楚雄地區(qū)不同生境下何首烏中二苯乙烯苷HPLC測(cè)定*

魯菊芬，華燕，郭喬儀，王洪麗，張金渝

(1.云南省楚雄農(nóng)業(yè)學(xué)校，云南 楚雄 675000;2.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224;3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，650231)

1.概述

何首烏 (Polygonum multiflorum Thunb)為蓼科 (Polygonaceae)多年生纏繞藤本植物。性味甘、澀、微溫;根據(jù)炮制方法不同分為生首烏和制首烏。生首烏:具有潤(rùn)腸通便、解毒和截瘧的功效，用以治療腸燥便秘、瘧疾和瘡癰腫毒;制首烏:具有補(bǔ)益精血和固腎烏須的功效，用以治療肝腎不足、精髓虧虛所導(dǎo)致的眩暈耳鳴、重聽(tīng)、失眠、健忘、驚悸怔忡及須發(fā)早白。

何首烏的化學(xué)成分主要為蒽醌類化合物、二苯乙烯甙類化合物、聚合原花青素以及卵磷脂和微量元素。經(jīng)過(guò)藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)何首烏總結(jié)起來(lái)具有以下作用:抗衰老作用、對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用、對(duì)免疫系統(tǒng)的影響、降血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化作用 (血液循環(huán))、保肝作用、對(duì)心血管系統(tǒng)的作用、對(duì)內(nèi)分泌的影響、對(duì)腸蠕動(dòng)的影響等作用。

下面將采自云南楚雄市野生何首烏和來(lái)自楚雄農(nóng)校人工栽培2年何首烏做二苯乙烯苷測(cè)定。

2.材料與方法

具體方法按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2005版)要求進(jìn)行測(cè)定。

2.1 試驗(yàn)儀器及色譜條件

色譜條件:乙腈:水 (22:78);檢測(cè)波長(zhǎng):320nm;進(jìn)樣量:5ul;色譜儀:安捷倫1200系列;色譜柱:Eclipse XDB－C18(4.6*150mm，5um);柱溫:25℃。

2.2 試驗(yàn)材料

對(duì)照品:2，3，5，4，—四羥基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷，購(gòu)于中國(guó)藥品及生物制品檢定所，溶劑均為分析純，流動(dòng)相為色譜純。

1號(hào)樣品:野生何首烏，采自云南楚雄市，經(jīng)西南林業(yè)大學(xué)杜凡教授鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum的塊根。樣品粉碎后過(guò)60目篩網(wǎng)，于60℃干燥4h后置干燥器中備用。

2號(hào)樣品:2005年引自貴州凱里，生育期4個(gè)月零25天、高0.25～0.35m何首烏扦插苗在楚雄農(nóng)業(yè)學(xué)校人工栽培2年，樣品粉碎后過(guò)60目篩網(wǎng)，于60℃干燥4h后置干燥器中備用。

2.3 試驗(yàn)樣品的制備

供試品溶液:精密稱取何首烏超微粉0.1g，置于具塞錐形瓶中，加入20mL 70%乙醇，充分溶解，超聲振蕩30min，過(guò)濾，濾液置10mL容量瓶中，加70%乙醇，定容。作為供試品溶液，備用。

對(duì)照品溶液:精密稱定二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品50mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻。作為對(duì)照品溶液，備用。(每1mL中含二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品2mg)。

陰性樣品溶液:制備不含何首烏的陰性樣品，按供試品溶液制備的方法制備陰性溶液。即得。

2.4 試驗(yàn)方法與結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別取對(duì)照樣品、供試樣品1和供試樣品2溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，考察線性關(guān)系，做出何首烏標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

樣品測(cè)定:按照上述方法制備各樣品的何首烏供試樣品溶液，分別測(cè)定2，3，5，4，—四羥基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷。

3.結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

(1)最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定:精密稱定對(duì)照品溶液0.0，2.0mL，分別置10mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻。用1cm比色皿在波長(zhǎng)200－400nm區(qū)間以空白溶液為對(duì)照進(jìn)行掃描。

根據(jù)掃描曲線可知，二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品在波長(zhǎng)200－400nm區(qū)間有強(qiáng)吸收，最大吸收波長(zhǎng)為320 nm。故本試驗(yàn)選用320 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

(2)色譜條件:乙腈:水 (22:78);檢測(cè)波長(zhǎng):260nm;進(jìn)樣量:5ul;色譜儀:安捷倫1200系列;色譜柱:Eclipse XDB－C18(4.6*150mm，5um);柱溫:25℃。對(duì)照品、樣品色譜圖見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 二苯乙烯苷色譜圖

圖2 何首烏樣品1色譜圖

結(jié)果表明，在現(xiàn)行色譜條件下，二苯乙烯苷與其他組分得到很好分離，指標(biāo)成分色譜峰理論塔板數(shù)均不小于2000，指標(biāo)成分色譜峰與其他峰分離度均大于1.5。陰性樣品色譜圖在待測(cè)成分保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾。

(3)線性關(guān)系考察:精密稱取二苯乙烯苷對(duì)照品 (每1mL中含二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品2mg)溶液0.0、1.0、2.5、5、8、10 mL置6個(gè)10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容。在上述色譜條件下，每份3次，每次進(jìn)樣10 uL，以峰面積及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸。得回歸方程y=3533.9x–14.462，r=0.9998，線性范圍為0.2～2.0 mg/mL。

(4)精密度試驗(yàn):取二苯乙烯苷對(duì)照品溶液進(jìn)樣5 uL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，結(jié)果峰面積RSD%為1.07%。

(5)穩(wěn)定性試驗(yàn):取何首烏藥材提取液，置室內(nèi)自然光下方置，于0、4、6、8、12、24 h，測(cè)定峰面積，計(jì)算。結(jié)果藥材提取液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，二苯乙烯苷的RSD% 為2.14%。

圖4 何首烏的標(biāo)準(zhǔn)曲線

(6)重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一批樣品5份，制備供試品溶液，進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果二苯乙烯苷的RSD%為2.73。

3.2 樣品含量測(cè)定

取2個(gè)不同產(chǎn)地的何首烏樣品，按照前面的方法制備供試品溶液，每次進(jìn)樣5 uL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 何首烏中二苯乙烯苷的測(cè)定結(jié)果 (n=2)

上述通過(guò)對(duì)不同生境何首烏中二苯乙烯苷的HPLC測(cè)定結(jié)果表明，楚雄市野生何首烏和人工栽培何首烏藥材中2，3，5，4，—四羥基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷的含量差別很大，野生的為1.42%，而人工種植的為11.93%。由于所有的研究樣品均為何首烏的塊根，因此認(rèn)為其含量的差別和生境有關(guān)。

4.結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同生境下何首烏 (野生和家種)的有效成分含量測(cè)定，結(jié)果表明:產(chǎn)量、生長(zhǎng)期上人工種植兩年的相當(dāng)于野生8—10年何首烏;藥用價(jià)值上測(cè)定2，3，5，4—四羥基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷含量，人工栽培2年的比野生8～10年的高近8倍。因此，栽培和野生的其產(chǎn)量、生長(zhǎng)期及藥用價(jià)值相差甚大，人工科學(xué)規(guī)范化栽培何首烏具有極大的意義。

本文研究樣品產(chǎn)地來(lái)源明確，用藥典規(guī)定方法測(cè)定，結(jié)果具有代表性。以前有一些文獻(xiàn)研究報(bào)道了不同產(chǎn)地何首烏的塊根中二苯乙烯苷的HPLC測(cè)定，但對(duì)不同生境 (栽培環(huán)境)下2，3，5，4，—四羥基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷的含量不同，屬于首次研究，它將為今后開(kāi)展規(guī)范化、規(guī)模化種植和深入開(kāi)發(fā)何首烏資源有指導(dǎo)意義。

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