固定化風(fēng)味蛋白酶水解法生產(chǎn)高水解度大豆肽

師廣波,辛寒曉,馬艷芳,孫中濤,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東泰安 271018;2.山東佐田氏生物科技有限公司,山東濟(jì)南 250000)

固定化風(fēng)味蛋白酶水解法生產(chǎn)高水解度大豆肽

師廣波1,辛寒曉2,馬艷芳1,孫中濤1,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東泰安 271018;2.山東佐田氏生物科技有限公司,山東濟(jì)南 250000)

采用固定化風(fēng)味蛋白酶水解大豆蛋白生產(chǎn)大豆肽,以降低生產(chǎn)成本,同時(shí)提高水解度。通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對固定化風(fēng)味蛋白酶法生產(chǎn)大豆肽的條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,固定化風(fēng)味蛋白酶法生產(chǎn)大豆肽的優(yōu)化水解條件是65℃、pH值8.0、加酶量50 g/L,酶解7 h,水解度可達(dá)17.72%。固定化風(fēng)味蛋白酶重復(fù)使用7次,相對酶活力仍高達(dá)79.1%。交聯(lián)殼聚糖法制備的固定化風(fēng)味蛋白酶具有良好的穩(wěn)定性,可以重復(fù)多次使用,用于生產(chǎn)高水解度大豆肽是可行的,有利于降低生產(chǎn)成本。

大豆肽;風(fēng)味蛋白酶;固定化酶;球形交聯(lián)殼聚糖;響應(yīng)面法

大豆肽是以大豆蛋白為原料,采用酶解法或發(fā)酵法生產(chǎn)的肽類混合物,其主要成分是由2～10個(gè)氨基酸組成的分子質(zhì)量低于2 000 u的低聚肽[1-2]。大豆肽不僅具有大豆蛋白的營養(yǎng)學(xué)特性,還具有易溶于水、流動性好等理化特性和容易消化吸收、緩解疲勞、提高免疫力、降血糖、降血脂、降血壓、促進(jìn)脂肪代謝等生理特性[3-5],在功能性食品領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊,市場潛力巨大。

酶法生產(chǎn)大豆肽可采用單酶水解法或復(fù)合酶水解法。與單酶法相比,復(fù)合酶法具有收率高、水解度高、分子量低、生理活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用更為廣泛。堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶是最常用的蛋白酶,復(fù)合蛋白酶也是以其中兩種或多種按一定比例配制而成,其中堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶是最常用的組合[6-8]。與單酶水解法相比,同時(shí)或依次使用堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行水解,不僅可提高收率和水解度,還可以減輕大豆肽的苦味。與堿性蛋白酶相比,風(fēng)味蛋白酶價(jià)格昂貴。采用合適載體對風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行固定化,制成固定化酶,反復(fù)多次使用,有利于降低大豆肽的生產(chǎn)成本[9-11]。

本研究采用球形交聯(lián)殼聚糖法制備固定化風(fēng)味蛋白酶,并依次采用堿性蛋白酶和固定化風(fēng)味蛋白酶對大豆蛋白進(jìn)行水解制備高水解度大豆肽,優(yōu)化其水解條件,希望能為固定化風(fēng)味蛋白酶在大豆肽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆蛋白,山東萬得福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%;殼聚糖(脫乙酰度≥90.0%)與福林試劑,北京索萊寶科技有限公司;風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme 500MG)與堿性蛋白酶(2.0×106U/g),諾維信生物技術(shù)有限公司;戊二醛(25%水溶液),中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

DHZ-D型恒溫振蕩器,蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;PHSJ-4A型pH計(jì),上海雷磁儀器廠;Spectrumlab S22型可見分光光度計(jì),上海棱光技術(shù)有限公司;JA1003型電子天平,上海恒平科學(xué)儀器有限公司;循環(huán)水式真空泵,鞏義市予華儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 固定化風(fēng)味蛋白酶的制備

固定化風(fēng)味蛋白酶的制備采用交聯(lián)殼聚糖法[12-13]。準(zhǔn)確稱取2.5 g殼聚糖,溶于100 mL體積比為2%的冰乙酸溶液中,逐滴滴入3%的NaOH溶液中,靜置2 h使殼聚糖載體硬化,濾出并洗至中性,再置于質(zhì)量比為0.5%的戊二醛溶液中反應(yīng)6 h進(jìn)行交聯(lián),濾出并洗去戊二醛殘液,即制得活化的殼聚糖載體。將載體加入風(fēng)味蛋白酶溶液中,于4℃固定化反應(yīng)12 h,濾出并洗去殘余酶液,即得固定化風(fēng)味蛋白酶,置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。風(fēng)味蛋白酶活力的測定采用福林酚法(GB/T 23527—2009)。

1.3.2 大豆蛋白的水解[14]

準(zhǔn)確稱取10 g大豆蛋白,置于250 mL具塞三角瓶中,加入90 mL去離子水,攪勻,90℃水浴加熱5 min使蛋白質(zhì)適度變性,冷卻后加入質(zhì)量比為1%(以大豆蛋白的質(zhì)量計(jì))的堿性蛋白酶,放入搖床中于55℃、150 r·min-1水解4 h,然后加熱至90℃并保溫10 min進(jìn)行滅酶。酶解液真空抽濾,濾液采用固定化風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)水解,水解結(jié)束后,濾出固定化風(fēng)味蛋白酶,置于4℃冰箱中保存,以備重復(fù)使用,濾液用于測定水解度。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

依次采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對固定化風(fēng)味蛋白酶的水解溫度、pH值、時(shí)間、加酶量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,即每次改變一個(gè)參數(shù),分別在不同的水解溫度(35～85℃)、pH值(6.5～9.0)、時(shí)間(1～10 h)、加酶量(20～70 g/L)等條件下按照1.3.2進(jìn)行水解,并測定水解度,以確定各參數(shù)的優(yōu)化值。

1.3.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對固定化風(fēng)味蛋白酶的水解時(shí)間、水解溫度和加酶量等3個(gè)主要因素進(jìn)一步優(yōu)化。利用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析,實(shí)驗(yàn)因素及其水平見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的因素與水平Tab.1 Experimental factors and levels of Box-Behnken design

1.3.5 水解度的測定[15]

水解度(degree of hydrolysis,DH)是指水解過程中蛋白質(zhì)中肽鍵斷裂的百分?jǐn)?shù),可通過測定水解產(chǎn)物的α-氨基氮含量進(jìn)行計(jì)算,見式(1)。α-氨基氮含量的測定采用茚三酮法[16],總氮含量的測定采用凱氏定氮法[17]。

1.3.6 重復(fù)使用次數(shù)對固定化風(fēng)味蛋白酶活力的影響實(shí)驗(yàn)

在所優(yōu)化的條件下,按1.3.2反復(fù)多次進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn),每次反應(yīng)結(jié)束后,將固定化風(fēng)味蛋白酶濾出并洗凈,重新置于新鮮的反應(yīng)體系中進(jìn)行下一次水解實(shí)驗(yàn)。每次水解實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對固定化風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶活力測定,以評價(jià)其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解溫度對水解度的影響

水解溫度對大豆肽水解度的影響結(jié)果如圖1。由圖1可見,溫度在35～65℃變化時(shí),水解度隨著溫度的升高而增大,并在65℃時(shí)達(dá)到最大值,此后再提高水解溫度,水解度反而降低,但水解溫度為55～75℃均能保持較高的水解度,這說明固定化風(fēng)味蛋白酶熱穩(wěn)定性較好,在工業(yè)應(yīng)用中可承受較大的溫度波動。固定化風(fēng)味蛋白酶水解大豆蛋白的最適溫度為65℃,這與李峰等[18]報(bào)道的游離風(fēng)味蛋白酶的最適溫度55℃相比提高了10℃,其原因可能是酶分子與載體結(jié)合后,熱穩(wěn)定性提高,熱失活速率下降。最適反應(yīng)溫度升高,使酶與底物結(jié)合頻率提高,水解速度加快,有利于提高工業(yè)生產(chǎn)效率。

圖1 水解溫度與大豆肽水解度的關(guān)系Fig.1 Effect of temperature on DH of soybean peptides

2.2 pH值對水解度的影響

pH值對大豆肽水解度的影響結(jié)果如圖2。在pH值為6.5～8.0時(shí),隨著pH值的升高,水解度增加,并在pH值為8.0時(shí)達(dá)到最大值。在pH值為7.5～8.5時(shí),水解度均能保持較高水平。固定化風(fēng)味蛋白酶水解大豆蛋白時(shí)最適pH值為8.0,這與李峰等[18]和蔡高峰等[19]報(bào)道的游離風(fēng)味蛋白酶的最適pH值相比提高了0.5,且最適pH值范圍更寬,這在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。

圖2 pH值與大豆肽水解度的關(guān)系Fig.2 Effect of pH on DH of soybean peptides

2.3 加酶量對大豆肽水解度的影響

固定化風(fēng)味蛋白酶的使用量對大豆肽水解度的影響結(jié)果如圖3。由圖3可見,加酶量較小時(shí),水解度隨加酶量的增加而迅速增大,加酶量達(dá)到50 g/L后再增大加酶量,水解度不再明顯增大。其原因是加酶量較低時(shí),增加酶的用量可以提高酶與底物的結(jié)合頻率,水解速度加快;隨著加酶量的提高,酶與底物的結(jié)合趨于飽和,酶濃度不再是水解反應(yīng)的限速因素。因此,宜選擇50 g/L為最適加酶量。

2.4 水解時(shí)間與大豆肽水解度的關(guān)系

水解時(shí)間對大豆肽水解度的影響結(jié)果如圖4。由圖4可見,隨著水解時(shí)間的延長水解度逐漸增加,7 h后,水解度的增加不再明顯,酶解效率降低,因此,最適水解時(shí)間為7 h。

2.5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

圖3 加酶量與大豆肽水解度的關(guān)系Fig.3 Effect of enzyme dosage on DH of soybean peptides

圖4 水解時(shí)間與大豆肽水解度的關(guān)系Fig.4 Effect of hydrolysis time on DH of soybean peptides

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。利用Design Expert 8.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析,僅考慮對響應(yīng)值影響顯著的各項(xiàng),得到水解時(shí)間(X1)、水解溫度(X2)及加酶量(X3)與水解度(Y1)間的二次多項(xiàng)回歸方程,見式(2)。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Box-Behnken design and experimental results

對回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表3。由表3可知,該回歸模型極顯著(P＜0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05),說明該模型有較好的擬合度。模型一次項(xiàng)中X1與X2影響極顯著(P＜0.01),X3影響顯著(P＜0.05);二次項(xiàng)中,X1影響極顯著(P＜0.01),X2影響顯著(P＜0.05),X3不顯著(P＞0.05);交互項(xiàng)均不顯著(P＞0.05)。模型的決定系數(shù)R2=0.975 3,表明響應(yīng)值的變化有97.53%來源于所選變量,這說明該模型能很好地反應(yīng)水解溫度、時(shí)間和加酶量對水解度的影響,能夠準(zhǔn)確描述與預(yù)測大豆蛋白的酶解過程。

表3 回歸模型的方差分析Tab.3 Analysis of variance for fitted regression model

利用Design Expert 8.0軟件繪制出的響應(yīng)面圖可以更直觀地描述X1、X2和X3等3個(gè)因素對水解度的影響,結(jié)果如圖5。通過響應(yīng)面圖可以對各因素的交互影響進(jìn)行分析與評價(jià),預(yù)測水解度的最大值,并確定各因素的最佳水平。模型預(yù)測的各因素最佳水平的編碼值分別為X1=0.32,X2=0.21,X3=0.38,與其相對應(yīng)的真實(shí)值分別為時(shí)間7.27 h、溫度65.19℃、加酶量54.63 g/L。在此最優(yōu)條件下,模型預(yù)測的水解度最大值為17.39%。為驗(yàn)證模型預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性,在圓整條件下進(jìn)行了3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),即:水解時(shí)間7 h、溫度65℃、加酶量50 g/L。水解度的實(shí)測值為17.72%±0.31%,與預(yù)測值相差較小,這說明該模型是準(zhǔn)確有效的。酶水解法生產(chǎn)的大豆肽,水解度一般在5%～17%[6,8,14,19-21],相比之下,堿性蛋白酶-固定化風(fēng)味蛋白酶依次酶解也可以獲得較高的水解度,達(dá)到了堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶同時(shí)或依次水解的生產(chǎn)水平。

圖5 溫度、時(shí)間和加酶量等因素對大豆肽水解度的交互影響Fig.5 Response surface plots showing interactive effect of temperature,hydrolysis time and enzyme dosage on DH of soybean peptides

2.6 重復(fù)使用次數(shù)對固定化風(fēng)味蛋白酶活力的影響

酶解結(jié)束后,固定化風(fēng)味蛋白酶可以方便地從水解體系中回收并重復(fù)使用。重復(fù)使用次數(shù)對固定化風(fēng)味蛋白酶活力的影響結(jié)果如圖6。由圖6可見,隨著使用次數(shù)的增加,相對酶活力逐漸降低。重復(fù)使用7次,相對酶活力仍高達(dá)79.1%,這說明固定化風(fēng)味蛋白酶具有良好的穩(wěn)定性。重復(fù)使用7次之后,如果再繼續(xù)重復(fù)使用,不僅相對酶活力下降較快,球狀載體的破碎率也越來越高,因此,在大豆肽生產(chǎn)中,固定化風(fēng)味蛋白酶以重復(fù)使用7次為宜。

圖6 重復(fù)使用次數(shù)與固定化風(fēng)味蛋白酶活力的關(guān)系Fig.6 Effect of reusing times on the activity of immobilized Flavourzyme

3 結(jié) 論

堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶是大豆肽生產(chǎn)中最常用的兩種蛋白酶,二者同時(shí)或依次水解可以提高大豆肽的水解度。采用交聯(lián)殼聚糖法將風(fēng)味蛋白酶制備成固定化酶,可以重復(fù)多次使用,有利于降低生產(chǎn)成本。大豆蛋白水溶性差,直接采用固定化酶水解時(shí),底物分子不能進(jìn)入固定化酶的內(nèi)部,反應(yīng)速度很慢。依次采用堿性蛋白酶與固定化風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行水解,堿性蛋白酶將大豆蛋白水解成可溶性的胨和肽,再采用固定化風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行水解,底物可擴(kuò)散入固定化載體的內(nèi)部,水解速度提高。研究結(jié)果表明,固定化風(fēng)味蛋白酶的優(yōu)化水解條件是65℃、pH值8.0、加酶量50 g/L,酶解7 h,水解度可達(dá)17.72%。固定化風(fēng)味蛋白酶具有良好的穩(wěn)定性,重復(fù)使用7次,相對酶活力仍高達(dá)79.1%。因此,固定化風(fēng)味蛋白酶用于高水解度大豆肽的生產(chǎn)具有技術(shù)和經(jīng)濟(jì)上的可行性。

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Production of Soybean Peptide with High Degree of Hydrolysis by Immobilized Flavourzyme

SHI Guangbo1, XIN Hanxiao2, MA Yanfang1, SUN Zhongtao1,*
(1.College of Life Sciences,Shandong Agricultural University,Tai'an 271018,China;2.Shandong Zuotianshi Biotechnology Company Limited,Jinan 250000,China)

Produce soybean peptides from soy protein using immobilized Flavourzyme for lower production costs and higher degree of hydrolysis.Single-factor experiment and response surface methodology were used to optimize the hydrolysis process.The results showed that the degree of hydrolysis reached 17.72%when soy protein was hydrolyzed by immobilized Flavourzyme at the optimum conditions:hydrolysis temperature of 65℃,pH8.0,enzyme dosage of 50 g/L,hydrolysis time of 7 h.The immobilized Flavourzyme was stable enough to be reused for 7 times,and the relative activity still remained 79.1%.It was feasible to produce soybean peptides with high degree of hydrolysis using immobilized Flavourzyme,which was prepared with globular cross-linked chitosan and could be reused for several times.

soybean peptide;Flavourzyme;immobilized enzyme;globular cross-linked chitosan;response surface methodology

TS229;Q814.2

A

(責(zé)任編輯:葉紅波)

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.06.009

2095-6002(2015)06-0051-06

師廣波,辛寒曉,馬艷芳,等.固定化風(fēng)味蛋白酶水解法生產(chǎn)高水解度大豆肽[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2015,33(6):51-56.

SHI Guangbo,XIN Hanxiao,MA Yanfang,et al.Production of soybean peptide with high degree of hydrolysis by immobilized Flavourzyme[J].Journal of Food Science and Technology,2015,33(6):51-56.

2015-02-23

國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(MBSMAT-2014-05)。

師廣波,男,碩士研究生,研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程與酶工程;

*孫中濤,男,副教授,博士,主要從事發(fā)酵工程與酶工程方面的研究。通信作者。