油樟葉總黃酮含量測定及其抗油脂氧化活性

杜永華　敖光輝　魏琴等

摘要： 采用雙波長分光光度法和單波長分光光度法測定油樟[Cinnamomum longepaniculatum （Gamble） N Chao]葉中總黃酮含量，采用烘箱貯藏法測定油樟葉總黃酮對豬油、菜籽油的抗氧化活性。結(jié)果表明，雙波長分光光度法、單波長分光光度法均可用于油樟葉總黃酮含量的測定，雙波長法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性、回收率更好，雙波長法測得脫脂油樟葉中總黃酮含量為19 21 mg/g。油樟葉總黃酮對豬油和菜籽油均具有一定的抗氧化活性，且呈濃度依賴性。

關(guān)鍵詞： 油樟；黃酮；雙波長分光光度法；抗油脂氧化

中圖分類號： R284 1；O657 32 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0308-03

油樟[Cinnamomum longepaniculatum （Gamble） N Chao]屬樟科樟屬香料植物，為中國特有樹種 ，主產(chǎn)于四川省宜賓市，其葉富含芳香油，已成為香料、醫(yī)藥、日用、化工產(chǎn)品的重要原料來源 [1-2]。目前對油樟葉資源的開發(fā)利用主要以提取芳香油為主，對提取芳香油后殘渣的開發(fā)利用較少，每年有大量廢葉殘渣被隨意拋棄，不僅浪費資源，而且破壞生態(tài)平衡 [3]。油樟葉提取芳香油后的殘渣具有多種生物活性，如抗微生物 [3]、抗癌 [4]、抗炎 [5]、鎮(zhèn)痛 [6]等。目前對提取芳香油后油樟葉渣的化學(xué)成分未見報道。黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗癌、抗炎、鎮(zhèn)痛、護肝、抗菌、抗病毒、防止動脈硬化等多種生物活性，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域 [7]。黃酮類化合物在抗油脂氧化方面有顯著效果，從植物中提取安全、天然的黃酮類物質(zhì)以取代人工合成抗氧化劑是油脂或含油食品添加劑的發(fā)展趨勢 [8-9]。本研究利用雙波長分光光度法測定油樟葉總黃酮含量，采用烘箱貯藏法測定其抗油脂氧化活性，旨在為綜合開發(fā)利用油樟資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1 1 材料

油樟葉采自四川省宜賓市翠屏區(qū)邱場鄉(xiāng)油樟種植基地。蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080—200707）；豬油（新鮮豬板油經(jīng)高溫濕法熬煉制備）、菜籽油（市售現(xiàn)場壓榨）均不含任何添加劑；其他化學(xué)試劑均為分析純。AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；LG-5A 真空冷凍干燥機（上海市離心機機械研究所有限公司）；HH4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市正基儀器有限公司）。

1 2 方法

1 2 1 油樟葉總黃酮的提取 將油樟葉用水上蒸餾法蒸餾3 h除去芳香油，殘渣于60 ℃烘干，粉碎，取60～80目油樟葉粉末，用石油醚（沸程30～60 ℃）索氏抽提1 h脫脂，殘渣 60 ℃ 烘干，稱取脫脂油樟葉粉10 g，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇300 mL，80 ℃水浴回流提取4 h，過濾濃縮至浸膏，加100 mL水溶解，用100 mL石油醚萃取，取水層定容至500 mL即得油樟葉總黃酮樣品測定液，將測定液用體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇醇沉（以沉淀形式除去多糖、蛋白、鞣質(zhì)等），過濾，濾液減壓濃縮至膏稠狀，真空冷凍干燥得油樟葉總黃酮粗品。

1 2 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1 2 2 1 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精確稱取120 ℃干燥至恒質(zhì)量的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品10 0 mg，置于50 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液溶解，用70%乙醇定容至刻度，搖勻即得0 2 mg/mL蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃冰箱保存待用。

1 2 2 2 顯色體系及測定方法 參考中國藥典槐花中總黃酮測定方法 [10]，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色體系進行顯色，分別精確吸取不同量的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液置于25 mL容量瓶中，均加水至6 0 mL，加5% NaNO2鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10% AI（NO3）3溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加1 mol/L NaOH溶液10 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑空白為參比溶液，在不同波長下測定吸光度。

1 2 2 3 測定波長、參比波長的選擇 分別吸取3 mL蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)液、3 mL樣品測定溶液，按上述顯色方法顯色，以試劑空白為參比溶液，在400～700 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描，選擇標(biāo)準(zhǔn)品液和樣品溶液顯色絡(luò)合物最大共同吸收波長為測定波長，選擇最大吸收波長下端某一點波長為參比波長 [11]。

1 2 2 4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精確吸取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液1 0、2 0、3 0、4 0、5 0、6 0 mL至25 mL容量瓶中，按上述顯色方法顯色后，分別在測定波長和參比波長下測定吸光度，求吸光度差ΔD（D測定波長-D參比波長），以ΔD為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性回歸方程。以在測定波長處的測定值為單波長分光光度法測定結(jié)果。

1 2 3 顯色穩(wěn)定性試驗 吸取樣品溶液2 mL至25 mL容量瓶中，按上述顯色方法顯色后，分別在室溫下放置0、30、60、90、120、150 min后測定吸光度差值ΔD，計算RSD值。

1 2 4 精密度試驗 分別精確吸取3 mL樣品溶液至5個25 mL容量瓶中，按上述顯色方法顯色后，測定吸光度差值ΔD，計算RSD值。

1 2 5 重現(xiàn)性試驗 精確稱取脫脂油樟葉粉末5 g，共5份，按油樟葉總黃酮的提取方法、顯色測定方法操作，分別測定吸光度差值ΔD，計算RSD值。

1 2 6 加標(biāo)回收率試驗 分別精確吸取3 mL已知濃度的樣品溶液至3個25 mL容量瓶中，各加1 mL蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述顯色方法顯色后，測定吸光度差值ΔD，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶液濃度，求平均回收率、RSD值。

1 2 7 樣品溶液的測定 精確吸取3 mL樣品溶液至25 mL容量瓶中，按上述顯色方法顯色后，測定吸光度差值ΔD，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算樣品中總黃酮含量，重復(fù)測定5次。

1 2 8 抗油脂氧化試驗 采用烘箱儲藏試驗法 [12]測定，稱取30 g豬油或菜籽油置于50 mL碘量瓶中，按0 08%、016%、0 32%、0 64%質(zhì)量百分比添加油樟葉總黃酮粗品，以0 02% 2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、0 08%抗壞血酸（維生素C）為陽性對照，以純豬油或菜籽油為空白對照，70 ℃ 加熱攪拌30 min充分混勻，置于（70±1） ℃烘箱中，每隔12 h攪拌1次，并交換在烘箱中的位置，每24 h參照GB/T 5009 37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》規(guī)定的方法測定油樣過氧化值（POV）。同時以BHT為協(xié)同增效劑，油樟葉黃酮和BHT分別按油樣質(zhì)量0 16%、0 02%加入油樣進行協(xié)同抗氧化試驗。參考GB 10146—2005《食用動物油脂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》、GB/T 5538—2005《動植物油脂 過氧化值測定》 對豬油、菜籽油POV的規(guī)定，設(shè)定豬油、菜籽油氧化誘導(dǎo)終點POV為0 2 g/100 g。將油脂的氧化過程歸為一級反應(yīng)，其反應(yīng)方程如下：

[JZ]lnC=-kt+lnC0。

式中：C為油脂氧化后的過氧化值，C0為油脂初始過氧化值，k為速率常數(shù)，t為時間。根據(jù)該方程求出油脂氧化速率常數(shù)k，由回歸方程計算出油脂POV達(dá)到0 2 g/100 g時的氧化誘導(dǎo)時間。

抗氧化保護系數(shù)（PF）是添加抗氧化劑的油脂氧化誘導(dǎo)時間與空白油脂的氧化誘導(dǎo)時間之比，表示抗氧化劑的抗油脂氧化作用強弱，PF越高，抗氧化作用越強。評價標(biāo)準(zhǔn)為PF=1，無抗氧化作用；2≥PF>1，有一定抗氧化作用；3≥PF>2，有明顯抗氧化作用；PF>3，有顯著抗氧化作用 [13-14]。

2 結(jié)果與分析

2 1 總黃酮含量的測定

由圖1可知，蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長為510 nm，樣品溶液的最大吸收波長發(fā)生了藍(lán)移，為490 nm，二者存在一定差異，可能由于樣品溶液中存在其他干擾成分導(dǎo)致吸收波長藍(lán)移。根據(jù)雙波長分光光度法波長選擇原則 [15]，樣品溶液在510 nm處也有較強吸收，選擇510 nm為測定波長，選擇其下端與蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品吸收曲線交叉處的等吸收點585 nm為參比波長。采用雙波長分光光度法、單波長分光光度法測定蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的r2分別為0 999 2、0 999 3，二者相近，可見在0 008 0～0 048 0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，2種方法測定蕓香苷的線性均良好（圖2）。雙波長法和單波長法的顯色穩(wěn)定性在0～150 min內(nèi)吸光度變化較大，樣品溶液吸光度RSD分別為7 48%、7 98%；0～60 min內(nèi)，樣品溶液吸光度RSD分別為4 51%、4 91%，表明在顯色0～60 min內(nèi)測定油樟葉總黃酮，2種方法的穩(wěn)定性均較好，但雙波長法優(yōu)于單波長法。精密度、重現(xiàn)性、加標(biāo)回收率試驗表明，雙波長法RSD均小于單波長法，但2種方法RSD均小于5%，加標(biāo)平均回收率分別為92 23%、90 11%?？梢?，測定油樟葉總黃酮2種方法顯色60 min內(nèi)穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性、回收率均較好，雙波長法比單波長法更準(zhǔn)確可靠。雙波長分光光度法測得脫脂油樟葉總黃酮提取液中總黃酮含量為19 21 mg/g，低于單波長法測得的含量（20 18 mg/g）（表1）。10 g脫脂油樟葉采用醇提法獲得總黃酮粗品382 mg，雙波長法測得其純度為3587 mg/g。孫崇魯?shù)炔捎谜辉囼炑芯苛伺c油樟同屬植物香樟[Cinnamomum camphora （Linn ） Presl]葉中總黃酮的提取工藝，其黃酮提取含量達(dá)39 68 mg/g [16]，高于本試驗制備的油樟葉中總黃酮含量，可見油樟葉總黃酮的提取工藝值得進一步研究。

2 2 抗油脂氧化試驗

由圖3、圖4可知，豬油、菜籽油經(jīng)高溫加速誘導(dǎo)后，隨著氧化時間的增加，各組POV值逐漸升高。豬油、菜籽油中添加不同濃度油樟葉總黃酮粗品后，相同時間內(nèi)加抗氧化劑油樣的POV值均低于純油空白組。同一時間下，隨著油樟葉總黃酮粗品添加量的增加，油樣POV值逐漸降低。由表2可知，添加抗氧化劑后，油樣氧化誘導(dǎo)時間、PF值均大于空白純油對照，測試濃度范圍內(nèi)抗氧化劑的PF值均大于1小于2，可見油樟葉總黃酮粗品對豬油、菜籽油均具有一定抗氧化活性，且有明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。0 08%油樟總黃酮對豬油、菜籽油的PF值與0 08%維生素C均相近，但較小，表明當(dāng)油樟葉總黃酮粗品添加量達(dá)到0 08%時，其對豬油和菜籽油的抗氧化活性與維生素C相當(dāng)，但活性較弱。0 32%油樟總黃酮對豬油的PF值與0 02%BHT相近，0 16%油樟總黃酮對菜籽油的PF值與0 02%BHT相近，表明油樟總黃酮對油脂的抗氧化活性與0 02%BHT相當(dāng)，在豬油中添加量需達(dá)到032%，在菜籽油中添加量需達(dá)到0 16%。當(dāng)油樟葉總黃酮添加量高于0 32%時，其對豬油、菜籽油的抗氧化活性強于0 02%BHT。油樟總黃酮低濃度添加量對豬油的PF值小于菜籽油，高濃度添加量（0 64%）則相反，表明油樟總黃酮中低濃度添加量對菜籽油的抗氧化效果好于豬油，高濃度添加量對豬油的抗氧化作用優(yōu)于菜籽油。

3 結(jié)論與討論

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色體系測定樣品中總黃酮含量較為常見，對于組分較復(fù)雜的樣品溶液，采用單波長測定方法容易引起干擾，雙波長測定法可消除共存組分的干擾，獲得更高的可靠性 [15，17]。本試驗結(jié)果表明，雙波長分光光度法、單波長分光度法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性、回收率均較好，2種方法均可用于油樟葉總黃酮含量的測定。但單波長測定法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性、回收率RSD值均高于雙波長測定法，測得樣品中總黃酮含量高于雙波長法，這可能是由于油樟總黃酮提取液中含有較多其他干擾組分，影響了顯色反應(yīng)體系，造成單波長法的可靠性偏低，測定結(jié)果偏高 [18]。測定液顯色后，與蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，油樟總黃酮提取液的吸收光譜發(fā)生一定程度藍(lán)移，這一現(xiàn)象也表明油樟葉提取液中可能含有較多干擾吸收的組分。因此，對于油樟葉提取液的總黃酮含量測定，采用雙波長法比單波長法能更好地消除復(fù)雜組分等背景干擾。雙波長分光光度法測得脫脂油樟葉總黃酮含量為19 21 mg/g，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為油樟葉總黃酮含量測定方法。黃酮類化合物可通過消除鐵、銅等金屬離子的催化作用來提高氧化反應(yīng)的活化能，從而阻礙氧化反應(yīng)；也可將氫供給脂肪自由基（R·）和過氧化自由基（ROO·）后轉(zhuǎn)變?yōu)榉踊杂苫ˋ·），分別生成脂肪分子（RH）、氫過氧化物（ROOH），酚基自由基能降低自動氧化連鎖反應(yīng)速度，從而抑制油脂進一步氧化 [18]。本試驗結(jié)果表明，油樟葉總黃酮對豬油、菜籽油均有一定抗氧化作用，具有一定量效關(guān)系。0 08%維生素C對豬油、菜籽油的抗氧化活性均較弱，可能是由于維生素C屬水溶性抗氧化劑，在油脂中溶解度低，有效濃度低導(dǎo)致抗油脂氧化活性弱。0 32%油樟總黃酮與0 02%BHT對豬油抗氧化作用相當(dāng)，0 16%油樟總黃酮與0 02%BHT對菜籽油抗氧化作用相當(dāng)；當(dāng)油樟葉總黃酮添加量高于0 32%時，其對豬油、菜籽油的抗氧化活性均強于0 02%BHT。油樟總黃酮與BHT聯(lián)合使用具有協(xié)同抗豬油、抗菜籽油氧化作用。

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