季輝,王玲玲,周攀,謝波

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不同灸溫對急性佐劑性關節(jié)炎大鼠血清IL-1b、IL-2及TNF-a含量的影響

季輝,王玲玲,周攀,謝波

(南京中醫(yī)藥大學,南京 210029)

目的 觀察不同灸溫下艾灸對于急性佐劑性關節(jié)炎大鼠血清IL-1b、IL-2及TNF-a含量的影響,為艾灸的局部抗炎免疫作用機制提供依據(jù)。方法 采用弗氏完全佐劑(FCA)造模法制備大鼠佐劑性關節(jié)炎模型(AA)。將32只SD大鼠隨機分出8只作為正常組,其余24只均造模處理,造模成功后隨機分為模型組、治療1組和治療2組,每組8只。治療1組和治療2組均采用灸法治療,治療1組將施灸穴位局部溫度控制在(38±1)℃,治療2組將施灸穴位局部溫度控制在(45±1)℃。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測大鼠血清 IL-1b、IL-2及TNF-a含量。結(jié)果 模型組、治療1組和治療2組血清IL-1b、IL-2及TNF-a含量與正常組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。治療1組血清IL-2含量與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學意義 (＜0.01)。治療2組血清IL-1b、IL-2及TNF-a含量與模型組和治療1組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。結(jié)論 艾灸具有降低血清中IL-1b、TNF-a含量,提高IL-2含量作用,且45℃灸溫能夠提高艾灸的作用。艾灸抗炎機制可能是通過降低血清中IL-1b、TNF-a含量,提高IL-2含量來緩解機體炎癥反應,且艾灸作用發(fā)揮需要適宜的灸溫。

針灸療法;灸法;灸溫;佐劑性關節(jié)炎;細胞因子;大鼠;IL-1b;IL-2;TNF-a

關節(jié)炎是現(xiàn)代醫(yī)學病名,屬中醫(yī)學“痹證”范疇。中醫(yī)痹證在臨床上涵蓋的疾病種類較多,且多與現(xiàn)代醫(yī)學中的風濕病(即自身免疫性疾病)有關,其中類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)等疾病的致殘率較高,局部關節(jié)“紅腫熱痛”為RA的主要癥狀。艾灸具有抗炎、抗感染的作用[1]。有研究[2]認為,炎癥反應與免疫應答密切相關。炎癥釋放的一些化學介質(zhì)與細胞因子有致炎作用,尤其是炎性細胞因子參與炎癥全過程[3]。唐照亮等[4]觀察艾灸腎俞穴對佐劑性關節(jié)炎大鼠的抗炎作用,得出艾灸可減輕大鼠炎癥反應,能消腫散瘀,防治多發(fā)性關節(jié)炎,具有明顯的抗炎作用。他們還對關節(jié)滑膜組織形態(tài)學進行了觀察,證實艾灸能減輕關節(jié)滑膜的充血水腫、滑膜細胞的增生、炎性細胞的浸潤等滲出性病變[5]。李曉泓等[6]研究表明艾灸能降低血清炎性細胞因子IL-1b與TNF-a的水平。

艾灸不僅具有抗炎的作用,還可以提高免疫應答水平,調(diào)整、催化和激活免疫功能,增強機體免疫抗炎能力,抗變態(tài)反應及抗衰老。在此,筆者建立免疫性炎癥——大鼠佐劑性關節(jié)炎模型(AA),探討不同灸溫對于急性佐劑性關節(jié)炎大鼠的抗炎作用的影響,為艾灸的局部抗炎免疫作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用雄性SD大鼠32只,體重為(200±20) g,清潔級,由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供[合格證SCXK(蘇)2008-0004]。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心(普通級)。動物在實驗前適應性馴養(yǎng)1星期,動物房溫度、濕度分別維持在25℃、70%左右。本實驗過程中對動物處置符合2006年科學技術部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要試劑及儀器

定制7 mm×200 mm動物用清艾灸條(南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠定制);弗氏完全佐劑(FCA)(美國SIGMA公司,10 mL,068K876)。主要儀器為YLS-7B足趾容積測量儀、TES測溫儀TES-1310(由南京中醫(yī)藥大學針藥結(jié)合實驗室提供)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

SD大鼠適應性馴養(yǎng)1星期后,按照《衛(wèi)生統(tǒng)計學》[7]隨機數(shù)字表隨機抽取8只為正常組。余大鼠均進行造模,造模成功后,隨機分為模型組、治療1組和治療2組,每組8只。實驗過程嚴格按實驗動物倫理學相關規(guī)定進行。

1.3.2 造模方法

選用FCA造模法,即無菌條件下將FCA注射入大鼠右后肢足墊部皮下,每只0.1 mL,以24 h出現(xiàn)足踝部明顯急性炎癥腫脹表示造模成功。正常組予同一部位每只注射生理鹽水0.1 mL。

1.3.3 干預方法

取大鼠雙側(cè)后三里、腎俞穴,穴位定位標準參照《實驗針灸學實驗指導及技能訓練》[8]。治療前,大鼠各穴區(qū)進行備皮,備皮面積約為1 cm×1 cm,腧穴用記號筆標記定位,在穴位皮膚上加用直徑為1 cm的圓孔形貼紙固定。造模成功后第2天起,用自制固定裝置固定大鼠,待大鼠安靜不掙扎后,進行艾灸治療。治療1組每穴局部艾灸10 min,采用雀啄灸,頻率約為120次/min,艾條距離腧穴的距離為(30±15) mm,用測溫儀測量皮膚溫度,將施灸穴位局部溫度控制在(38±1)℃。治療2組取穴及操作同治療1組,將施灸穴位局部溫度控制在(45±1)℃。兩組均連續(xù)治療5 d。

正常組與模型組作相同時長的固定,但不作艾灸治療。

1.4 檢測指標及方法

實驗結(jié)束當天,采用摘眼球取血法,收集全血于5 mL離心管內(nèi),靜置2 h后,4℃、3000 r/min離心15 min,分離血清,取血清分別置于相應號碼的1.5 mL EP管內(nèi),-20℃冰箱保存。采用ELISA法測定大鼠血清中IL-1b、IL-2及TNF-a的含量。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,定量統(tǒng)計使用檢驗和方差分析,組間比較使用單因素方差分析,組內(nèi)使用配對樣本比較。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

由表1可見,模型組、治療1組和治療2組血清IL-1b、IL-2及TNF-a含量與正常組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。治療1組血清IL-2含量與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。治療2組血清IL-1b、IL-2及TNF-a含量與模型組和治療1組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。

注:與正常組比較＜0.01;與模型組比較＜0.01;與治療1組比較＜0.01

3 討論

近年來細胞因子在炎癥中的作用備受關注。作為炎癥介質(zhì)的IL-1與TNF-可增高微血管壁通透性和趨化作用,激活炎性細胞,誘發(fā)溶酶體酶和前列腺素釋放,導致炎癥反應加重和發(fā)展。另外, IL-1與TNF-可誘導滑膜細胞增生,激活破骨細胞,引發(fā)軟骨的破壞,使RA加重、遷延或慢性化。而IL-2是主要由活化的CD4T細胞和CD8T細胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細胞因子,是所有T細胞亞群的生長因子,并可促進活化B細胞增殖,故為調(diào)控免疫應答的重要因子,也參與抗體反應、造血和腫瘤監(jiān)視。本實驗大鼠模型的病理改變與人類RA極為相似。從實驗中,筆者可以觀察到致炎后IL-1與TNF-含量增加,局部和全身炎癥反應加重,艾灸治療能降低IL-1與TNF-水平并趨向正常范圍,而IL-2的水平隨著艾灸治療逐步增多,故而減慢或阻斷了炎性細胞因子的致炎效應。其抑制途徑可能有受體阻止、表達抑制、信號傳導或細胞因子成熟調(diào)控等,有待進一步研究。炎性細胞因子參與許多自身免疫性疾病及其他炎性疾病的發(fā)病過程,特異性地抑制這些細胞因子中一種或者幾種在體內(nèi)的水平,艾灸將是治療這些疾病的一種有效手段,尤其灸溫在其中的影響甚大。

上述適宜的灸溫又是如何作用于人體發(fā)揮療效的呢?隨著生理學的重大突破,科學家發(fā)現(xiàn)在人體廣泛存在瞬時溫度感受器--TRP家族蛋白通道,艾灸機制研究也有了新的進展。不同的蛋白通道激活所需的溫度各不相同。TRPV1能被＞43℃的溫度激活;激活TRPV2所需的溫度閾值則為52℃;而TRPV3激活的溫度范圍是33℃～39℃。且其參與人體的各項重要生命活動。正是基于此,盧圣鋒等提出了以TRPV1為切入點來研究灸法溫熱效應作用機制的假說,這與古代的“火足氣到”思想也是相契合的。王耀帥研究灸溫熱刺激對心動過緩大鼠的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)46℃與38℃艾條溫和灸均能改善心動過緩型大鼠的心功能狀態(tài),并能加速普萘洛爾的代謝分布,46℃灸溫組的療效明顯優(yōu)于38℃灸溫組,38℃灸溫對皮膚組織形態(tài)的改變較弱,46℃灸溫則對皮膚組織形態(tài)的改變顯著,提示不同灸溫對皮膚組織結(jié)構(gòu)與細胞的影響不同。由此推論,艾灸起效與TRPV1有關,而TRPV1的激活可能是影響皮膚結(jié)構(gòu)形態(tài)的主要因素。張會芳等研究艾灸調(diào)脂通脈效應,發(fā)現(xiàn)45℃灸溫組降脂效果明顯優(yōu)于38℃灸溫組(＜0.05),并提出TRPV1是艾灸發(fā)揮溫熱效應的關鍵。

從本實驗結(jié)果可見,艾灸具有降低血清中IL-1、TNF-含量,提高IL-2含量作用,且45℃灸溫能夠提高艾灸的作用。艾灸抗炎機制可能是通過降低血清中IL-1、TNF-含量并提高IL-2含量來緩解機體炎癥反應,且從兩組治療組組間比較,可以得出適宜的溫度刺激是艾灸取效的關鍵因素,并由此推論,其啟動機制可能與TRPV1有關。對于艾灸溫通與TRPV1之間的聯(lián)系,今后我們應更為深入明確地探討與驗證。

[1] 唐照亮,宋小鴿,李俊,等.艾灸抗炎免疫作用的實驗觀察與分析[J].針刺研究, 1996,21(2):67-70.

[2] 徐叔云,魏偉,梁君山.我國抗炎免疫藥理研究現(xiàn)狀[J].中國藥理學通報,1992, 8(3):161-165.

[3] 畢涉,高驥援.炎癥與抗炎癥藥[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1993: 294.

[4] 唐照亮,宋小鴿,候正明,等.艾灸抗炎作用及對炎癥介質(zhì)影響的實驗研究[J].針刺研究,1999,24(3):212-215.

[5] 唐照亮,宋小鴿,王寧新,等.艾灸對佐劑性關節(jié)炎大鼠滑膜細胞凋亡及病理組織的觀察[J].中醫(yī)藥學刊,2004,22(2):226-227.

[6] 李曉泓,張露芬,郭順根,等.逆灸對隨后佐劑性關節(jié)炎大鼠早期及繼發(fā)期炎性細胞因子和局部足腫脹的影響[J].中國臨床康復,2005,9(15):123-125.

[7] 倪宗瓚.衛(wèi)生統(tǒng)計學[M].第4版,北京:人民衛(wèi)生出版社,2002: 267.

[8] 李忠仁.實驗針灸學實驗指導及技能訓練[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2007:62.

[9] 劉建民,王華,毛慧芳,等.“雙固一通”電針對老年陽虛模型大鼠淋巴細胞凋亡和促炎因子IL-6、IL-1的影響[J].上海針灸雜志, 2014,33(1):66-69.

[10] 樂薇,張紅星,王瓊,等.電針豐隆穴對高脂血癥大鼠血脂及肝臟組織炎癥細胞因子的調(diào)控作用[J].中國康復,2015,30(1):7-9.

[11] 郭愛松,劉春,李百勝,等.穴位埋線對失眠大鼠下丘腦單胺類遞質(zhì)及IL-1、TNF-含量的影響[J].上海針灸雜志,2014,33(7):672- 675.

[12] 戴紅,李娜,陳欣怡,等.玉液湯及其拆方對糖尿病大鼠炎性因子IL-1、IL-6、TNF-影響的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2015, 26(1):59-62.

[13] McHugh MD, Park J, Uhrich R, . Paracrine co-delivery of TGF-β and IL-2 using CD4-targeted nanoparticles for induction and mainten- ance of regulatory T cells[J]. Biomaterials, 2015, (59):172-181.

[14] Gaddipati S, Estrada K2, Rao P, . IL-2/anti-IL-2 antibody complex treatment inhibits the development but not the progression of herpetic stromal keratitis[J]. J Immunol, 2015, 194(1):273-282.

[15] McKinstry KK, Strutt TM1, Bautista B, . Effector CD4 T-cell transition to memory requires late cognate interactions that induce autocrine IL-2[J]. Nat Commun, 2014, (5):5377.

[16] 華毛,高芬,鄂偉建,等.高原地區(qū)T淋巴細胞亞群中CD分子百分率和IL-2水平變化在COPD發(fā)病中的意義[J].青海醫(yī)學院學報, 2012,33(2):118-120.

[17] St?nder S, Moormann C, Schumacher M, . Expression of vanilloid receptor subtype 1 in cutaneous sensory nerve fibers, mast cells, and epithelial cells of appendage structures[J]. Exp Dermatol, 2004,13 (3):129-139.

[18] 盧圣鋒,尹海燕,唐勇,等.瞬時感受器電位及其與艾灸溫熱效應機制研究結(jié)合的思考[J].針刺研究,2012,37(2):151-154.

[19] 王耀帥.艾灸以溫促通效應與TRPV1的相關性研究[D].南京中醫(yī)藥大學,2012.

[20] 張會芳,王玲玲,張建斌,等.艾灸溫通調(diào)脂臨床研究[J].世界中醫(yī)藥,2013,8(8):871-879.

[21] 李晶晶,林辰,方剛,等.壯醫(yī)藥線點灸對帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛患者血清細胞因子IL-1和IL-10的影響[J].中國皮膚性病學雜志, 2014,28(6):628-630.

[22] 李申林,李飛,燕煉鋼,等.隔物灸對創(chuàng)傷性膝關節(jié)炎兔血清中IL-1、TNF的影響[J].中醫(yī)藥臨床雜志,2011,23(1):57-60.

[23] 方剛,李靜,韓麗娟,等.壯醫(yī)藥線點灸療法對去卵巢家兔血清白細胞介素-2的影響[J].河北中醫(yī),2011,33(4):592-594.

[24] Aoki E, Kasahara T, Hagiwara H, . Electroacupuncture and moxi- bustion influence the lipopolysaccharide-induced TNF-alpha product- ion by macrophages[J]. In Vivo, 2005, 19(3):495-500.

Effect of Different Temperature Moxibustion on Serum IL-1, IL-2 and TNF- Contents in Acute Adjuvant Arthritis Rats

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Objective To investigate the effect of different temperature moxibustion on serum IL-1, IL-2 and TNF- contents in acute adjuvant arthritis rats and provide a basis for the mechanism of local anti-inflammatory and immune action of moxibustion. Methods A rat model of adjuvant arthritis (AA) was made by Freund’s complete adjuvant (FCA) modeling method. Of 32 SD rats, 8 were randomly selected as a normal group and the other 24 for model making. After successful model making, the rats were randomly allocated to model, treatment 1 and treatment 2 groups, 8 rats each. Treatment 1 and 2 groups received moxibustion. Local temperature at moxibustion point was controlled at (38±1)℃ in treatment 1 group and at (45±1)℃ in treatment 2 group. Rat serum IL-1, IL-2 and TNF- contents were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results There were statistically significant differences in serum IL-1, IL-2 and TNF- contents between the model, treatment 1 or treatment 2 group and the normal group (＜0.01). There was a statistically significant difference in serum IL-2 content between treatment 1 and the model groups (＜0.01). There were statistically significant differences in serum IL-1, IL-2 and TNF- contents between treatment 2 group and the model or treatment 1 group (＜0.01). Conclusions Moxibustion has a reducing effect on serum IL-1 and TNF- contents and a raising effect on IL-2 content. 45℃ moxibustion temperature can improve the effect of moxibustion. The anti-inflammatory action of moxibustion may be through the mechanism of reducing serum IL-1 and TNF- contents and raising IL-2 content, which relieve body inflammatory reaction. The action of moxibustion needs proper moxibustion temperature.

Acupuncture-moxibustion therapy; Moxibustion method; Moxibustion temperature; Adjuvant arthritis; Cytokine; Rat; IL-1; IL-2; TNF-

1005-0957(2015)07-0597-03

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.07.0597

國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目(2009CB522900);江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目(CXLX13_58)

季輝(1988 - ),男,2012級碩士生

2015-01-15