見的腫瘤之一［1］。雖然化療和新輔助化療在膀胱癌的治療中已得到了廣泛的應(yīng)用，但是膀胱癌的預(yù)后尤其是已發(fā)生臨床轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)的患者仍不十分理想［2］。研究表明多基因調(diào)控導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物改變是膀胱癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一［3］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白E亞族成員 1(ATP-binding cassette，sub-family E，member 1，ABCE1)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，ABCE1的異常表達(dá)可能與惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)［3-4］。本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默人膀胱癌T24細(xì)胞的ABCE1基因，探討其對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為膀胱癌針對(duì)ABCE1基因的靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 主要材料

人膀胱癌T24細(xì)胞株和胎牛血清(上海研晶生物科技有限公司);MI 1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶(Gibco);脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(Invitrogen);RNA提取試劑Trizol(北京天根公司);cDNA合成試劑盒(TOYOBO);RT-PCR兩步法試劑盒(Promcga);siRNA片段(珠海英平生物技術(shù)有限公司構(gòu)建);HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Santa Cruz);鼠抗GAPDH單克隆抗體(上海微蒙生物科技有限公司);CCK-8(上海炎彬化工公司);550酶標(biāo)儀(Bio-Rad);Matrigel(BD);流式細(xì)胞儀(Coulter);生物倒置顯微鏡(Olympus);ECL試劑盒(Thermo)。

2 方法

2.1 siRNA設(shè)計(jì)、合成及轉(zhuǎn)染 根據(jù)參考文獻(xiàn)［5］設(shè)計(jì)靶向人類 ABCE1的 siRNA序列，正義鏈為5’-ATCCGCTACAGCGAGTACGTTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTAAACGTACTCGCTTAGCTTTTTTG-3’，反義鏈為5’-AATFCAAAAAAGCTACAGCGAGTACGTTTACCCCATCTGTGGCTTCACAGGTAAACGTACTCGCTGTAGCG-3’;陰性對(duì)照siRNA正義鏈為5’-GATCCGCGAGACCTCAGTATGTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTAACATACTGAGGTCTCGCTTTTTTG-3’，反義鏈為 5’-AATTCAAAAAAGCGAGACCTCAGTATGTTACCCATCTGTGGCTTCACAGGTAACATACTGAGGTCTCGCG-3’;質(zhì)粒由珠海英平生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2密閉式孵箱內(nèi)培養(yǎng)、傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。按每孔2×105個(gè)將膀胱癌細(xì)胞株T24接種于6孔板中，當(dāng)融合率達(dá)80%時(shí)以脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)分為3組:轉(zhuǎn)染 pGenesil-1-ABCE1-siRNA載體者為 T24/ABCE1-siRNA組(實(shí)驗(yàn)組)，轉(zhuǎn)染NC siRNA載體者為T24/control組(即對(duì)照組)，未轉(zhuǎn)染的膀胱癌T24為T24組(即空白組)。于轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行RNA干擾效應(yīng)的檢測(cè)。

2.2 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 T24棄培養(yǎng)液后，用PBS沖洗3次，采用TRIzol法提取細(xì)胞的總RNA，通過cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別擴(kuò)增ABCE1和內(nèi)參照GAPDH。ABCE1的上游引物為 5’-TTGGTTGTGGGAAGTCGT-3’，下游引物為5’-GCTTATGTAGTTAATGGGAGGT-3’(擴(kuò)增產(chǎn)物為415 bp);GAPDH的上游引物為5’-GAGTCAACGGATTGGTCGT-3’，下游引物為 5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’(擴(kuò)增產(chǎn)物為185 bp)。PCR反應(yīng)條件為95 ℃5 min;95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。通過2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，通過UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus 8.0軟件分析條帶灰度值，用ABCE1/GAPDH為ABCE1的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2.3 Westem blot檢測(cè)ABCE1的蛋白水平 T24棄培養(yǎng)液后，以PBS沖洗3次，加入150 μL RIPA裂解液，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，于 99℃變性10 min。取 50 μg蛋白經(jīng) 10%的 SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移印跡于PVDF膜上，通過5% 的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，2 h后加入1∶1 000稀釋的ABCE1多克隆I抗，4℃過夜，TBST洗膜5 min 5次，加入1∶5 000 HRP標(biāo)記的 II抗和GAPDH，于37℃孵育2 h。PBS洗滌，通過ECL法檢測(cè)。暗室曝光X光片，通過UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus 8.0軟件分析條帶灰度值，以ABCE1/GAPDH為ABCE1的相對(duì)表達(dá)量。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集3組T24細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5×106/L，冷PBS洗滌2次，用70%的冷乙醇(4℃)進(jìn)行細(xì)胞沉淀后混勻備用，洗滌細(xì)胞后，再用PBS調(diào)細(xì)胞濃度為1.5×106/L，與含50 mg/L RNA酶的Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)共同孵育30 min。以100 mg/L碘化丙啶行細(xì)胞DNA染色，暗室中放置1 h后，采用流式細(xì)胞儀分析各組T24細(xì)胞的DNA含量分布，并計(jì)算出每個(gè)周期細(xì)胞所占的百分率。

2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 指數(shù)生長(zhǎng)期T24細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度每孔達(dá)到1×103，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基200 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8試劑20 μL，培養(yǎng)箱溫育4 h后，以不加細(xì)胞空白孔為對(duì)照，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度A值。以細(xì)胞的吸光度A值平均值為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

2.6 細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn) 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期將將上述3組T24細(xì)胞分別以每孔5×103個(gè)的密度接種于6孔板，待培養(yǎng)的各組細(xì)胞生長(zhǎng)為細(xì)胞單層后，通過10 μL移液槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕。PBS輕柔洗滌，每孔加入2 mL不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于48 h后倒置顯微鏡100倍下觀察細(xì)胞遷移情況。

2.7 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 于聚碳酸酯微孔濾膜表面鋪Matrigel每孔50 μg，于聚合好的小室下室中加入10%的胎牛血清做條件培養(yǎng)液，在上室加入按上述3種細(xì)胞處理過的T24細(xì)胞懸液100 μL(細(xì)胞總數(shù)為3×105/L)，置于培養(yǎng)箱中24 h后取出，以棉簽小心刮除濾膜上室面未穿過的瘤細(xì)胞，95%的乙醇固定5 min，PBS輕輕漂洗3遍，蘇木精染色10 min，PBS沖洗小室，自然晾干，將上室的聚碳酸酯濾膜沿邊緣用手術(shù)刀片小心取下，通過樹脂膠固定于玻片上(膜內(nèi)面朝上)后，封片;干燥后于200×光鏡下記數(shù)每膜上、下、左、右、中5個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，每組平行設(shè)3個(gè)小室，重復(fù)3次，計(jì)算平均值為細(xì)胞數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示計(jì)量資料，多組間連續(xù)變量比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 siRNA抑制ABCE1 mRNA的表達(dá)

ABCE1 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)與對(duì)照組和空白組比較，ABCE1-siRNA組條帶明顯變窄，與對(duì)照組和空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Effect of ABCE1 gene silencing on the mRNA expression of ABCE1 in T24 cells detected by RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control and blank.圖1 RT-PCR檢測(cè)T24細(xì)胞中ABCE1 mRNA的表達(dá)

2 siRNA抑制ABCE1蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組和空白組比較，ABCE1-siRNA組蛋白條帶明顯變窄，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Effect of ABCE1 gene silencing on the protein expression of ABCE1 in T24 cells detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs blank and control.圖2 Western blot檢測(cè)T24細(xì)胞中ABCE1的蛋白表達(dá)水平

3 ABCE1基因沉默對(duì)細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組T24細(xì)胞的細(xì)胞周期，結(jié)果示ABCE1-siRNA組與對(duì)照組和空白組相比，在G0/G1期的細(xì)胞顯著增加，在S期細(xì)胞顯著減少。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，M期細(xì)胞數(shù)未見明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說(shuō)明有明顯的S期阻滯，見表1。

4 ABCE1基因沉默對(duì)細(xì)胞增殖的影響

依CCK-8法檢測(cè)結(jié)果繪制的生長(zhǎng)曲線示，ABCE1-siRNA組較對(duì)照組和空白組的曲線明顯降低(P ＜0.05)，見圖 3。

Figure 3.The growth curve of the T24 cells with different treatments.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs blank and control.圖3 ABCE1 siRNA對(duì)T24細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

5 細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果

48 h后ABCE1-siRNA組細(xì)胞劃痕愈合緩慢，而對(duì)照組和空白組細(xì)胞劃痕已基本長(zhǎng)滿，見圖4。

6 ABCE1基因沉默對(duì)T24細(xì)胞體外侵襲力的影響

如圖5所示，對(duì)照組和空白組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)量較多，分別為 56.57 ±5.34 和 57.46 ±4.21，ABCE1-siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明特異性干擾ABCE1基因表達(dá)可有效地降低T24細(xì)胞的侵襲力。

討 論

膀胱癌的發(fā)病率居我國(guó)男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第1位，50～69歲為高發(fā)年齡，是源自膀胱移行上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。其具有較易復(fù)發(fā)、生物學(xué)行為復(fù)雜多變、易侵襲和轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)［4-5］。膀胱癌細(xì)胞臨床上的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是機(jī)體一個(gè)多因素、多階段、多步驟的復(fù)雜過程。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段的逐步演變過程，細(xì)胞通過一系列進(jìn)行性改變而向惡性方向進(jìn)展［6］。這期間涉及多個(gè)基因的變化，既有原癌基因激活和高表達(dá)的發(fā)生，也包含抑癌基因及凋亡基因的失活，亦還涉及大量細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因功能的變化［7-9］。同時(shí)許多研究顯示在腫瘤演變向惡性發(fā)展過程中存在一種調(diào)控分子在控制這些基因的表達(dá)變化，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。相關(guān)研究提示ABCE1基因就是這么一種新的“調(diào)控分子”，參與了腫瘤的形成和發(fā)展。

Figure 4.The results of wound-healing assay.圖4 細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果

ABCE1基因是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白E亞家族的成員之一，定位于常染色體的4q31上，編碼核糖核酸酶 L(ribonuclease L，RNase L)抑制因子［10］，具有高度的保守性。該蛋白可以阻斷干擾素介導(dǎo)的細(xì)胞抗病毒2-5A/RNase L的通路，抑制細(xì)胞的凋亡過程，并能夠在促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞增殖分化方面發(fā)揮作用［11］。有研究表明，在腫瘤細(xì)胞系中抑制ABCE1的表達(dá)可明顯阻礙腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［12-13］，提示ABCEl的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，理論上阻斷腫瘤細(xì)胞中ABCE1的表達(dá)可起到治療腫瘤的作用。

Figure 5.The results of Transwell invasion assay.圖5 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

越來(lái)越多的證據(jù)表明，ABCE1與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控和遷移侵襲密切相關(guān)。為了研究ABCE1基因在膀胱癌細(xì)胞遷移中的具體作用，本研究使用RNA干擾技術(shù)沉默了膀胱癌T24細(xì)胞ABCE1基因的表達(dá)后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯減慢，遷移能力顯著下降，ABCE1基因沉默后S期細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞被阻滯在G0/G1期。同時(shí)劃痕實(shí)驗(yàn)和小室侵襲實(shí)驗(yàn)表明ABCE1基因沉默后膀胱癌T24細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力降低。與Zhao等［14］對(duì)肺癌95-D/NCI-H446細(xì)胞的研究結(jié)果相同。

總之，ABCE1基因不僅與膀胱癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力變密切相關(guān)，而且在促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖方面也起著重要作用。特異性干擾ABCE1基因表達(dá)能夠抑制膀胱癌T24細(xì)胞的遷移能力，并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，因此，ABCE1的siRNA序列可能成為治療膀胱癌的有效靶點(diǎn)。干預(yù)ABCE1可能會(huì)為臨床膀胱癌等惡性腫瘤的治療提供新的思路。

［1］ 錦 輝.膀胱灌注不同化療藥物對(duì)預(yù)防淺表性膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的臨床分析［J］.國(guó)際泌尿系統(tǒng)雜志，2013，33(4):574-576.

［2］ 毛健偉，李慶文.肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的治療進(jìn)展［J］.中華全科醫(yī)學(xué)，2013，11(5):778-780.

［3］ Brausi M，Collette L，Kuah K，et a1.Variability in the recurrence rate at first follow-up cystoscopy after TUR in stage transitional cell carcinoma of the bladder:a combined analysis of seven EORTC studies［J］.Eur Urol，2002，41(5):523-531.

［4］ 任 翼，劉永煜，劉德貴，等.RNA干擾介導(dǎo)ABCE1基因沉默對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響［J］.遼寧醫(yī)學(xué)雜志，2010，24(1):22-25.

［5］ 鄭毛根，田大力，黃 波.ABCE1基因siRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，36(6):697-699.

［6］ 歐陽(yáng)高亮，李祺福.細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué):腫瘤學(xué)分冊(cè)，2000，27(5):266-269.

［7］ Itoh Y，Ishikawa M，Kitaguchi R，et al.Development of target protein-selective degradation inducer for protein knockdown［J］.Bioorg Med Chem，2011，19(10):3229-3241.

［8］ 李小瑞，岳軍艷，張清琴，等.沉默ABCE1基因?qū)θ耸彻馨〦C109細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲及遷移的影響［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2013，20(5):569-573.

［9］ 陳 紅，謝 麗，劉寶瑞.MDM2作為腫瘤標(biāo)志物的研究進(jìn)展［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2011，16(8):751-754.

［10］ Aritoshi I，Susumu S，Akihiro S，et al.Catalog of 605 single-nucleotide polymorphisms(SNPs)among 13 genes encoding human ATP-binding cassette transporters:ABCA4， ABCA7， ABCA8， ABCD1， ABCD3， ABCD4，ABCE1，ABCF1，ABCG1，ABCG2，ABCG4，ABCG5，and ABCG8［J］.J Hum Genet，2002，47(6):285-310

［11］ Vander D，Elisabeth GE，Wim T，et al.ATP-binding cassette(ABC)transporters in normal and pathological lung［J］.Respir Res，2005，6:59.

［12］ Zheng MG，Gao Y，Huang B，et al.Suppression of ABCE1 leads to decreased cell proliferation and increased apoptosis in 95-D/NCI-H446 lung carcinoma cells［J］.Prog Biochem Biophys，2009，36(11):1475-1482.

［13］ 黃 波，王曉東，郎賢平.ABCE1基因?qū)π〖?xì)胞肺癌增殖、侵襲、遷移能力的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013，33(1):119-122.

［14］ Zhao AJ，Zheng MG，Wang GC，et al.Silencing ABCE1 increases E-cadherin expression and decreases cell invasion in 95-D/NCI-H 446 lung carcinoma cells［J］.Prog Biochem Biophys，2010，37(8):891-896.