柱前衍生－手性高效液相色譜法測(cè)定 R－3－奎寧環(huán)醇的光學(xué)純度

袁明輝，鄭鴻聲，王東武，謝愛芳

(1.山東省威海市藥品檢驗(yàn)所，山東 威海 264200;2.山東省威海市經(jīng)區(qū)醫(yī)院心理科，山東 威海 264205;3.迪沙藥業(yè)集團(tuán)，山東 威海 264200)

R－3－奎寧環(huán)醇化學(xué)名為1－氮雜環(huán)[2.2.2]辛 R－3－醇，是合成毒蕈堿受體拮抗藥，如索利那新、瑞伐托酯、他沙利定、阿地溴銨等的重要中間體[1－6]。其合成是以3－奎寧環(huán)酮為原料，經(jīng)羰基還原生成(R，S)－3－奎寧環(huán)醇后，再經(jīng)拆分而得[7－9]。拆分后的 R－3－奎寧環(huán)醇光學(xué)純度均通過測(cè)定旋光度再計(jì)算ee值進(jìn)行描述[2，7－8，10]，然而旋光度法測(cè)定的光學(xué)純度影響因素較多，如偏振光波長(zhǎng)、溶液的濃度、溫度及旋光性雜質(zhì)，誤差較大[11]。隨著手性液相色譜技術(shù)的發(fā)展，高效液相色譜(HPLC)法已廣泛應(yīng)用于對(duì)映體光學(xué)純度的測(cè)定[12－15]。有關(guān) R－3－奎寧環(huán)醇的光學(xué)純度檢測(cè)的HPLC法至今尚未建立，主要原因一方面由于 R－3－奎寧環(huán)醇缺少發(fā)色基團(tuán)，不適用于常規(guī)的液相色譜法檢測(cè);另一方面，由于其手性中心缺乏能與手性色譜柱填料產(chǎn)生氫鍵、偶極－偶極作用、π－π作用或空間作用的基團(tuán)，難以進(jìn)行手性色譜法分離。為此，筆者開發(fā)了柱前衍生手性色譜法測(cè)定 R－3－奎寧環(huán)醇光學(xué)純度的方法。該方法利用柱前衍生化法，使(R，S)－3－奎寧環(huán)醇與苯甲酰氯反應(yīng)生成(R，S)－3－奎寧環(huán)醇苯甲酰氯衍生物，即3－苯甲酸奎寧環(huán)酯，再利用手性液相色譜法進(jìn)行光學(xué)純度測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于 R－3－奎寧環(huán)醇光學(xué)純度的準(zhǔn)確測(cè)定。

1 儀器與試藥

UltiMate 3000型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、變色龍色譜工作站(美國(guó)戴安公司);1500型高效液相色譜儀，包括Module數(shù)據(jù)處理器、單元恒流泵、紫外檢測(cè)器、CSChrom Plus色譜工作站(美國(guó)SSI series公司);Thermal Syncronis C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);AD －H 手性色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，日本大賽璐 Chiralpak公司);恒溫水浴鍋(江蘇金壇科興儀器廠);電子恒速攪拌器(上海申生科技有限公司)。正己烷(天津市彪仕奇科技有限公司，批號(hào)為000405)，乙醇(天津市彪仕奇科技有限公司，批號(hào)為121210)均為色譜純;二乙胺(天津登科化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20120925)，苯甲酰氯(江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司，批號(hào)為 20120502)均為分析純;R－3－奎寧環(huán)醇(純度不低于99.0%，批號(hào)為 SLNX－04－63－16－20)，(R，S)－3－奎寧環(huán)醇(3－奎寧環(huán)醇消旋體，純度不低于99.0%，批號(hào)為SLNX－01－63－12－30)均由迪沙藥業(yè)集團(tuán)藥物研究院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品衍生化法

2.1.1 3－奎寧環(huán)醇消旋體苯甲酰氯衍生化反應(yīng)

衍生化過程:向已有20 mL二氯甲烷的反應(yīng)瓶中加入1.0 g 3－奎寧環(huán)醇消旋體，水浴反應(yīng)溫度保持在20～30℃，向反應(yīng)瓶中先后加入0.47 g氫化鈉和2.22 g苯甲酰氯，直到薄層色譜(TLC)跟蹤原料反應(yīng)完全。反應(yīng)工藝流程見圖1。

圖1 (R，S)－3－奎寧環(huán)醇苯甲酰氯衍生化工藝流程圖

后處理過程:冰水浴條件下，向體系中滴加1 mol/L的鹽酸溶液，直至體系不放氣為止，取二氯甲烷相，水相用20 mL二氯甲烷萃取1次，合并有機(jī)相。有機(jī)相用10 mL飽和食鹽水洗滌1次，減壓濃縮干后得3－奎寧環(huán)醇的衍生化產(chǎn)物，即為(R，S)－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯。

2.1.2 R－3－奎寧環(huán)醇苯甲酰氯衍生化反應(yīng)

取 R－3－奎寧環(huán)醇 1.0 g，按(R，S)－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯的衍生化過程和后處理過程，制得 R－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯。

2.2 對(duì)照品溶液制備

分別稱取(R，S)－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯、R－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯各適量，加乙醇溶解后配制成質(zhì)量濃度約為0.2 g/L的溶液，作為(R，S)－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯對(duì)照品溶液、R－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯對(duì)照品溶液。

2.3 樣品的液相色譜分析

2.3.1 (R，S)－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯的純度測(cè)定

液相色譜系統(tǒng)采用美國(guó)戴安UltiMate 3000型液相色譜系統(tǒng)。色譜柱:Thermal Syncronis C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:緩沖鹽(20 mmol/L乙酸銨，氨水調(diào)節(jié) pH至7.50)－乙腈(70 ∶30);流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):232 nm;進(jìn)樣量:20 μL。按擬訂方法對(duì)(R，S)－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯的純度進(jìn)行測(cè)定，用面積歸一化法計(jì)算純度。由于(R，S)－3－奎寧環(huán)醇羥基空間位阻較大，衍生反應(yīng)產(chǎn)率較低，起初未加入催化劑，衍生物產(chǎn)率僅為25%，后選氫化鈉作催化劑，大大提高了反應(yīng)的產(chǎn)率，3－奎寧環(huán)醇苯甲酰氯衍生產(chǎn)物收率達(dá)95%，產(chǎn)物純度達(dá)98%，見圖2 A。采用擬訂方法對(duì)衍生產(chǎn)物(R，S)－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯色譜峰進(jìn)行峰純度檢測(cè)。結(jié)果峰純度良好(匹配度為998，大于軟件的推薦值990)，為單一色譜峰，見圖2 B。

圖2 (R，S)－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯純度測(cè)定色譜圖及光譜圖

2.3.2 R－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯的光學(xué)純度測(cè)定

色譜系統(tǒng)采用美國(guó)SSI series 1500型高效液色譜系統(tǒng)。色譜柱:日本大賽璐Chiralpak?AD－H手性色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:正己烷 － 乙醇 － 二乙胺(80 ∶20 ∶0.1)，配制后經(jīng)0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾，超聲脫氣;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):232 nm;進(jìn)樣量:10 μL。首先對(duì)(R，S)－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯、R －3－苯甲酸奎寧環(huán)酯分別進(jìn)樣分析，并進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，(R，S)－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯達(dá)到良好分離(分離度 R≥4.0)，見圖3 A;與 R－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯色譜圖(圖3 B)對(duì)比，確定RT=7.42 min為 S構(gòu)型，RT=11.60 min為 R構(gòu)型。

圖3 R－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯純度測(cè)定色譜圖

2.3.3 R－3－奎寧環(huán)醇的光學(xué)純度測(cè)定

取 R－3－奎寧環(huán)醇樣品約1.0 g，按擬訂方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)，制備3－苯甲酸奎寧環(huán)酯。稱取衍生化所得樣品適量，配成質(zhì)量濃度約為0.2 g/L的溶液，作為供試品溶液。按擬訂方法對(duì)供試品溶液進(jìn)行分析。結(jié)果 R－3奎寧環(huán)醇樣品的光學(xué)純度為96.66%，見圖 4。

圖4 R－3－苯甲酸奎寧環(huán)酯樣品光學(xué)純度色譜圖

3 討論

3.1 衍生化反應(yīng)條件

衍生化試驗(yàn)初始條件:向已有20 mL二氯甲烷的反應(yīng)瓶中加入3－奎寧環(huán)醇消旋體1.0 g，水浴保持反應(yīng)溫度為20～30℃，向反應(yīng)瓶中加入苯甲酰氯2.2 g，觀察薄層色譜跟蹤原料反應(yīng)情況。結(jié)果顯示，反應(yīng)緩慢，產(chǎn)率低。將水浴溫度提高至40℃，反應(yīng)仍緩慢;后加入氫化鈉以改變反應(yīng)條件，結(jié)果反應(yīng)大大加速，收率得到很大提高，表明在反應(yīng)條件中引入氫化鈉可促進(jìn)反應(yīng)。

3.2 手性高效液相色譜法開發(fā)

本研究中，采用Daicel AD－H手性色譜柱建立了正相色譜條件下分離3－奎寧醇苯甲酰氯衍生物對(duì)映異構(gòu)體的方法，該方法簡(jiǎn)單、方便，在開發(fā)過程中考察了有機(jī)改性劑對(duì)手性分離的影響。結(jié)果顯示，流動(dòng)相中添加0.1%二乙胺后，一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體色譜峰拖尾明顯改善，峰形較對(duì)稱;流動(dòng)相中添加0.1%三氟乙酸后無明顯變化;流動(dòng)相中同時(shí)添加0.1%二乙胺和0.1%三氟乙酸后，一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體色譜峰與單獨(dú)添加0.1%二乙胺所產(chǎn)生的色譜峰幾乎無差別。故本試驗(yàn)選擇正己烷－乙醇－二乙胺(80∶20∶0.1)為流動(dòng)相。

本試驗(yàn)中通過(R，S)－3－奎寧環(huán)醇苯甲酰氯衍生化，使(R，S)－3－奎寧環(huán)醇能夠用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，引入的苯甲?；鶊F(tuán)增強(qiáng)了其手性中心對(duì)手性色譜柱填料的辨識(shí)能力，使(R，S)－3－奎寧環(huán)醇的一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體 R－3－奎寧環(huán)醇和(S)－奎寧環(huán)醇在Daicel AD－H手性色譜柱上達(dá)到良好分離，建立了一種準(zhǔn)確、可靠的測(cè)定 R－3－奎寧環(huán)醇光學(xué)純度的手性高效液相色譜法。

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