靳三針對(duì)宮內(nèi)窘迫HIBD大鼠大腦皮質(zhì)Cyt-c和Caspase-3表達(dá)的影響

袁青,趙蓉,俞裕天,李星兒,陳飛,劉龍琳,曹勇,郎建英

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靳三針對(duì)宮內(nèi)窘迫HIBD大鼠大腦皮質(zhì)Cyt-c和Caspase-3表達(dá)的影響

袁青1,趙蓉2,俞裕天3,4,李星兒5,陳飛6,劉龍琳3,曹勇3,郎建英7

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院,廣州 510405;2.廣州市醫(yī)藥技術(shù)學(xué)校,廣州 510430;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州 510405;4.佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院,佛山 528031;5.華南師范大學(xué)激光運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510006;6.廣州市十三行國(guó)醫(yī)館,廣州 510415;7.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣州 510405)

目的 探討靳三針對(duì)宮內(nèi)窘迫HIBD大鼠大腦皮質(zhì)Cyt-c和Caspase-3表達(dá)的影響,揭示靳三針對(duì)大腦的保護(hù)機(jī)制。方法 SD雌性大鼠妊娠21 d時(shí)剖腹,用止血鉗夾閉雙側(cè)子宮角血管5 min,剖宮產(chǎn)取出幼鼠經(jīng)行為學(xué)及腦組織切片確認(rèn)缺氧缺血性腦損傷的為模型大鼠,隨機(jī)分為模型組、針刺組。模型組不針刺;針刺1組、針刺2組、針刺3組、針刺4組分別于出生后第3、5、7、14天開(kāi)始針刺,連續(xù)7 d;正常對(duì)照組自然分娩,不造模不針刺。所有組別大鼠均于出生后21 d斷頭取腦組織,檢測(cè)大腦皮質(zhì)中Cyt-c和Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果 4個(gè)針刺組的Cyt-c光密度值都有所下降,其中針刺1組、針刺2組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。針刺1組Caspase-3的表達(dá)被明顯下調(diào),與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。結(jié)論 出生后第3天開(kāi)始針刺對(duì)宮內(nèi)窘迫HIBD大鼠腦的保護(hù)作用與Cyt-c和Caspase-3表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。

針刺;靳三針;HIBD;Cyt-c;Caspase-3;大鼠

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是指由圍生期窒息引起的足月兒和近足月兒(胎齡≥34周)的缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD),特點(diǎn)是在出生第1天出現(xiàn),可伴驚厥樣動(dòng)作、通氣不足或呼吸暫停,原始反射和腦干反射表現(xiàn)受抑制等表現(xiàn),其顯著病理變化是腦血流異常。HIE是導(dǎo)致新生兒死亡和不可逆性腦損傷的主要原因[1],重者可遺留腦性癱瘓、癲癇等難治性兒童腦病[2],輕者也可能是導(dǎo)致患者今后學(xué)習(xí)障礙、輕癱、細(xì)微運(yùn)動(dòng)問(wèn)題、注意力缺陷及高反應(yīng)性的危險(xiǎn)性升高的原因。因此,如何有效改善HIE所致的病理狀況一直是醫(yī)學(xué)界研究的重要內(nèi)容之一。在既往研究中,我們用5 min延遲剖宮產(chǎn)模擬胎兒宮內(nèi)窒息的病理進(jìn)程,成功建立了HIBD新生大鼠模型[3],本研究采用免疫組化染色法觀察不同針刺介入時(shí)間對(duì)大腦皮質(zhì)Cyt-c和Caspase-3表達(dá)情況,以探討針刺治療HIBD的最佳介入時(shí)機(jī)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

已明確預(yù)產(chǎn)期的妊娠SD雌性大鼠21只,體重210～290 g,來(lái)源于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展有限公司[SCXK(粵)2006-0015]。造模手術(shù)及針刺在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(粵) 2008-0001]進(jìn)行。

1.2 主要試劑及儀器

Cyt-c試劑盒,Caspase-3試劑盒(SIGMA公司),二抗、SABC(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),顯微鏡(奧林巴斯,BX50),穗片牌美容針灸針(0.28 mm× 13 mm,100支/盒)、大龍移液器[10mL、200mL、1000mL,大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司]等。

1.3 造模方法

造模孕鼠接受經(jīng)Bjelke法改良的延遲剖宮產(chǎn)術(shù)[4]和巨容等用自制血管帶阻斷雌鼠子宮角血管造模法[5]改良而成,孕鼠妊娠21 d上午,不麻醉頸錯(cuò)位法處死,仰臥位置于手術(shù)板上,沿腹中線剪開(kāi)皮膚、肌肉,打開(kāi)腹腔,暴露雙側(cè)子宮,用4個(gè)血管鉗分別夾閉雙側(cè)上下子宮角血管,立即計(jì)時(shí)開(kāi)始,將事先浸泡于37℃生理鹽水中的無(wú)菌紗布覆蓋在子宮上,不斷更換紗布,保持局部溫度。到達(dá)5 min立即撕破子宮,擠出新生大鼠,撕掉胎盤(pán),保留臍帶,用干棉球擦去口、鼻部羊水,置于37℃恒溫水浴箱中墊有干毛巾的搪瓷托盤(pán)上保暖。取出全部新生大鼠的時(shí)間不超過(guò)2 min。

通過(guò)對(duì)新生大鼠進(jìn)行翻正、斜坡及懸吊等行為學(xué)測(cè)試及HE染色的腦組織切片中的神經(jīng)細(xì)胞死亡程度進(jìn)行定位和定性分析,比較各組行為差異及同一時(shí)段的正常組、模型組新生大鼠腦組織HE染色中死亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量、范圍和出現(xiàn)部位,確認(rèn)出現(xiàn)全腦皮層廣泛、典型的神經(jīng)細(xì)胞死亡為造模成功[3,6]。

1.4 針刺方法

實(shí)驗(yàn)新生大鼠分正常組、模型組、針刺1組、針刺2組、針刺3組、針刺4組。代乳鼠自然分娩的幼鼠為正常組,不針刺;行延遲剖宮產(chǎn)后不針刺的幼鼠為模型組;延遲剖宮產(chǎn)后第3天開(kāi)始行針刺操作的幼鼠為針刺1組;延遲剖宮產(chǎn)后第5天開(kāi)始行針刺操作的幼鼠為針刺2組;延遲剖宮產(chǎn)后第7天開(kāi)始行針刺操作的幼鼠為針刺3組;延遲剖宮產(chǎn)后第14天開(kāi)始行針刺操作的幼鼠為針刺4組,4組針刺組均連續(xù)針刺7 d,針刺選取“靳三針療法”中的“腦三針”、“顳三針”、“智三針”[7],參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8],結(jié)合人與動(dòng)物骨度類(lèi)比,每個(gè)穴位模擬得氣后(大鼠有叫喚、掙扎等反應(yīng))行捻轉(zhuǎn)手法,持續(xù)、均勻捻轉(zhuǎn)20 s,捻轉(zhuǎn)幅度±180°,頻率120次/min,不留針。所有組別的SD大鼠均于出生后21 d處死。

1.5 標(biāo)本采集

對(duì)到達(dá)預(yù)定觀察點(diǎn)的大鼠經(jīng)行為學(xué)評(píng)估后,將大鼠處死,斷頭取腦,冰盤(pán)操作,快速剝離顱骨后取出腦組織,生理鹽水沖洗后即可置入4%中性甲醛溶液固定,之后用全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片,待測(cè)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)染色法,操作簡(jiǎn)要如下。TO型生物制片透明劑充分脫蠟,梯度乙醇水化,3%H2O2避光孵育10 min;流水沖洗2 min,浸泡于檸檬酸鹽緩沖液中,高壓鍋加壓后1300 W(180℃)煮3 min;冷卻至室溫,PBS浸洗3 min×4次,山羊血清封閉20 min;不洗,分別滴加稀釋濃度為1:75的兔抗大鼠Cyt-c和Caspase-3抗體,4℃孵育過(guò)夜;PBS浸洗3 min×4次,滴加生物素化山羊抗兔IgG,37℃孵育20 min;PBS浸洗3 min×4次,滴加SABC復(fù)合物,37℃孵育20 min; PBS浸洗3 min×4次,滴加DAB顯色液,鏡下控制顯色約3～5 min,觀察顏色顯現(xiàn)淡橘色時(shí),流水沖洗終止顯色;滴加蘇木素染液3 min,流水沖洗2 min,1%氨水浸洗數(shù)秒,流水中再?zèng)_洗2 min;脫水,中性樹(shù)膠封片,鏡檢。細(xì)胞核藍(lán)染,細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著的細(xì)胞即是陽(yáng)性細(xì)胞。陰性對(duì)照以0.01 mmol/L PBS代替一抗,其余免疫組化步驟同上。

1.7 圖像處理

每個(gè)腦組織在顯微鏡40倍物鏡下,定位于頂葉外側(cè)大腦皮質(zhì)椎體細(xì)胞層,左右對(duì)稱(chēng),各取3個(gè)連續(xù)視野,用廣州明美圖像處理軟件進(jìn)行拍照,所得照片的統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積均為1768185.44mm,用北京航空航天圖像處理軟件對(duì)照片自動(dòng)進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞光密度值計(jì)算,6張圖片所得數(shù)據(jù)求平均值,作為該腦組織大腦皮層觀察區(qū)的Cyt-c和Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,多組計(jì)量資料的均數(shù)比較用單因素方差分析(-),多組間兩兩比較用法。所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織缺血灶中Cyt-c的表達(dá)

模型組Cyt-c光密度值明顯高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05),說(shuō)明宮內(nèi)窘迫所造的HIBD大鼠Cyt-c的表達(dá)被明顯提高。4個(gè)針刺組的Cyt-c光密度值都有所下降,其中針刺1組、針刺2組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05),提示3 d開(kāi)始針刺和5 d開(kāi)始針刺能更好地降低Cyt-c表達(dá)。詳見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組大鼠腦組織Cyt-c光密度值比較 (±s)

表1 各組大鼠腦組織Cyt-c光密度值比較 (±s)

組別nCyt-c光密度值 正常組80.328±0.125 模型組80.619±0.4201) 針刺1組80.431±0.4552) 針刺2組80.455±0.2042) 針刺3組80.592±0.202 針刺4組80.555±0.196

注:與正常組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

正常組模型組針刺1組 針刺2組針刺3組針刺4組

2.2 大鼠腦組織缺血灶中Caspase-3的表達(dá)

表2 各組大鼠腦組織Caspase-3光密度值比較 (±s)

表2 各組大鼠腦組織Caspase-3光密度值比較 (±s)

組別nCaspase-3光密度值 正常組80.290±0.182 模型組80.602±0.1481) 針刺1組80.312±0.1122) 針刺2組80.688±0.249 針刺3組80.534±0.294 針刺4組80.681±0.112

注:與正常組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

模型組Caspase-3光密度值明顯高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05),說(shuō)明宮內(nèi)窘迫所造的HIBD大鼠腦組織Caspase-3的表達(dá)被明顯提高。僅有針刺1組Caspase-3的表達(dá)被明顯下調(diào),與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05),提示3 d開(kāi)始針刺能明顯下調(diào)Caspase-3的表達(dá)。詳見(jiàn)表2、圖2。

正常組模型組針刺1組 針刺2組針刺3組針刺4組

3 討論

大鼠大腦皮質(zhì)經(jīng)過(guò)HIBD后神經(jīng)細(xì)胞的死亡有兩種形式,即壞死和凋亡。Caspase家族在HIBD中發(fā)揮著重要作用,其中Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶,在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后的樞紐作用[9]。

Cyt-c的釋放是細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)之一。在HIBD的條件下,線粒體處于能量缺乏狀態(tài),使其通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放,釋放出Cyt-c等與凋亡相關(guān)的活性物質(zhì),直接啟動(dòng)凋亡途徑。Cyt-c定位于線粒體內(nèi)膜上,是在呼吸鏈中電子傳遞必需的一類(lèi)色素蛋白,其色素輔基是含鐵的卟啉衍生物。Cyt-c在激活Caspases,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面具有重要意義。一旦Cyt-c釋放,就將激活細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)介導(dǎo)的DEVD (ASP-Glu-Val-ASP序列)特異的Caspase蛋白水解酶(DEVD-Specific protease),引起快速凋亡一種源于電子傳遞被阻斷的緩慢壞死過(guò)程而使細(xì)胞死亡[10]。在此過(guò)程中,Cyt-c與Apaf-1及dATP結(jié)合,繼之激活Caspase-9,然后這作為依賴Cyt-c的Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)的始動(dòng)因子,再先后激活Caspase-3以及Caspase- 2、6、8、10等效應(yīng)Caspase, 最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

Marsden等人[11]的研究顯示線粒體不是凋亡引發(fā)器,而具有某種擴(kuò)大Caspase級(jí)聯(lián)的作用。

本研究首次應(yīng)用宮內(nèi)窘迫HIBD大鼠進(jìn)行試驗(yàn),宮內(nèi)窘迫HIBD大鼠較以往的HIBD大鼠模型更好地模擬了新生兒缺血缺氧(HIE)的整個(gè)生理病理狀況[3],本次實(shí)驗(yàn)顯示,該模型腦組織神經(jīng)元中Cyt-c、Caspase-3的表達(dá)都明顯增加。

我們應(yīng)用靳三針療法對(duì)該模型進(jìn)行干預(yù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,各組Cyt-c的表達(dá)均有所下降,而Caspase-3的表達(dá)并無(wú)發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律;出生后第3天就開(kāi)始針刺的HIBD大鼠(針刺1組),Cyt-c、Caspase-3的表達(dá)都得到明顯的下調(diào)。我們的同期研究也提示,各針刺組凋亡細(xì)胞均有所減少,而針刺1組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,針刺1組的結(jié)果提示,在宮內(nèi)窘迫引起的HIBD發(fā)生后第3天起連續(xù)行靳三針療法,可以明顯抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[12],而針刺對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用很可能是通過(guò)下調(diào)Cyt-c、Caspase-3水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的,該結(jié)果與以往的研究結(jié)論[13]相近。其余針刺組均無(wú)出現(xiàn)Cyt-c、Caspase-3水平的同時(shí)下調(diào),提示及早對(duì)HIBD進(jìn)行針刺干預(yù)能明顯改善病情。

靳三針療法為主治療小兒腦病已有20余年,療效肯定,國(guó)家中醫(yī)藥管理局已將“靳三針治療兒童精神發(fā)育遲滯和兒童自閉癥臨床規(guī)范化研究”兩項(xiàng)成果作為臨床適宜療法向全國(guó)推廣[14-15]。目前對(duì)靳三針治療小兒腦病的臨床研究很多,對(duì)其作用機(jī)理的基礎(chǔ)研究較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,出生后3 d即進(jìn)行靳三針療法可以下調(diào)HIBD大鼠腦組織Cyt-c、Caspase-3的表達(dá)水平,并且初步提示,及早行靳三針療法可能通過(guò)抑制線粒體Cyt-c途徑的細(xì)胞凋亡而起到腦保護(hù)的作用。

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Effect of Jin’s Three-needle Scalp Electroacupuncture on Cyt-c and Caspase-3 Expressions in the Cerebral Cortex in Intrauterine Distress-induced HIBD Rats

1,2,-3,4,-5,6,-3,3,-7.

1.,510405,; 2.,510430,; 3.,510405,4.,528031,; 5.,510006,; 6.,510415,; 7.,510405,

Objective To investigate the effect of jin’s three-needle scalp electroacupuncture on Cyt-c and Caspase-3 expressions in the cerebral cortex in Intrauterine distress-induced HIBD rats and reveal the mechanism of its protective action on the brain. Method The abdomen was incised in a female SD rat at 21 days of pregnancy. Bilateral uterine horn blood vessels were tightly clamped with a hemostat for five minutes. An infant rat was then taken out by a cesarean section. A rat model of hypoxic-ischemic brain damage was confirmed by the use of a behavior test and brain tissue sections. The rats were randomized into model and acupuncture groups. The model group was not needled. Acupuncture groups 1, 2, 3 and 4 began to be needled at 3, 5, 7 and 14 days after birth, respectively. Acupuncture treatment was given for seven consecutive days. The normal control group was naturally delivered, not used to make a model and not needled. All groups of rats were decapitated to take the brain tissue at 21 days after birth. Cyt-c and Caspase-3 expressions in the cerebral cortex were detected. Result Cyt-c optical density value decreased somewhat in the four acupuncture groups; there was a statistically significant difference between acupuncture group 1 or 2 and the model group (＜0.05). Caspase-3 expression was significantly down-regulated in acupuncture group 1; there was a statistically significant difference compared with the model group (＜0.05). Conclusion The protective effect of acupuncture beginning at 3 days after birth on the brain is related to the down-regulation of Cyt-c and Caspase-3 expressions in intrauterine distress-induced HIBD rats.

Acupuncture; Jin’s three needles; HIBD; Cyt-c; Caspase-3; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.08.0794

2015-01-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81072878,81373713)

袁青(1961 - ),男,教授,碩士生導(dǎo)師

俞裕天(1987 - ),男,在站博士后,Email:195824064@qq.com