超聲波-雙水相萃取印楝素工藝的研究

王佳靜，王曼，欒龍，孫潤廣

超聲波-雙水相萃取印楝素工藝的研究

王佳靜1，王曼1，欒龍2，孫潤廣1

(1. 陜西師范大學物理學與信息技術(shù)學院，陜西西安710062；2. 南京大淵生物技術(shù)工程有限責任公司，江蘇南京211800)

采用超聲波耦合乙醇-硫酸鈉雙水相提取印楝素，將超聲功率密度，超聲時間，超聲輻射方式作為其影響因素，并分別進行單因素實驗和正交實驗對其進行研究，最終確定了超聲波雙水相提取印楝素的最佳工藝。最佳工藝條件為：功率密度為2.4 w/cm2，時間為30 min，輻射方式為7s/10s。并且影響印楝素超聲提取率的主次因素為功率密度>輻射方式>超聲時間，最優(yōu)條件下印楝素的提取率為0.3200%。

超聲波；印楝素；雙水相

0 引言

當前，人們更加重視從天然植物資源中提取植物源農(nóng)藥[1,2]。該農(nóng)藥在自然生態(tài)環(huán)境中廣泛存在，資源豐富，絕大多數(shù)植物源農(nóng)藥具有低毒性，不會破壞生態(tài)環(huán)境，而且殘留少，選擇性強，對天敵影響小。蟲害和病菌對該農(nóng)藥難以產(chǎn)生抗藥性，使用壽命長[3]。有的植物源農(nóng)藥把害蟲或病菌殺死后，其遺體殘骸上的病菌還可以再浸染拓展到同類靶標生物上，增加害蟲或病菌死亡的數(shù)量和區(qū)域，降低使用成本[4]。由此，使用植物源農(nóng)藥具有十分重要的現(xiàn)實意義。

印楝素作為一種高效的生物農(nóng)藥，幾乎對所有植物害蟲都具有驅(qū)殺效果，是對人類安全性極高的天然農(nóng)藥。目前，超聲波提取印楝素的方法已有很多報道[5-7]，但大多都局限在超聲波總功率的層面上，這樣印楝素提取率就受容器大小的影響比較大，為工業(yè)生產(chǎn)帶來很大的麻煩。本文從超聲功率密度的角度出發(fā)，避免了超聲容器的大小對印楝素提取的影響。

雙水相是由一種或兩種高分子化合物與一種鹽類在水中所形成的的互不相溶的兩相體系，根據(jù)被分離物在兩相中的分配不同，從而實現(xiàn)分離。本文采用乙醇與鹽形成雙水相進行萃取[8]，與傳統(tǒng)的油-水溶劑萃取相比，雙水相萃取具有活性損失小、分離步驟少、操作條件溫和，不存在有機溶劑殘留問題等優(yōu)點，避免了使用有毒、易燃的有機溶劑的問題。本文將超聲的提取與雙水相萃取相結(jié)合，從超聲功率密度、超聲時間、超聲輻射方式三個因素進行研究，分別進行了單因素實驗和正交實驗，最終確定最佳超聲參數(shù)，為今后印楝素的工業(yè)生產(chǎn)奠定了技術(shù)支撐。

1 實驗材料和方法

1.1 材料和儀器

材料：印楝素種仁(南京九康生物科技發(fā)展有限公司提供)，石油醚，乙醇，硫酸鈉，乙腈(分析純級)。

儀器：FZ102型植物用粉碎機(天津泰斯特有限公司)，JY98-Ⅲ超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技有限公司)，Huihong-3118A超聲波功率(聲強)測量儀(富陽市輝煌超聲設(shè)備有限公司)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，F(xiàn)D-IA冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器公司)，Waters1525高效液相色譜儀，2487紫外檢測器。

1.2 試驗方法

將印楝種仁粉碎，然后用石油醚按1:5進行脫脂三次，獲得印楝餅，用75%乙醇按料液比1:3進行超聲提取三次，整個提取過程處于冰水浴中，防止超聲時溶液溫度過高導致印楝素分解。將提取液進行雙水相分相，取醇相進行濃縮后冷凍干燥，獲得印楝素粗品，高效液相檢測其含量。

1.3 雙水相的配置

本實驗采用乙醇-硫酸鈉雙水相，其中水溶性有機溶劑為乙醇，成相的鹽為硫酸鈉，硫酸鈉溶液按鹽:水=60:100進行配置，用乙醇提取液和硫酸鈉溶液按1:1進行混合獲得雙水相。

1.4 檢測方法

運用高效液相進行檢測[9,10]，檢測條件為色譜柱：C18，ODS—35 um 250×4.6 mm；流動相：乙腈：水=40:60；流速：1 ml/min；檢測波長：218 nm；進樣量：20 ul；柱溫：25℃。

1.5 超聲波提取印楝素單因素實驗

1.5.1 超聲功率密度單因素實驗

分別取脫脂后的印楝餅20 g，超聲波頻率為25 kHz，料液比為1:3，超聲時間30 min，輻射方式為6 s/10 s，超聲功率密度大小分別為1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8 W/cm2，進行超聲提取，計算提取率，確定最佳超聲功率密度。

1.5.2 超聲時間的單因素實驗

分別取脫脂后的印楝餅20 g，超聲波頻率為25 kHz，料液比為1:3，超聲功率密度為2.4 W/cm2，輻射方式為6 s/10 s，超聲時間分別為15、30、45、60、90、120 min，進行超聲提取，計算提取率，確定最佳超聲時間。

1.5.3 超聲輻射方式單因素實驗

分別取脫脂后的印楝餅20 g，超聲波頻率為25 kHz，料液比為1:3，超聲功率密度為2.4 W/cm2，超聲時間為30 min，輻射方式分別為5 s/10 s，6 s/10 s，7 s/10 s，8 s/10 s，9 s/10 s，10 s/10 s，進行超聲提取，計算提取率，確定最佳超聲輻射方式。

1.6 超聲提取印楝素正交實驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗，對影響印楝素超聲提取的主要因素：超聲功率密度、超聲時間、超聲輻射方式，按照正交表進行正交實驗設(shè)計，正交試驗因素水平見表1，確定最佳超聲提取工藝。

表1 超聲提取印楝素的正交試驗因素

1.7 傳統(tǒng)攪拌對比試驗

傳統(tǒng)攪拌提取方法為：分別取脫脂后的印楝餅20 g，用75%乙醇按料液比1:3進行攪拌輔助提取三次，提取時間分別為30、45、60、75、90、105、120 min進行攪拌提取。檢測提取率，確定攪拌提取最佳時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲功率密度對印楝素提取的影響

由圖1可知，超聲功率密度為2.4 W/cm2時，印楝素的提取率明顯高于其他功率密度下的提取率，當超聲功率密度小于2.4 W/cm2時，提取率隨著超聲功率密度的增加而升高，當超過2.4 W/cm2時，提取率開始下降，因此超聲功率密度不宜過大，最佳的超聲功率密度為2.4 W/cm2。

2.1.2 超聲時間對印楝素提取率的影響

由圖2可知，當超聲時間在30 min時，印楝素的提取率最高，在30 min之前隨著超聲時間的延長提取率逐漸升高，但在30 min后隨著時間的延續(xù)提取率逐漸降低，可能是超聲時間過長，溶液局部溫度上升使得部分印楝素分解，因此最佳的超聲提取時間為30 min。

2.1.3 超聲輻射方式對印楝素提取率的影響

由圖3可知，當超聲波輻射方式為7 s/10 s的時候，提取率最高，在輻射方式為7 s/10 s之前隨著輻射方式的改變提取率逐漸升高，在7 s/10 s之后隨著輻射方式的改變提取率逐漸降低，因此最佳的超聲輻射方式為7 s/10 s。

2.2 超聲正交實驗結(jié)果與分析

表2 超聲提取印楝素結(jié)果與分析

2.3 傳統(tǒng)攪拌提取實驗結(jié)果

由圖4可知，當攪拌時間為90 min時提取率達到最大，提取率為0.230%。

3 結(jié)論

采用超聲波雙水相提取印楝素，能夠有效地提高印楝素的提取率，本文從超聲功率密度以及其他單因素試驗出發(fā)進行實驗，最終得到了最佳的超聲波提取工藝，即超聲功率密度為2.4 W/cm2，超聲時間為30 min，超聲輻射方式為7 s/10 s，印楝素的最大提取率為0.3200%，比傳統(tǒng)的攪拌提取節(jié)約了時間，提高了產(chǎn)率，并且雙水相的使用，避免了在使用有機溶劑進行萃取的過程所造成的污染。更重要的是本文采用超聲功率密度，不再使用傳統(tǒng)的超聲功率這一籠統(tǒng)的因素，避免了超聲容器帶來的影響，為今后的工業(yè)生產(chǎn)帶來了更大的便利。

[1] 袁文金, 馬德英, 郭冬雪, 等. 我國植物源農(nóng)藥研究進展[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學, 2007, 44(6): 892-897.

YUAN Wenjin, MA Deying, GUO Dongxue, et al. Research progress of botanical pesticides in China[J]. Xinjiang Agricultural Sciences, 2007, 44(6): 892-897.

[2] 刁治民, 張靜, 馬壽福. 植物源農(nóng)藥的研究進展和發(fā)展前景[J]. 青海草業(yè), 2007, 16(3): 27-32.

DIAO Yimin, ZHANG Jing, MA Shoufu. The research progress of botanical pesticides and development prospects[J]. Qinghai Prataculture,2007, 16(3): 27-32.

[3] 王萬能. 植物源農(nóng)藥的開發(fā)研究[J]. 重慶三峽學院學報, 2005, 3(21): 81-82.

WANG Wanneng. The research and development of plant pesticide[J]. Jouranal of Chongqing Three-Gorges University, 2005, 3(21): 81-82.

[4] 陳小軍, 楊益眾, 張志祥, 等. 印楝素及印楝殺蟲劑的安全性評價研究進展[J]. 生態(tài)環(huán)境學報,2010, 19(6): 1478-1484.

CHEN Xiaojun, YANG Yizhong, ZHANG Zhixiang, et al. Progress on safety evaluation of azadirachtin and neem insecticide[J]. Ecology and Environmental Sciences. 2010; 19(6): 1478-1484.

[5] 王秋芬, 宋湛謙, 趙淑英, 等. 超聲波輔助溶劑萃取印楝素條件優(yōu)化[J]. 農(nóng)藥, 2004, 43(8): 351-353.

WANG Qiufen, SONG Zhanqian, ZHAO Shuying, et al. The optimal ultrasonic-assisted extraction azadirachtin process from neem seed with solvent[J]. Chinese Journal of Pesticides, 2004, 43(8): 351-353.

[6] 王有瓊, 李曉升, 孫龍, 等. 印楝素的快速提取法研究[J].林產(chǎn)化工通訊, 2005, 39(5): 13-15.

WANG Youqiong, LI Xiaosheng, Sun Long, et al. Study on rapid extraction of azadirachtin[J]. Agrochemicals, 2005, 39(5): 13-15.

[7] 王中元, 陳玉明, 袁利偉, 等. 印楝素強化浸提試驗研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工學刊, 2007(1): 68-70.

WANG Zhongyuan, CHEN Yuming, YUAN Liwei, et al. Experimental study on the neem extricated by technique of reinforcement[J]. Academic Periodical of Farm Products Processing,2007(1): 68-70.

[8] 劉琳, 董悅生, 修志龍. 微波輔助雙水相提取盾葉薯蕷中的皂苷成分[J]. 過程工程學報, 2009, 9(6): 1147-1152.

LIU Lin, DONG Yuesheng, XIU Zhilong. Microwave-assisted aqueous two-phase extraction of steroidal saponins in dioscorea zingiberensis[J]. The Chinese Journal of Process Engineering.2009, 9(6): 1147-1152.

[9] 葉敏, 武永昆, 林軍, 等. 懸浮劑中印楝素的高效液相色譜分析方法[J]. 農(nóng)藥, 2006, 45(11): 761-762.

YE Min, WU Yongkun, LIN Jun, et al. Determination of azadirachtin in suspension concentrates[J]. Agrochemicals, 2006, 45(11): 761-762.

[10] 宗乾收, 林軍, 武永昆, 等. 印楝種仁中印楝素含量的快速液相色譜分析[J]. 農(nóng)藥, 2003, 42(4): 23-24.

ZONG Qianshou, LIN Jun, WU Yongkun, et al. Quantitative analysis of azadirachtincontent of neem seeds by HPLC[J]. Agrochemicals, 2003, 42(4): 23-24.

The study of ultrasound-aqueous two-phase extraction process of azadirachtin

WANG Jia-jing1, WANG Man1, LUAN Long2, SUN Run-guang1.

(1.College of Physics and Information Technology, Shaanxi Normal University, Xi'an 710062, Shaanxi, China;2.Nanjing Potomac Bio-Technology Co,Ltd,Nanjing211800, Jiangsu, China)

In this paper，the method of ultrasonic assisted double water phase is used to extract azadirachtin. In order to obtain the best technology of extracting azadirachtin, many influence factors are studied, such as ultrasonic power density,action time and the way of radiation method. Meanwhile, the single factor and orthogonal experiments are performed separately to investigate the extraction of azadirachtin. Finally, the optimum conditions of extracting azadirachtin is gained when the ultrasonic power density, action time and radiation mode are 2.4w/cm2, 30min and 7s/10s respectively. The influence degrees from strong to weak are in order caused by ultrasonic power density,radiation mode and ultrasonic action time. The extracted yield of azadiraehtin reaches 0.3200% under optimal conditions.

ultrasonic; azadirachtin; aqueous two-phase

Q62

A

1000-3630(2015)-01-0043-04

10.16300/j.cnki.1000-3630.2015.01.008

2013-11-15;

2014-03-02

國家自然科學基金資助項目(10874108)、陜西省自然科學基礎(chǔ)研究計劃(SJ08A16)資助項目。

王佳靜(1988－), 男, 陜西省咸陽市人, 碩士研究生, 研究方向為超聲提取天然產(chǎn)物化學。

孫潤廣, E-mail: sunrunguang@snnu.edu.cn