脾氣虛大鼠焦慮樣行為及其初步機(jī)制研究

劉文俊　柴紀(jì)嚴(yán)　謝鑫

[摘要]目的 研究脾氣虛大鼠焦慮程度的變化并探討其可能機(jī)制。方法 選取雄性SD大鼠16只，體質(zhì)量（200±10）g，將其隨機(jī)分為對照組和脾氣虛組（模型組），每組8只。曠場實(shí)驗(yàn)評價(jià)大鼠焦慮程度；ELISA法測定海馬組織ATP和縮膽囊素-8（CCK-8）含量；免疫組化法檢測海馬CCKB型受體（CCKBR）表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，模型組的焦慮程度顯著降低（P<0.01），海馬組織的ATP含量降低（P<0.05），海馬CCK-8水平變化不明顯（P>0.05），但其受體表達(dá)下降（P<0.05）。結(jié)論 脾氣虛時(shí)焦慮程度下降，其初步機(jī)制與海馬能量不足和CCKBR表達(dá)減少有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]脾氣虛；焦慮；縮膽囊素-8；縮膽囊素B受體；ATP

[中圖分類號] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）07（b）-0004-03

[Abstract]Objective To study the anxiety degree change of rats in spleen qi deficiency rat and discuss its initial mechanism.Methods 16 male SD rats with the body mass of （200±10）g were selected and they were randomly divided into the control group and spleen qi deficiency group （model group），and there were 8 rats in each group.Open-field test （OFT） was used to evaluate anxiety degree of rats.ELISA was chosen to measure ATP and CCK-8 concentrations in hippocampal tissue.Immunohistrochemical method was used to check CCKBR expression in hippocampal tissue.Results Compared with those in the control group，rat′s anxiety was reduced （P<0.01），hippocampal ATP level was decreased （P<0.05），hippocampal CCK-8 concentration was unchanged （P>0.05），hippocampal CCKBR expression was decreased （P<0.05） in the model group.Conclusion Anxiety in spleen qi deficiency is lower and its initial mechanism might involve in decrease of hippocampal ATP level and CCKR expression.

[Key words]Spleen qi deficiency；Anxiety；Cholecystokinin-8；CCKB receptor；ATP

焦慮是機(jī)體在適應(yīng)新環(huán)境過程中所表現(xiàn)出的一種基本情緒，具有一定的趨避性，適度焦慮具有保護(hù)意義。研究發(fā)現(xiàn)，海馬縮膽囊素（cholecystokinin，CCK）及其B型受體（CCK B receptor，CCKBR）與焦慮的形成關(guān)系密切[1-4]。中醫(yī)將焦慮歸屬神志范疇，由心所主，但也依賴于脾主運(yùn)化的功能，因?yàn)樯裰臼軞庋B(yǎng)，而脾為氣血生化之源，如果脾氣不足，則神失所養(yǎng)，焦慮程度勢必受到影響，但目前沒有相關(guān)報(bào)道。本研究首先觀察脾氣虛狀態(tài)下大鼠的焦慮樣行為變化，進(jìn)而圍繞海馬CCK及其受體表達(dá)探討其發(fā)生機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組

選取SPF級雄性SD大鼠16只，體質(zhì)量（200±10）g，購于本溪實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SCXK（遼）-2010-0001]，隨機(jī)分為對照組和脾氣虛組（模型組），每組8只。大鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SYXK（遼）-2013-000-9]，自由飲水進(jìn)食，18～23℃，相對濕度45%～55%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2脾氣虛模型的復(fù)制方法及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

模型組大鼠按文獻(xiàn)[5-6]方法復(fù)制和評價(jià)脾氣虛證模型，即15 d內(nèi)給予饑飽失常刺激（飽食1 d+禁食2 d，共5個(gè)循環(huán)），同時(shí)每日水溫35～37℃游泳至力竭，以大鼠出現(xiàn)消瘦、食少、神疲和乏力等表現(xiàn)為模型復(fù)制成功。

1.3大鼠焦慮程度評價(jià)

采用曠場實(shí)驗(yàn)（open-field test，OFT）法評價(jià)。將大鼠放入OFT-100大小鼠開場活動實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的箱體中心，記錄其5 min內(nèi)在不同區(qū)域的活動時(shí)間。將箱體底部分為25個(gè)小格，規(guī)定中間9格為中心區(qū)域，四角的四格為角落區(qū)域，其他12個(gè)格為周邊區(qū)域。焦慮程度=（角落活動時(shí)間+周邊活動時(shí)間）/中心活動時(shí)間[7-9]。徹底清潔箱體后，檢測下1只大鼠。

1.4海馬組織ATP和CCK-8含量檢測

采用ELISA法。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（3.5 ml/kg）后，取雙側(cè)海馬組織，按文獻(xiàn)[10]方法，應(yīng)用Bio-Rad美國伯樂iMark酶標(biāo)儀，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.5海馬CCKBR表達(dá)

采用免疫組化法。按文獻(xiàn)[11]方法，即制備海馬石蠟切片（4 μm）后，常規(guī)脫水，雙氧水封閉，PBS洗3 min×3次，檸檬酸緩沖液（0.01 mol/L，pH6.0），微波爐高火3 min，低火維持15 min，冷卻至室溫后PBS洗3 min×3次；滴加血清封閉液，37℃水浴30 min，棄血清，滴加兔抗大鼠CCKRB受體多克隆抗體（1∶300，三蒸水稀釋），4.0℃過夜；37℃水浴2 h；PBS洗3 min×3次，滴加羊抗兔IgG，37℃水浴30 min；PBS洗3 min×3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇二甲苯脫水，中性樹膠封片。陰性對照采用抗體稀釋液代替一抗，步驟同上。鏡下CCKBR陽性反應(yīng)物呈棕黃色，采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析其平均光密度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組大鼠焦慮程度的比較

由圖1和表1可見，對照組大鼠主要活動于角落和周邊區(qū)域，較少通過中心區(qū)域；與此相比，模型組大鼠在中心區(qū)域活動增加，活動時(shí)間顯著延長，角落活動時(shí)間明顯增加，周邊活動時(shí)間無明顯變化，但焦慮程度低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.2兩組大鼠海馬組織ATP和CCK水平及CCKBR表達(dá)的比較

與對照組比較，模型組海馬ATP含量和CCKBR表達(dá)低于對照組（均P<0.05），但CCK-8水平雖然減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

3討論

隨著焦慮癥發(fā)病率日漸提高，相應(yīng)的中醫(yī)研究和治療也成為社會需求[12-14]。但中醫(yī)典籍中無焦慮癥的明確記載，特別是目前尚不清楚五臟與焦慮的關(guān)系，因此開展相關(guān)研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

與焦慮癥不同，焦慮屬于一種具有適應(yīng)性意義的重要情感反應(yīng)，能夠提高大腦的反應(yīng)性和警覺性，協(xié)調(diào)機(jī)體各部分功能，以應(yīng)對威脅自身安全的危險(xiǎn)情景。焦慮雖屬于負(fù)性情緒，但其趨避特性可以讓機(jī)體遠(yuǎn)離危險(xiǎn)，因此具有重要的保護(hù)意義。檢測動物焦慮樣行為的方法較多，本研究選用了OFT。OFT可以檢測嚙齒類動物自發(fā)活動和探索行為，最初應(yīng)用于大鼠，后來逐步推廣到小鼠及其他動物，現(xiàn)在也多用于檢測大鼠的焦慮樣行為[15-17]。本研究觀察到，對照組大鼠進(jìn)入曠場后，因?qū)χ行目諘鐓^(qū)域存在畏懼，而更多地選擇活動于角落和周邊區(qū)域，即使通過中心區(qū)域也只是短暫停留，不會表現(xiàn)出較長時(shí)間的探究行為，產(chǎn)生較為明顯的趨避性，焦慮程度較高，顯示該組大鼠具有較為強(qiáng)烈的自我保護(hù)意識。

中醫(yī)將自然界中各種事物的運(yùn)動變化稱為“神”，即“陰陽不測謂之神”（《素問·天元紀(jì)大論》），并認(rèn)為心總管機(jī)體對外來刺激的應(yīng)答，即心主神志。心具有“任物”功能，即接受和處理外來信息，對外界變化作出相應(yīng)判斷，以形成精神、意識和思維等活動。不過，心還需要其他四臟支持，才能正常執(zhí)行“任物”功能，特別是脾化生氣血的功能。中醫(yī)認(rèn)為氣血為神的物質(zhì)基礎(chǔ)，如“血?dú)庹?，人之神”（《素問·八正神明論》，“血者，神氣也”（《靈樞·營衛(wèi)生會》），因此，只有脾運(yùn)正常，氣血化生充足，從而維持心主神志功能，以正?！叭挝铩保獠蛔銊t導(dǎo)致氣血化生不足，削弱心的“任物”能力，使其難以正確應(yīng)對外來刺激，引起機(jī)體功能紊亂，甚至危及生命，即“得神者昌，失神者亡”（《素問·移精變氣論》）。

鑒于脾主運(yùn)化功能是神志活動的基礎(chǔ)，本研究通過觀察脾氣虛大鼠的焦慮樣行為變化，探討脾與焦慮的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠進(jìn)入曠場后，其在中心區(qū)域活動時(shí)間明顯延長，而角落停留時(shí)間變短，焦慮程度顯著低于對照組。該組大鼠的上述表現(xiàn)提示，脾氣虛時(shí)機(jī)體處在新的環(huán)境中，對未知危險(xiǎn)的感知能力下降，不能正確應(yīng)對潛在危險(xiǎn)，自身保護(hù)能力不足。

海馬是行為和情緒形成的重要結(jié)構(gòu)，其神經(jīng)元功能狀態(tài)直接影響機(jī)體對外界的應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬ATP含量顯著低于對照組，提示海馬神經(jīng)元能量供給不足與脾氣虛時(shí)焦慮程度下降有關(guān)。許多研究認(rèn)為，ATP是氣血的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[18-19]，由此推測脾可以通過生成ATP的方式維持機(jī)體適度焦慮。此外，海馬神經(jīng)元的相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)在焦慮樣行為產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。CCK-8雖然首先發(fā)現(xiàn)于胃腸道，卻是廣泛分布于大腦的一種重要神經(jīng)肽，尤其以海馬結(jié)構(gòu)表達(dá)最為豐富。研究發(fā)現(xiàn)，CCK-8結(jié)合其受體后可以在認(rèn)知行為、攝食和學(xué)習(xí)記憶等方面扮演重要角色，而其在焦慮方面的作用尤受重視[1-4]。本研究結(jié)果顯示，模型組海馬組織CCK-8水平雖無明顯下降，但其受體表達(dá)顯著低于對照組，提示該受體介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元生物學(xué)效應(yīng)可能出現(xiàn)異常，其中可能涉及了行為和情緒的產(chǎn)生等，但詳細(xì)作用還需要后續(xù)工作證實(shí)。

綜上所述，脾氣虛可降低焦慮程度，其初步機(jī)制與海馬能量不足和CCKBR表達(dá)減少有關(guān)。

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（收稿日期：2017-06-05 本文編輯：許俊琴）