志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增方法的建立及應(yīng)用

王建昌,胡連霞,段永生,李 靜,王金鳳

(河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,河北石家莊050051)

志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增方法的建立及應(yīng)用

王建昌,胡連霞,段永生,李 靜,王金鳳*

(河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,河北石家莊050051)

以志賀氏菌ipaH基因特異序列為靶序列,設(shè)計(jì)RNA-DNA組合引物和鏈終止序列,優(yōu)化反應(yīng)體系,建立實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)志賀氏菌的方法,反應(yīng)時(shí)間為44 min。通過對(duì)4株不同群志賀氏菌和12株其他食源性致病菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè),結(jié)果表明,除4株志賀氏菌外,其他細(xì)菌均未擴(kuò)增出熒光曲線。進(jìn)一步研究表明,采用普通熱裂解法提取DNA,實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)福氏志賀氏菌DNA的靈敏度為1.16 fg/μL,純培養(yǎng)菌液的靈敏度為1.3 CFU/mL;對(duì)牛奶模擬樣品中福氏志賀氏菌的檢出限是1.8 CFU/mL。研究結(jié)果表明,實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)志賀氏菌靈敏度高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短、方法簡便。

實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增;志賀氏菌;ipaH基因

志賀氏菌(Shigella)是人類細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌,通稱痢疾桿菌,是一類具有高度傳染性和危害嚴(yán)重的革蘭氏陰性桿菌,長約2～3 μm,不形成芽孢,無莢膜,無鞭毛,有菌毛。志賀氏菌病常為食物爆發(fā)型或經(jīng)水傳播[1],人類對(duì)志賀氏菌普遍易感,每年全球有1.6億人患病,約有110萬人死亡,絕大多數(shù)為5歲以下兒童[2],10～100 CFU/mL細(xì)菌即可致病[3]。在發(fā)展中國家,由福氏志賀氏菌引起的感染性腹瀉疾病高居首位[4]。中國自2005年開始,在全國范圍內(nèi)開展菌痢的監(jiān)測(cè),該病的報(bào)告病例數(shù)一直高居全國甲乙類法定傳染病的前5位[5]。

目前,食品中志賀氏菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.5—2012[6],需要厭氧培養(yǎng)、分離、篩選和生化鑒定,檢測(cè)結(jié)果雖準(zhǔn)確,但操作煩瑣、檢測(cè)周期長,滿足不了快速檢測(cè)的需求。分子生物學(xué)技術(shù)因具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn),在食源性致病菌的檢測(cè)中發(fā)揮了巨大的作用,也被應(yīng)用于志賀氏菌的檢測(cè)。隨著食品安全檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的提高,尋找更加快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)技術(shù)顯得至關(guān)重要。

志賀氏菌屬分為痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)、福氏志賀氏菌(S.flexneri)、鮑氏志賀氏菌(S.boy dii)和宋內(nèi)氏志賀氏菌(S.sonnei)4個(gè)群。編碼侵襲性質(zhì)粒相關(guān)抗原H的片段基因(ipaH),決定志賀氏菌對(duì)大腸黏膜的上皮細(xì)胞侵襲能力,同時(shí),多拷貝存在于染色體和侵襲性大質(zhì)粒上,不隨傳代而丟失。以志賀氏菌ipaH基因保守序列為靶基因可將其與其他致病菌種屬區(qū)分開,又可以全部檢測(cè)出志賀氏菌4個(gè)群。

單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(single primer isothermal amplification,SPIA)是近年報(bào)道的一種新型線性核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)主要是通過一條3'端是DNA片段、5'端是RNA片段的組合引物、RNase H及具有強(qiáng)鏈置換活性的DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)DNA的體外線性等溫?cái)U(kuò)增,經(jīng)過RNA降解、新引物結(jié)合、鏈置換的循環(huán)過程,實(shí)現(xiàn)模板互補(bǔ)序列的快速擴(kuò)增,最終擴(kuò)增出大量的具有高度忠實(shí)性的cDNA單鏈[7-8]。

目前,國內(nèi)外關(guān)于SPIA方法的報(bào)道比較少,利用實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),建立實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)志賀氏菌方法,更未見到報(bào)道。Potash等[9]曾應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄SPIA技術(shù)研究從生物樣品中擴(kuò)增全基因組cDNA,并對(duì)重組病毒EcoHIV感染小鼠后感染應(yīng)激基因進(jìn)行了成功表達(dá)。Whitworth等[10]在分析豬胚胎不同發(fā)育階段基因表達(dá)差異時(shí),應(yīng)用美國NuGEN公司開發(fā)的Ribo-SPIA試劑盒進(jìn)行了mRNA的擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄。該Ribo-SPIA試劑盒能夠從低至1ng的總RNA模板中擴(kuò)增出106的cDNA產(chǎn)物。而本研究運(yùn)用SPIA技術(shù)基本原理,針對(duì)志賀氏菌ipaH基因保守序列設(shè)計(jì)特異性的RNA/DNA組合引物和終止序列Blocker,并在反應(yīng)體系中加入特異性結(jié)合單鏈DNA的SybergreenⅡ熒光染料,建立檢測(cè)志賀氏菌的實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增(realtime SPIA)方法,與實(shí)時(shí)熒光PCR方法相比,該方法靈敏度高,對(duì)模板質(zhì)量要求不高,擴(kuò)增時(shí)間短,適合于食品中致病菌現(xiàn)場(chǎng)快速篩選。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

本實(shí)驗(yàn)所用菌株見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株Tab. 1 Strains in this study

1.1.2 主要試劑

BstDNA聚合酶、RNase H、RNA酶抑制劑、MgCl2、dNTPs、SYBER GreenⅡ等,購自上海生工生物工程有限公司;基因組DNA提取試劑盒,購自北京天根生化科技有限公司;實(shí)驗(yàn)中所有培養(yǎng)基均購自北京陸橋有限責(zé)任公司;實(shí)驗(yàn)中所用到的牛奶樣品購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.1.3 主要設(shè)備

ABI7500型擴(kuò)增儀,美國AB公司;Whatman T Gradient基因擴(kuò)增儀,德國Biometra公司;Biophotometer plus核酸蛋白分析儀,德國Eppendorf公司。

1.1.4 RNA/DNA組合引物和Blocker的設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)Genebank中志賀氏菌ipaH基因(EU340151)已知序列,對(duì)其進(jìn)行同源性分析,確定其保守序列,用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)組合引物和相應(yīng)鏈終止序列,如表2。所有組合引物和Blocker均由大連Takara公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 志賀氏菌的培養(yǎng)

取保藏的福氏志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌在XLD瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線,培養(yǎng)箱36℃培養(yǎng)12 h,傳代培養(yǎng)2次。挑取傳代培養(yǎng)菌落接種至新鮮無菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,36℃過夜培養(yǎng)。

表2 實(shí)時(shí)熒光SPIA設(shè)計(jì)的引物Tab.2 Real-time fluorescence SPIA primer design

1.2.2 基因組DNA的提取

1)普通熱裂解法。取1 mL菌液5 000～8 000 r/min,離心5 min,棄上清液。加入200 uL無菌DEPC水,振蕩混勻,5 000～8 000 r/min,離心5 min,棄上清,重復(fù)操作一次。加入100 μL無菌DEPC水,振蕩混勻,100℃水浴10 min,12 000 r/min離心10 min,取上清液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)天根試劑盒法。按試劑盒說明書進(jìn)行基因組DNA的提取,并測(cè)定DNA濃度。

1.2.3 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法的建立

建立志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA反應(yīng)體系,總體積為25 μL,對(duì)反應(yīng)體系中RNA/DNA組合引物、Blocker、Bst DNA polymerase、RNaseH、dNTPs、MgCl2、RNase Inhibitor和SYBER GreenⅡ的使用濃度進(jìn)行優(yōu)化,確定各組分的最佳工作濃度,建立志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA優(yōu)化反應(yīng)體系。

將志賀氏菌基因組DNA模板、組合引物、Blocker及反應(yīng)緩沖液的混合液經(jīng)99℃,90 s處理后降溫至60℃,迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶,在ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀上55～65℃,反應(yīng)30～60 min,反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào),以期確定最佳反應(yīng)溫度,建立志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法。

1.2.4 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法的特異性分析

取表1中19株過夜培養(yǎng)菌懸液1 mL,用熱裂解法提取基因組DNA作為模板,根據(jù)1.2.3中所建立的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行檢測(cè),對(duì)所建立的實(shí)時(shí)熒光SPIA方法進(jìn)行特異性分析。

1.2.5 兩種基因組DNA提取方法對(duì)實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)結(jié)果的影響

使用1.2.2中兩種方法提取4株不同群志賀氏菌基因組DNA,每種方法各3個(gè)平行,作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè),分析不同的DNA提取方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

1.2.6 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法的靈敏性分析

以福氏志賀氏菌為檢測(cè)對(duì)象,對(duì)1.2.3中所建立方法的靈敏性進(jìn)行分析。挑取營養(yǎng)瓊脂上36℃培養(yǎng)12 h的福氏志賀氏菌單菌落,制備成一定濃度菌懸液。用生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋,采用稀釋平板法,測(cè)定其純培養(yǎng)物活菌數(shù)為1.3×108CFU/mL;同時(shí)取1 mL純培養(yǎng)物采用試劑盒法提取福氏志賀氏菌基因組DNA,測(cè)得DNA質(zhì)量濃度為116 mg/L,用滅菌DEPC水進(jìn)行10倍系列稀釋,進(jìn)行志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA方法的靈敏性試驗(yàn)。

1.2.7 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法在模擬樣品中檢出限分析

在牛奶中添加福氏志賀氏菌作為模擬污染樣品進(jìn)行檢出限分析。進(jìn)行添加前,牛奶樣品已按GB 4789.5—2012[6]常規(guī)檢驗(yàn)法證實(shí)志賀氏菌陰性。挑取在營養(yǎng)瓊脂36℃培養(yǎng)12 h的福氏志賀氏菌單菌落,制備成一定濃度菌懸液,用生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋后,選取系列稀釋濃度菌懸液1 mL分別添加到99 mL牛奶樣品中,混勻,分別取1 mL模擬樣品,采用稀釋平板法,測(cè)定其活菌添加范圍為1.8×105～1.8×10-2CFU/mL,直接用熱裂解法提取志賀氏菌基因組DNA,進(jìn)行志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA方法對(duì)模擬污染牛奶樣品的檢出限分析。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的建立

通過對(duì)反應(yīng)體系、反應(yīng)條件、組合引物及Blocker(Pzrn 2+Blocker 2)的優(yōu)化,志賀氏菌出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,如圖1。最終確定反應(yīng)條件為59.0℃,1 s;58.0℃,32 s;80個(gè)循環(huán),反應(yīng)時(shí)間為44 min。反應(yīng)體系為RNA/DNA組合Primer 5.6 μmol/L、Blocker 0.36 μmol/L、10×Bst Buffer 2.5 μL、Bst DNA polymerase 20 U、10×RNaseH Buffer 2.5 μL、RNaseH 5 U、dNTPs 0.2 mmol/L、MgCl23.5 mmol/L、RNase Inhibitor 16 U、DNA模板1 μL、SYBER GreenⅡ0.3 μL(300×稀釋),其余用滅菌DEPC水補(bǔ)足體系。

圖1 Pzrn 2和Blocker 2的實(shí)時(shí)熒光SPIA反應(yīng)結(jié)果Fig.1 Results of real-time fluorescence SPIA with Pzrn 2 Primer and Blocker 2

2.2 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法的特異性分析

建立的志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法具有良好的特異性,檢測(cè)結(jié)果如圖2。由圖2可見,4株志賀氏菌均出現(xiàn)典型的熒光擴(kuò)增曲線,其他細(xì)菌檢測(cè)均未產(chǎn)生擴(kuò)增曲線。

圖2 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA引物特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Specificity of real-time fluorescence SPIA for Shigella

2.3 不同模板DNA提取方法對(duì)志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)結(jié)果的影響

分別用熱裂解法、試劑盒法提取志賀氏菌模板DNA,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè),每種方法各做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,Ct值沒有明顯差異,結(jié)果如表3。表3表明,實(shí)時(shí)熒光SPIA方法檢測(cè)志賀氏菌對(duì)模板質(zhì)量要求不苛刻,能適應(yīng)廣大的基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

表3 不同模板DNA提取方法對(duì)志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)結(jié)果的影響Tab.3 Effects of different DNA extraction methods on results of real-time SPIA for Shigella

2.4 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法的靈敏度分析

根據(jù)2.1建立的實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法,進(jìn)行志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法的靈敏性實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖3。由圖3可見,當(dāng)DNA模板用量為1.16×103～1.16 fg/μL時(shí),即志賀氏菌濃度為1.3×103～1.3 CFU/mL時(shí),均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線;當(dāng)模板用量為0.116 fg/μL,即志賀氏菌濃度為0.13 CFU/mL時(shí),則無擴(kuò)增曲線。因此,志賀氏菌DNA的檢測(cè)靈敏度為1.16 fg/μL,對(duì)志賀氏菌菌液的檢測(cè)靈敏度為1.3 CFU/mL。

圖3 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法的靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity of real-time fluorescence SPIA detection of Shigella

2.5 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法在牛奶模擬樣品中的檢出限分析

根據(jù)2.1建立的實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法,進(jìn)行牛奶模擬樣品的檢出限分析,結(jié)果如圖4。由圖4可見,當(dāng)牛奶樣品中志賀氏菌濃度為1.8 CFU/mL時(shí),出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線;當(dāng)牛奶樣品中志賀氏菌濃度為0.18 CFU/mL時(shí),則無擴(kuò)增曲線。因此,志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法在牛奶模擬樣品中檢出限為1.8 CFU/mL。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖4 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法對(duì)模擬樣品中志賀氏菌的檢出限分析結(jié)果Fig.4 Detection limit of real-time fluorescence SPIA detection of Shigella in simulated sample

3 結(jié) 論

志賀氏菌屬的菌群分布在各地之間存在差異,在同一地區(qū)的不同年份其菌群分布也不盡相同。國外在20世紀(jì)40年代以前是A群占優(yōu)勢(shì),50年代以B群為主,而1965年后D群為主要菌群。自2005年以來,我國大部分省市分離的志賀氏菌以福氏志賀氏菌為主,而從2010—2011年的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)來看,宋內(nèi)志賀氏菌成了優(yōu)勢(shì)菌群,檢出率分別為70.59%和67.86%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過福氏志賀氏菌[11]。以志賀氏菌屬ipaH基因4個(gè)群保守序列,設(shè)計(jì)組合引物和鏈終止序列,建立的實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法對(duì)志賀氏菌屬的4個(gè)群均能檢出,檢測(cè)靈敏度較高,同時(shí)對(duì)模板DNA要求較低,能夠滿足各個(gè)地區(qū)和國家普及和推廣。

Igor等[12]研究發(fā)現(xiàn),10～100 CFU/mL的志賀氏菌就可引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),引起幼兒急性中毒性菌痢,而且死亡率高。我國吳平芳等[13]建立的改良分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系,對(duì)志賀氏菌DNA靈敏度為93 fg/μL,對(duì)其菌液靈敏度為64 CFU/mL。胡建華等[14]對(duì)培養(yǎng)液中及牛奶陽性樣品中的志賀氏菌采用常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR相結(jié)合進(jìn)行檢測(cè),在20 h內(nèi)檢測(cè)敏感度可達(dá)到2 CFU/mL。曾桂芬等[15]所建立的志賀氏菌LAMP檢測(cè)方法,對(duì)細(xì)菌純培養(yǎng)物和模擬食品的靈敏度分別為53,68 CFU/mL。本研究所建立的志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光SPIA方法,對(duì)志賀氏菌純培養(yǎng)的靈敏度為1.3 CFU/mL,對(duì)牛奶模擬污染樣品的檢出限是1.8 CFU/mL。因此,靈敏性和檢出限要高于實(shí)時(shí)熒光PCR和LAMP方法。

本研究依據(jù)SPIA的原理,在普通SPIA的基礎(chǔ)上,采用加入特異性結(jié)合單鏈DNA的熒光染料SYBER GreenⅡ,利用熒光PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增情況,建立了實(shí)時(shí)熒光SPIA檢測(cè)方法。本方法省去煩瑣的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)過程,比普通SPIA技術(shù)和PCR技術(shù)省時(shí)省力,成為可以替代PCR的核酸擴(kuò)增新技術(shù)。本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光SPIA方法反應(yīng)時(shí)間僅為44 min,對(duì)志賀氏菌純培養(yǎng)的靈敏度為1.3 CFU/mL,在檢測(cè)牛奶模擬污染樣品時(shí)其檢出限是1.8 CFU/mL,比LAMP法對(duì)志賀氏菌靈敏度和檢出限高1個(gè)數(shù)量級(jí),且對(duì)模板DNA質(zhì)量要求不高,所以易于在基層和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

隨著對(duì)SPIA技術(shù)研究的不斷深入,我們將不斷完善、發(fā)展這種新型的技術(shù),使之在食源性致病菌檢測(cè)方面發(fā)揮更大優(yōu)勢(shì),得到更全面的應(yīng)用。單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食源性致病菌的快速檢測(cè)方面將具有廣闊的應(yīng)用前景。

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[15] 曾桂芬,龍北國,姜容,等.LAMP和PCR法檢測(cè)痢疾志賀菌的特異性和靈敏性比較[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2012,12(5):547-549.

Establishment and Application of Real-time Fluorescence Single Primer Isothermal Amplification for Shigella

WANG Jianchang, HU Lianxia, DUAN Yongsheng, LI Jing, WANG Jinfeng*
(Technical Center of Inspection and Quarantine,Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shijiazhuang 050051,China)

Based on the Shigella ipaH gene,the RNA-DNA primers and Blockers were designed and synthetized,and the real-time fluorescence single primer isothermal amplification(real-time fluorescence SPIA)for the detection of Shigella was established.The reaction time of the method was 44 min.After detection of the 4 different Shigella group strains and 12 other food borne bacteria by the real-time fluorescent SPIA,the results showed that only the Shigella could be detected and showed the typical fluorescence curve.Further studies show that the sensitivity of the detection method for Shigella flexneri in pure culture was 1.16 fg/μL and 1.3 CFU/mL.The detection limit of Shigella flexneri in milk was 1.8 CFU/mL.The results demonstrate that the real-time fluorescence SPIA detection method for Shigella is highly sensitive,strong specific and much more convenient.

real-time fluorescence single primer isothermal amplification;Shigella;ipaH gene

TS207.4;R117

A

(責(zé)任編輯:葉紅波)

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.06.007

2095-6002(2015)06-0040-06

王建昌,胡連霞,段永生,等.志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增方法的建立及應(yīng)用[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2015,33(6):40-45.

WANG Jianchang,HU Lianxia,DUAN Yongsheng,et al.Establishment and application of real-time fluorescence single primer isothermal amplification for Shigella[J].Journal of Food Science and Technology,2015,33(6):40-45.

2015-03-04

質(zhì)檢公益性科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201210128;201310126)。

王建昌,男,獸醫(yī)師,博士,主要從事食源性微生物、動(dòng)物疫病病原分子生物學(xué)研究;

*王金鳳,女,獸醫(yī)師,碩士,主要從事食源性微生物、動(dòng)物疫病病原分子生物學(xué)研究。通信作者。