不同產(chǎn)區(qū)葡萄中多酚及原花青素含量差異的研究

齊巖　程安瑋　解紅霞等

摘要：研究了山東煙臺、河北沙城和云南香格里拉產(chǎn)地的赤霞珠葡萄籽和皮中多酚、類黃酮及原花青素的含量差異。多酚、類黃酮及原花青素的含量分別采用福林-酚、AlCl3及正丁醇-鹽酸法測定。結(jié)果表明，葡萄籽中的多酚、類黃酮及游離態(tài)和纖維素結(jié)合態(tài)原花青素的含量高于皮中的含量，而葡萄皮中蛋白結(jié)合態(tài)原花青素的含量高于籽中的含量。沙城產(chǎn)地的葡萄籽中多酚含量最高，而煙臺產(chǎn)地的皮中含量最高。云南產(chǎn)地的籽中類黃酮含量最高，而煙臺產(chǎn)地的皮中類黃酮含量最高。煙臺產(chǎn)地的籽和皮中游離態(tài)和纖維素結(jié)合態(tài)原花青素含量最高，而蛋白結(jié)合態(tài)原花青素含量各地之間沒有明顯差異，總原花青素含量以煙臺產(chǎn)地的最高。

關(guān)鍵詞：葡萄；多酚；類黃酮；原花青素；產(chǎn)區(qū)

中圖分類號：S663.101 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2015）08-0030-04

Abstract The content differences of polyphenols， flavonoids and proanthocyanidins （PC） in grape seeds and skins from Yantai of Shandong Province， Shacheng of Hebei Province and Shangri-La of Yunnan Province were studied in this paper with the cultivar Carbenet as material. The contents of polyphenols， flavonoids and PC were determined by Folin-phenol， AlCl3 and HCl-butanol methods， respectively. The results showed that the contents of polyphenols， flavonoids， free PC and fibre-binding PC in grape seeds were much higher than those in grape skins. However， the content of protein-binding PC in grape skins was higher than that in the seeds. The highest polyphenol content was detected in the grape seeds from Shacheng， and in the grape skins from Yantai. The highest flavonoids content was founded in the seeds from Yunnan and in the skins from Yantai. The highest contents of free and fibre-binding PC were detected in grape seeds and skins from Yantai， but there was no obvious difference in protein-binding PC between different production areas. The highest content of total PC was detected in Yantai grape.

Key words Grape； Polyphenol； Flavonoid； Proanthocyanidin； Production area

多酚廣泛存在于植物的根、莖、葉、果實等部位，被稱為“第七類營養(yǎng)素”，是分子結(jié)構(gòu)中有若干個酚性羥基植物成分的總稱，包括黃酮類、單寧類、酚酸類以及花色苷類等。葡萄中多酚、原花青素的含量非常高，主要存在于果皮和籽粒中，果肉中的含量非常低。多酚類化合物由于具有較強的抗氧化活性而被廣泛研究，具有防止慢性炎癥、心血管疾病、癌癥，降低膽固醇、解毒護肝等功效[1～3]。目前國內(nèi)外研究主要集中在葡萄多酚、原花青素等成分的提取工藝優(yōu)化以及其抗氧化活性等研究領(lǐng)域[4，5]。

原花青素主要以兩種形式存在，一是游離態(tài)原花青素，聚合度較低，可被有機溶劑（甲醇、乙醇、丙酮等）或水分離；二是結(jié)合態(tài)原花青素，常與蛋白質(zhì)/纖維素以氫鍵、離子鍵、疏水鍵、共價鍵等形式結(jié)合，聚合度較高，不易被有機溶劑或水提取，需要通過特殊的方法獲得。目前大部分文獻中有關(guān)原花青素的研究是指游離態(tài)，往往忽視了結(jié)合態(tài)（蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)、纖維素結(jié)合態(tài)）原花青素，實際上這些結(jié)合態(tài)的原花青素同游離態(tài)的一樣，具有明顯的生物活性。但目前有關(guān)結(jié)合態(tài)原花青素的研究非常少，特別是不同產(chǎn)地的葡萄皮、籽中這三種形態(tài)原花青素的含量差異更鮮見報道。本著這個目的，本試驗選取釀酒葡萄主產(chǎn)區(qū)山東煙臺、河北沙城和云南香格里拉的赤霞珠品種，對葡萄皮和籽中多酚、類黃酮、游離態(tài)原花青素、蛋白結(jié)合態(tài)原花青素、纖維素結(jié)合態(tài)原花青素的含量差異進行研究，以為葡萄酒生產(chǎn)及資源的合理利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄品種為赤霞珠，產(chǎn)地分別為云南的香格里拉、山東煙臺、河北沙城。將新鮮的葡萄皮和籽分離，60℃下鼓風(fēng)干燥至恒重，分別用粉碎機粉碎至粒度為80～100目備用。

1.2 儀器

AR423CN型電子天平，奧豪斯（上海）儀器有限公司；H-1107296型電熱恒溫水浴鍋、1012503型電熱恒溫干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SB25-12DTD型超聲波清洗機，寧波新藝生物科技有限公司；RF-5301PC型可見分光光度計，日本島津公司；CR22DIII型高速冷凍離心機，日立公司。endprint

1.3 試劑

2 mol/L福林-酚試劑、標(biāo)準品沒食子酸、蘆丁、原花青素B2來自Sigma公司；Na2CO3、SDS、正丁醇、乙酸、HCl、AlCl3、Tris均為分析純，來自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.4 提取及測定方法

1.4.1 葡萄皮和籽中多酚和類黃酮的提取 分別稱取0.5 g粉碎葡萄籽、葡萄皮于50 mL離心管，按料液比1∶40（g/mL）加入50%乙醇溶液20 mL，在400 W下常溫超聲1 h，8 000 r/min離心10 min，分離上清液和沉淀，沉淀中繼續(xù)加入50%乙醇溶液20 mL，重復(fù)提取一次，合并上清液，即為多酚和類黃酮提取液。

1.4.2 多酚含量的測定 采用Folin-phenol法測定[6]。取100 μL提取液加2 mL蒸餾水，然后加入200 μL福林-酚試劑混勻，靜置3 min后加入20%Na2CO3溶液900 μL混勻，在暗處放置2 h，并在765 nm處測定吸光度值。以沒食子酸為標(biāo)樣，在10～500 mg/L范圍內(nèi)制定標(biāo)準曲線（y=0.0032x+0.0431，R2=0.9924），計算提取液中多酚的含量。

1.4.3 類黃酮含量的測定 采用AlCl3法測定[7]。分別取1.5 mL葡萄皮和籽提取液與1.5 mL的2% AlCl3-甲醇溶液（含5%乙酸）混合，放置10 min，在430 nm處測定吸光度值，以蘆丁為標(biāo)樣，在10～500 mg/L范圍內(nèi)制定標(biāo)準曲線（y=0.0038x+0.027，R2=0.9990），計算提取液中類黃酮的含量。

1.4.4 原花青素的提取及測定[8] 游離態(tài)原花青素的提取及測定：取葡萄皮和籽各0.5 g，分別加20 mL 70%丙酮溶液，常溫下400 W超聲1 h，然后8 000 r/min離心10 min，分離上清液和沉淀，沉淀中繼續(xù)加入70%丙酮溶液20 mL，重復(fù)提取一次，合并上清液待測。取1 mL待測液與6 mL 95%正丁醇-鹽酸溶液混合搖勻，在100℃沸水浴中加熱1 h，取出冷卻到室溫，在550 nm處測定其吸光度值。以原花青素B2為標(biāo)準品，在10～500 mg/L范圍制備標(biāo)準曲線（y=0.003x-0.2025，R2=0.9989），根據(jù)標(biāo)準曲線計算原花青素含量。

蛋白結(jié)合態(tài)原花青素的提取及測定：上步剩余的葡萄皮和籽殘渣在60℃烘干，分別加入15 mL SDS混合液（稱取SDS 10 g和2-巰基乙醇50 g，用10 mmol/L Tris溶液定容到1 L），混勻，在100℃沸水浴中加熱60 min，取出冷卻后8 000 r/min離心10 min，然后再重復(fù)一次，上清液合并待測。取1 mL待測液與6 mL 95%正丁醇-鹽酸溶液混合搖勻，在100℃沸水浴中加熱45 min，取出冷卻到室溫，在550 nm處測定其吸光度。以原花青素B2為標(biāo)準品，在10～500 mg/L范圍制備標(biāo)準曲線（y=0.0013x+0.0216，R2=0.9991），根據(jù)標(biāo)準曲線計算蛋白結(jié)合態(tài)原花青素含量。

纖維素結(jié)合態(tài)原花青素的提取及測定：上步剩余的殘渣在60℃烘干，分別加入20 mL的95%正丁醇-鹽酸溶液和2 mL SDS混合液，在100℃沸水浴中加熱75 min，取出冷卻后8 000 r/min離心10 min，收集上清液在550 nm處測定其吸光度。以原花青素B2為標(biāo)樣，在10～500 mg/L范圍制備標(biāo)準曲線（y=0.0009x+0.0101，R2=0.9996），根據(jù)標(biāo)準曲線計算纖維素結(jié)合態(tài)原花青素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地的葡萄皮和籽中多酚含量差異

如圖1所示，葡萄籽中多酚含量明顯高于葡萄皮中的含量，葡萄籽多酚的含量在（78.95±0.84）～（95.40±3.22）mg/g，而葡萄皮中多酚的含量在（17.62±2.01）～（32.97±0.69）mg/g。葡萄籽中多酚含量是皮中的2.5～5.0倍。沙城產(chǎn)地的葡萄籽多酚含量最高，煙臺和云南產(chǎn)地的無明顯差異。而煙臺產(chǎn)地的葡萄皮多酚較其它兩個產(chǎn)地的高，云南和沙城兩產(chǎn)地的葡萄皮多酚含量無明顯差異。

2.2 不同產(chǎn)地的葡萄皮和籽中類黃酮含量差異

如圖2所示，和多酚一樣，葡萄籽中類黃酮含量明顯高于皮中的含量，籽中類黃酮含量在（41.85±7.82）～（57.54±1.87）mg/g，皮中含量在（9.55±0.32）～（14.75±0.25）mg/g，籽中含量為皮中含量的5～7倍。籽中類黃酮含量以云南產(chǎn)地的較高，但與沙城的差異不顯著，與煙臺的差異顯著，沙城和煙臺產(chǎn)地的類黃酮含量無明顯差異。皮中類黃酮含量以煙臺產(chǎn)地的最高，其次為沙城，云南產(chǎn)地的最低，三者之間差異顯著。

2.3 不同產(chǎn)地的葡萄皮和籽中原花青素含量差異

表1顯示，葡萄籽中游離態(tài)原花青素含量顯著高于皮中，且籽中游離態(tài)原花青素含量最高的為煙臺產(chǎn)地，其次為沙城，最低為云南產(chǎn)地；皮中含量最高的為煙臺產(chǎn)地，其次為云南，最低為沙城產(chǎn)地。

三產(chǎn)地葡萄籽和皮中纖維素結(jié)合態(tài)原花青素含量明顯高于蛋白結(jié)合態(tài)原花青素含量。葡萄籽和皮中纖維素結(jié)合態(tài)原花青素含量均以煙臺產(chǎn)地的最高，沙城和云南產(chǎn)地間無明顯差異。煙臺產(chǎn)地的葡萄籽和皮中纖維素結(jié)合態(tài)原花青素含量差異不顯著，其余兩個產(chǎn)地的籽中含量顯著高于皮中含量。蛋白結(jié)合態(tài)原花青素含量在三產(chǎn)地均為皮中含量顯著高于籽中含量，而籽和皮中含量在三地間分別差異不顯著。

三種形態(tài)的原花青素相加得到總花青素。葡萄籽和皮總原花青素含量均以煙臺產(chǎn)地的最高，云南和沙城產(chǎn)地的含量差異不顯著，且三產(chǎn)地均為籽中含量顯著高于皮中含量。

總的來說，煙臺產(chǎn)地的葡萄籽和皮中原花青素含量均最高，且云南和沙城兩產(chǎn)地差異不顯著。

3 結(jié)論與討論endprint

赤霞珠作為釀酒葡萄的主要品種，產(chǎn)地不同葡萄酒的品質(zhì)差別也很大，其中多酚、類黃酮、花青素等是葡萄酒中的主要活性成分，主要分布在葡萄籽和皮中，果肉中的含量很低。本試驗結(jié)果表明，葡萄籽中多酚和類黃酮含量明顯高于皮中含量。產(chǎn)地不同，多酚和類黃酮含量也有明顯差異。沙城葡萄籽中多酚含量最高，煙臺皮中多酚含量最高。云南和沙城產(chǎn)地葡萄的類黃酮含量無明顯差異，皮中以煙臺產(chǎn)地的最高。李春陽[8]研究結(jié)果也表明，葡萄籽中多酚和類黃酮含量遠遠大于皮和梗中含量，與本試驗結(jié)果一致。葡萄釀酒后籽中酚類物質(zhì)溶出很少，相比較皮中大部分多酚類物質(zhì)被溶解到酒中。

與蘋果、可可原花青素相比，葡萄籽中原花青素更復(fù)雜。原花青素主要是由兒茶素或表兒茶素組成，按聚合度大小，通常將兒茶素與表兒茶素形成的二～五聚體稱為低聚原花青素，將五聚體以上的稱為高聚原花青素。結(jié)合態(tài)原花青素聚合度較高，不易被有機溶劑或者水溶液提取出來，需要通過特殊方法獲得。在90～100℃沸水浴中，正丁醇-鹽酸溶液與原花青素反應(yīng)，可將多聚原花青素氧化降解，原花青素除末端單元結(jié)構(gòu)外，其他延伸端單元結(jié)構(gòu)均降解成花青素，通過測定降解形成的花青素含量就得到結(jié)合態(tài)原花青素含量。1980年Oh等明確提出多酚分子的芳香環(huán)能夠與蛋白分子中的疏水側(cè)鏈結(jié)合，并認為疏水鍵也是多酚-蛋白質(zhì)結(jié)合的主要形式[9]。1988年Haslam等系統(tǒng)提出了疏水鍵-氫鍵結(jié)合理論，較完善地解釋了多酚-蛋白反應(yīng)的分子機理[10]。

本試驗證實，葡萄籽中游離態(tài)原花青素含量明顯高于皮中含量，葡萄皮中蛋白質(zhì)含量要比籽中的高，相應(yīng)的葡萄皮中形成的蛋白結(jié)合態(tài)原花青素含量也明顯高于籽中含量；而葡萄籽中纖維素含量比皮中含量高，相應(yīng)的葡萄籽中形成的纖維素結(jié)合態(tài)原花青素比皮中高，這與李春陽[8]的試驗結(jié)果一致。煙臺產(chǎn)地的葡萄籽和皮中總原花青素含量明顯高于其它兩地，可能受光照、氣溫及土壤條件等多方面影響，尚待進一步研究。

參 考 文 獻：

[1] Ngamukote S， Mkynen K， Thilawech T. Cholesterol-lowering activity of the major polyphenols in grape seed [J]. Molecules， 2011， 16（6）：5054-5061.

[2] Preuss H G， Montamarry S， Echard B， et al. Long-term effects of chromium， grape seed extract， and zinc on various metabolic parameters of rats [J]. Molecular and Cellular Biochemistry， 2001， 223：95-102.

[3] Yamakoshi J， Saito M， Kataoka S， et al. Procyanidin-rich extract from grape seeds prevents cataract formation in hereditary cataractous （ICR/f） rats [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2002， 50（17）：4983-4988.

[4] 盧曉霆， 王田田， 王軍. 響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄籽多酚提取工藝[J]. 食品工業(yè)科技， 2013（24）：279-283.

[5] 焦淑萍， 倪海鏡， 薛麗娟. 山葡萄多酚對大鼠心肌線粒體氧化損傷的保護作用[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報， 2008， 34（1）：117-119.

[6] Slinkard K， Singleton V L. Total phenol analysis： and comparison with manual methods [J]. American Journal of Enology and Viticulture， 1977， 28： 49-55.

[7] Santas J， Carbo R， Gordon M H， et al. Comparison of the antioxidant activity of two Spanish onion varieties [J]. Food Chemistry， 2008， 107： 1210-1216.

[8] 李春陽. 葡萄籽中原花青素的提取純化及其結(jié)構(gòu)和功能研究[D]. 無錫： 江南大學(xué)， 2006.

[9] Oh H I， Hoff J E， Armstrong G S， et al. Hydrophobic interaction in tannin-protein complexes [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1980， 28：394-398.

[10]Haslam E. Tannins polyphenols and molecular complexion [J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)， 1992， 12（1）：1-23.endprint