7-羥基-4-甲基香豆素縮纈氨酸 鄰菲咯啉 銅對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其作用機(jī)制

虞浩，肖秀娣，徐雪松，李巧玉（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院.乳腺外科，.神經(jīng)外科，江蘇 鎮(zhèn)江 00）

7-羥基-4-甲基香豆素縮纈氨酸 鄰菲咯啉 銅對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其作用機(jī)制

虞浩1，肖秀娣1，徐雪松1，李巧玉2
（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1.乳腺外科，2.神經(jīng)外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002）

目的：研究7-羥基-4-甲基香豆素縮纈氨酸鄰菲咯啉 銅（縮氨基酸類銅）在體內(nèi)外對(duì)乳腺癌 MCF-7細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及作用機(jī)制。方法：采用 MTT、流式細(xì)胞儀及蛋白質(zhì)印跡法檢測不同濃度縮氨基酸類銅對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖及凋亡的影響。建立 MCF-7荷瘤裸鼠模型后，經(jīng)過縮氨基酸類銅的干預(yù)，繪制腫瘤生長曲線并計(jì)算抑瘤率，同時(shí)觀察荷瘤裸鼠的毒副反應(yīng)。結(jié)果：縮氨基酸類銅以濃度依賴性方式有效地抑制 MCF-7細(xì)胞增殖，抑制MCF-7細(xì)胞活力的 IC50為1.1 μmol/L；縮氨基酸類銅能以時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡（P＜0.05），且可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)p53、Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，縮氨基酸類銅體內(nèi)以濃度依賴性方式抑制乳腺癌 MCF-7移植瘤的生長（P＜0.05），未見明顯的毒副作用。結(jié)論:縮氨基酸類銅在體內(nèi)體外均可明顯抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長，抑癌作用可能是通過上調(diào) p53、Bax蛋白表達(dá)和下調(diào) Bcl-2蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

縮氨基酸類銅；乳腺癌；MCF-7；凋亡

［Abstract］Objective:To investigate the effect of the copper complexes with aromatic aldehyde derivatives，which was hereinafter referred to as aromatic aldehyde-copper drug，on breast cancer cell（MCF-7 cell line）in vivo and vitro and its mechanism of action.Methods:MCF-7 cells were treated with different concentrations of the aromatic aldehyde-copper drug，MTT assay was performed to determine cell ratio.Cell apoptosis were served by AnnexinV/PI flow cytometry.Western blotting was performed to evaluate the protein expression of p53，Bax and Bcl-2.The subcutaneous transplantable tumor model of MCF-7 cell in nude mice was established.The nude mice in each group received corresponding treated.The growth curves of the tumor were drawn and the tumor growth inhibition rates were calculated，and the toxic and side effort were observed too.Results:Aromatic aldehyde-copper drug effectively inhibited the proliferation of MCF-7 in a dose dependent manner，and the IC50was 1.1 μmol/L.Aromatic aldehyde-copper drug induced the apoptosis of MCF-7 cells in a time-dependent way（P＜0.05），which was accompanied with up-regulation of p53 and Bax expression，while Bcl-2 expression was down regulated.In vivo，aromatic aldehyde-copper effectively inhibited the growth of MCF-7 tumor in a dose dependent manner（P＜0.05）.There was no notable difference in the side effect.Conclusion:Aromatic aldehyde-copper drug may inhibit the proliferation of MCF-7 cells through inducing cell apoptosis，which should be related to the up-regulation of p53 and Bax，while down-regulated Bcl-2.

［Key words］aromatic aldehyde-copper drug；breast cancer；MCF-7；apoptosis

早在 20世紀(jì) 60年代，金屬配合物順式二氯二氨合鉑（順鉑）就被確認(rèn)為具有抗腫瘤活性的臨床藥物［1］。此后，鉑類抗癌藥逐漸成為研究的熱點(diǎn)，并已廣泛應(yīng)用于臨床，對(duì)肺癌、頭頸部惡性腫瘤等具有良好的治療效果。當(dāng)然，鉑類藥物亦有一些較為明顯的毒副反應(yīng)，如骨髓抑制、腎毒性、神經(jīng)毒性等。但隨著藥理作用的進(jìn)一步明確，眾多高效、低毒的具有抗癌活性的金屬配合物藥物不斷被研發(fā)和投入臨床應(yīng)用。

目前研究發(fā)現(xiàn)，含金屬縮氨基酸 鄰菲咯啉類銅藥物具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用［2-4］，其中Ranford等［5］制備的二價(jià)銅與 2，9-二甲基鄰菲咯啉形成的配合物作用最為突出，其細(xì)胞毒性與順鉑相似。

鑒于鉑類藥物較嚴(yán)重的毒性作用，具有良好抗腫瘤活性的含金屬縮氨基酸 鄰菲咯啉類銅藥物近年來已成為無機(jī)抗癌配合物研究的熱點(diǎn)。本研究初步觀察了7-羥基-4-甲基香豆素縮纈氨酸 鄰菲咯啉-銅（縮氨基酸類銅）體內(nèi)外的抗乳腺癌活性并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

縮氨基酸類銅為蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院惠贈(zèng)；乳腺癌 MCF-7細(xì)胞株購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；6孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為 Corning公司產(chǎn)品，Annexin V/PI試劑盒為 BD公司產(chǎn)品，MTT試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品，p53、Bax和 Bcl-2抗體購自圣克魯斯生物技術(shù)公司，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司。雌性BALB/c裸鼠4周齡，12～16 g，購自揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測 MCF-7細(xì)胞的增殖力 取對(duì)數(shù)生長期的 MCF-7細(xì)胞制成濃度約 1×105/mL單細(xì)胞懸液，接種于 96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，實(shí)驗(yàn)組共8個(gè)小組（分別加入 0.1，0.3，0.8，1.2，1.8，2.4，3.0，5.0 μmol/L的縮氨基酸類銅）；對(duì)照組不予以縮氨基酸類銅處理；調(diào)零組單獨(dú)加100 μL細(xì)胞培養(yǎng)基，每組設(shè) 3個(gè)平行孔。在 37℃，5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入 MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入 DMSO 100 μL，振蕩搖勻后，采用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在 570 nm波長的光密度（D）值，取每組 3個(gè)平行孔的平均值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率（inhibition ratio，IR）和半抑制濃度（50％inhibiting concentration，IC50）值。IR=［1-（實(shí)驗(yàn)組平均 D值 -調(diào)零組平均 D值）/（對(duì)照組平均D值-調(diào)零組平均D值）］×100％。IC50值的計(jì)算:用 Origin 7.0軟件的非線性擬合對(duì)縮氨基酸類銅的IR曲線進(jìn)行擬合，計(jì)算出當(dāng) IR為 50％時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度即為半抑制濃度 IC50。

1.2.2 AnnexinV/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長期的 MCF-7細(xì)胞，以1 μmol/L縮氨基酸類銅分別處理24和 48 h后棄上清，PBS洗 2次；制成濃度為1×106/mL的細(xì)胞懸液；吸取100 μL細(xì)胞到1.5 mL EP管，加入Annexin V和PI各5 μL進(jìn)行染色，室溫避光放置15～30 min，加入 400 μL結(jié)合緩沖液，采用流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡率，采用Cell Quest軟件系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測 p53、Bax和 Bcl-2蛋白的表達(dá)水平 取生長狀態(tài)良好的 MCF-7細(xì)胞以1× 106/mL接種于 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入1 μmol/L的縮氨基酸類銅，培養(yǎng) 24、48 h，用細(xì)胞裂解液提取蛋白，將樣品經(jīng)過 SDS-PAGE、電轉(zhuǎn)膜等后，分別用p53、Bax和 Bcl-2抗體對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。

1.2.4 腫瘤生長曲線及抑瘤率 將培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞制備成濃度為 5×106/mL細(xì)胞懸液，在每只裸鼠的背部皮下接種 0.1 mL。以皮下腫瘤結(jié)節(jié)直徑達(dá)0.5 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)，將達(dá)成瘤標(biāo)準(zhǔn)后的裸鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別予 0.5，1 mg/kg縮氨基酸類銅（用藥組）及 PBS（對(duì)照組）進(jìn)行腹腔注射，每周1次，共干預(yù)3次。每次用藥前用游標(biāo)卡尺測量腫瘤（包括皮膚厚度在內(nèi)）短徑（a）及長徑（b），末次用藥后1周及2周繼續(xù)測量瘤體大小。按下列公式計(jì)算瘤體體積:V=0.52×a2×b，并根據(jù)計(jì)算結(jié)果繪制腫瘤生長曲線。依據(jù)末次測量計(jì)算出的腫瘤體積計(jì)算抑瘤率，計(jì)算公式:抑瘤率 =（對(duì)照組平均腫瘤體積-用藥組平均腫瘤體積）/對(duì)照組平均腫瘤體積 ×100％。

1.2.5 不良反應(yīng)觀察 每日觀察裸鼠的一般情況，如精神狀態(tài)、毛發(fā)、食欲、活動(dòng)變化等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SAS 9.2軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后行單因素方差分析，兩兩比較使用 Dun-nett-t檢驗(yàn)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 縮氨基酸類銅對(duì) MCF-7細(xì)胞生長的抑制作用

MTT結(jié)果顯示，隨著作用時(shí)間的延長，縮氨基酸類銅對(duì) MCF-7細(xì)胞生長的抑制作用逐漸明顯，5 μmol/L時(shí)最大抑制率達(dá)到82.5％。其 IC50值均接近1.1 μmol/L。見圖1。

圖1 縮氨基酸類銅對(duì) MCF-7細(xì)胞生長的抑制率

2.2 Annexin V/PI雙染色分析

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，1 μmol/mL的縮氨基酸類銅作用于MCF-7細(xì)胞24，48 h及PBS對(duì)照組的凋亡率分別為 （25.68±6.38）％、（55.67± 9.45）％和（12.23±3.57）％。隨著干預(yù)時(shí)間延長，細(xì)胞的凋亡數(shù)明顯增多（F=32.375，P＜0.05）。見圖2。

圖2 Annexin V/PI檢測各組MCF-7細(xì)胞凋亡率

2.3 p53、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，縮氨基酸類銅（1 μmol/L）干預(yù) MCF-7細(xì)胞 24、48 h后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)p53、Bax蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減弱（圖3）。提示p53、Bax和Bcl-2表達(dá)的變化，可能參與了縮氨基酸類銅誘導(dǎo) MCF-7細(xì)胞的凋亡。

圖3 各組 MCF-7細(xì)胞 p53、Bax和 Bcl-2蛋白的表達(dá)

2.4 荷瘤裸鼠腫瘤生長曲線及抑瘤率

對(duì)瘤體體積的測量和計(jì)算結(jié)果顯示，縮氨基酸類銅可明顯抑制乳腺癌移植瘤生長，隨著藥物劑量增加，對(duì)腫瘤生長的抑制更為明顯（P＜0.05，圖4）。根據(jù)末次測量的腫瘤體積進(jìn)行計(jì)算，0.5 mg/kg縮氨基酸類銅組的抑瘤率為42.91％，1 mg/kg縮氨基酸類銅組的抑瘤率達(dá)58.84％。

圖43組裸鼠皮下腫瘤在體生長曲線

2.5 不良反應(yīng)觀察結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)過程中，治療組的所有荷瘤裸鼠一般精神狀態(tài)良好；活動(dòng)自如；皮毛柔順、光澤；未見明顯食欲減退；各組均無意外死亡小鼠。

3 討論

鉑類抗腫瘤藥進(jìn)入細(xì)胞核后與DNA作用，形成Pt-DNA化合物，繼而引起 DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄障礙，激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤的治療過程中發(fā)揮重要作用［6］。但是，鉑類藥物對(duì)腎臟、骨髓及神經(jīng)的毒性作用，特別是腫瘤細(xì)胞的耐藥性限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，尋找鉑類藥物的替代品就顯得十分的迫切。

多項(xiàng)研究［7-9］均證實(shí)銅有機(jī)金屬配合物是一種潛在的可替代鉑類化合物的抗腫瘤藥物。目前國內(nèi)外對(duì)縮氨基酸類銅的研究以體外抗腫瘤活性為主，暫未對(duì)其抗腫瘤機(jī)制及動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤作用進(jìn)行詳細(xì)探討，因此本研究初步探討其抗腫瘤機(jī)制及動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤效果。

凋亡是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性、病理性刺激信號(hào)產(chǎn)生的應(yīng)答有序的死亡過程，而細(xì)胞凋亡過程的失控導(dǎo)致細(xì)胞無限制的增殖是引起惡性腫瘤的一個(gè)重要原因。因此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是腫瘤治療中的一個(gè)有效的切入點(diǎn)，而且比直接殺傷腫瘤細(xì)胞更具有優(yōu)勢［10］?，F(xiàn)臨床上應(yīng)用的多種抗腫瘤藥物都具有一定的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用［11］，其機(jī)制考慮與以下幾個(gè)方面有關(guān):活性氧成分、活性金屬氧化物成分、核苷堿基的修改、脫氫或氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）以及質(zhì)子偶合電子轉(zhuǎn)移（PCET）等［12-13］。本研究通過體外AnnexinV/PI檢測，證實(shí)縮氨基酸類銅可以誘導(dǎo)乳腺癌 MCF-7細(xì)胞凋亡，而且隨著作用時(shí)間的延長，效果也越明顯。在荷瘤裸鼠模型中我們亦觀察到該藥物具有良好的體內(nèi)抑瘤效果。

有研究表明，原癌基因 Bcl-2蛋白家族與抑癌基因 p53是 重 要的 細(xì) 胞凋 亡 調(diào)節(jié) 因 子［14-15］。p53基因既可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，亦可以通過上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2或Bcl-xL，進(jìn)而影響細(xì)胞線粒體的通透性，從而影響下游的促凋亡基因的功能［14，16］。在本研究中，縮氨基酸類銅干預(yù)乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，而同時(shí)p53和 Bax蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，提示此通路的激活可能是縮氨基酸類銅誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究顯示縮氨基酸類銅在體內(nèi)外均具有較好的抗癌活性，為今后縮氨基酸類銅應(yīng)用于人類乳腺癌的治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在后續(xù)的研究中，我們將采用多種乳腺癌細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，全面評(píng)價(jià)縮氨基酸類銅的抗腫瘤活性。同時(shí)，我們將在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究縮氨基酸類銅的體內(nèi)分布，藥代動(dòng)力學(xué)以及不良反應(yīng)，為縮氨基酸類銅的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

［1］Rosenberg B，VanCamp L，Trosko JE，et al.Platinum compounds:a new class of potent antitumor agents［J］. Nature，1969，222（2）:385-386.

［2］Deegan C，McCann M，Devereux M，et al.In vitro cancer chemotherapeutic activity of 1，10-phenanthroline （phen），［Ag2（phen）3（mal）］.2H2O，［Cu（phen）2（mal）］.2H2O and［Mn（phen）2（mal）］.2H2O （malH2=malonic acid）using human cancer cells［J］. Cancer Lett，2007，247（2）:224-233.

［3］Devereux M，McCann M，O′Shea D，et al.Synthesis，superoxide dismutase mimetic and anticancer activities of metalcomplexes of2，2-dimethylpentanedioic acid （2dmepdaH2） and 3，3-dimethylpentanedioic acid （3dmepdaH2）:X-ray crystalstructures of［Cu （3dmepda）（bipy）］26H2O and［Cu（2dmepda）（bipy）（EtOH）］24EtOH（bipy=2，2′Bipyridine）［J］. Bioinorg Chem Appl，2006，80283:1-11.

［4］Jia L，Xu XM，Xu J，et al.Synthesis，characterization，cytotoxic activities，and DNA-binding studies of ternary copper（Ⅱ）complexes with new coumarin derivatives ［J］.Chem Pharm Bull，2010，58（8）:1003-1008.［5］Ranford JD，Salder PJ，Tocher DA.Cytotoxicity and antiviral activity of transition-metal salicylato complexes and crystal structure of Bis（diisopropylsalicylato）（1，10-phenanthroline）copper（Ⅱ）［J］.Chem Soc Dalton Trans，1993（22）:3393-3399.

［6］Siddik ZH.Cisplatin:mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance［J］.Oncogene，2003，22 （47）:7275-7279.

［7］Ramakrishnan S，Rajendiran V，Palaniandavar M，et al.Induction of cell death by ternary copper（Ⅱ）complexes of L-Tyrosine and diimines:role of coligands on DNA binding and cleavage and anticancer activity［J］. Inorg Chem，2009，48（4）:1309-1322.

［8］Goswami TK，Chakravarthi BV，Roy M，et al.Ferrocene-conjugated L-tryptophan copper（Ⅱ）complexes of phenanthroline bases showing DNA photocleavage activity and cytotoxicity［J］.Inorg Chem，2011，50（17）: 8452-8464.

［9］Ruíz P，Ortiz R，Perelló L，et al.Synthesis，structure，and nuclease properties of several binary and ternary complexes of copper（Ⅱ）with norfloxacin and 1，10 phenantroline［J］.J Inorg Biochem，2007，101:831-840.

［10〗 Zhang Z，Sobel RA，Cheng D，et al.Mild hypothermia in

creases Bcl-2 protein expression following global cerebral

ischemia［J］.Mol Brain Res，2001，95（1/2）:75-85. ［11］Eamshaw WC，Martins LM，Kaufmann SH.Mammalian caspases:structure，activation，substrates，and functions during apoptosis［M］.Annu Rev Biochem，1999，68:383-424.

［12］Burrows CJ，Muller JG.Oxidative nucleobase modifications leading to strand scission［J］.Chem Rev，1998，98 （3）:1109-1151.

［13］Pogozelski WK，Tullius TD.Oxidative strand scission of nucleic acids:routes initiated by hydrogen abstraction from the sugar moiety［J］.Chem Rev，1998，98（3）: 1089-1108.

［14］Chowdhury I，Tharakan B，Bhat GK.Current concepts in apoptosis:the physiological suicide program revisited ［J］.Cell Mol Biol Lett，2006，11（4）:506-525.

［15］Facoetti A，Ranza E，Nano R.Proliferation and programmed cell death:role of p53 protein in high and low grade astrocytoma［J］.Anticancer Res，2008，28（1A）: 15-19.

［16］Yu J，Zhang L.The transcriptional targets of p53 in apoptosis control［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，331（3）:851-858.

Effect and mechanism of the proliferation and apoptosis of the MCF-7 cells on copper complexes with aromatic dldehyde derivatives in vivo and vitro

YU Hao1，XIAO Xiu-di1，XU Xue-song1，LI Qiao-yu2
（1.Department of Breast Disease，2.Department of Neurosurgery，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

R979.1

A

1671-7783（2015）01-0049-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y140113

虞浩（1983—），男，江蘇鹽城人，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事乳腺癌的基礎(chǔ)及臨床研究；李巧玉（通訊作者），教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail:yuhao_1983@163.com

2014-04-29 ［編輯］陳海林