氟尿嘧啶聯(lián)合順鉑對骨肉瘤MG-63細(xì)胞的抑制作用及其對TRPV5和TRPV6蛋白表達(dá)的影響

那　鍵，戴維享，馬　超，張曉東，邵長青，劉　勇，王秀力，劉　穎

(1.江蘇省徐州市中心醫(yī)院骨科， 江蘇 徐州 221009;2.江蘇省徐州市心血管病研究所，江蘇 徐州 221009)

氟尿嘧啶聯(lián)合順鉑對骨肉瘤MG-63細(xì)胞的抑制作用及其對TRPV5和TRPV6蛋白表達(dá)的影響

那鍵1，戴維享1，馬超1，張曉東1，邵長青1，劉勇1，王秀力2，劉穎2

(1.江蘇省徐州市中心醫(yī)院骨科， 江蘇 徐州 221009;2.江蘇省徐州市心血管病研究所，江蘇 徐州 221009)

目的:研究氟尿嘧啶聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細(xì)胞株MG-63的生長抑制作用，探討其對瞬時性受體電位通道5(TRPV5)和瞬時性受體電位通道6(TRPV6)蛋白表達(dá)的影響。 方法:常規(guī)培養(yǎng)MG-63細(xì)胞，以5×104mL-1的細(xì)胞密度種植細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為對照組、氟尿嘧啶組、順鉑組及氟尿嘧啶聯(lián)合順鉑組4組。CCK-8法檢測不同時間MG-63細(xì)胞的生長抑制情況；分別于24、48和72 h采用細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒檢測MG-63細(xì)胞加入不同藥物后的凋亡情況；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測MG-63細(xì)胞在加藥前后TRPV5和TRPV6蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:氟尿嘧啶和順鉑對MG-63細(xì)胞的抑制作用均顯著，且隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，細(xì)胞中黑色顆粒增多，胞體回縮，細(xì)胞老化或死亡。與兩藥單獨(dú)或是聯(lián)用作用于MG-63細(xì)胞24 h比較，隨著時間的延長，48 h 和72 h兩者對細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)(P<0.05)。與對照組比較，氟尿嘧啶組和順鉑組24、48和72 h后凋亡率逐漸增加(P<0.01)，隨著藥物作用時間的延長，細(xì)胞凋亡率亦呈升高的趨勢。當(dāng)加入氟尿嘧啶和順鉑72 h后，MG-63細(xì)胞表達(dá)TRPV5和TRPV6含量較加藥前明顯降低(P<0.05)。結(jié)論:氟尿嘧啶與順鉑聯(lián)用可以提高M(jìn)G-63細(xì)胞增殖抑制及凋亡作用，同時對MG-63細(xì)胞TRPV5和TRPV6表達(dá)水平具有明顯的抑制作用。

氟尿嘧啶；順鉑；骨肉瘤；骨肉瘤細(xì)胞株MG-63；瞬時性受體電位通道

腫瘤細(xì)胞的主要特征是細(xì)胞增殖不受控制且減少了細(xì)胞的凋亡，而細(xì)胞凋亡的降低可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療的耐藥，從而阻礙對惡性腫瘤的治療，這其中就包括骨肉瘤[1-3]。骨肉瘤是發(fā)生于未成年人的最常見的惡性骨腫瘤，約60%的惡性骨腫瘤發(fā)生在20歲之前[4-5]。目前對骨肉瘤的治療主要是手術(shù)并輔以化學(xué)治療，還有一些其他的綜合治療，但是對一些化學(xué)治療的抗藥性仍然會阻礙骨肉瘤的治療。單一化療藥物往往難以達(dá)到治療效果，因此人們都在探索一種既安全又有效的治療方法[6]，這其中就包括將幾種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于骨肉瘤的治療之中。瞬時性受體電位通道5(transient receptor potential vanilloid 5 TRPV5)和瞬時性受體電位通道6(transient receptor potential vanilloid 6,TRPV6)是瞬時性受體電位通道(transient receptor potential，TRP)超家族中的成員，是專門的上皮樣鈣離子通道蛋白，與鈣離子跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。現(xiàn)已知鈣離子與細(xì)胞分化、增殖和程序性死亡有關(guān)。為了了解氟尿嘧啶與順鉑(ccis-dichlorodia mineplatinum,DDP)聯(lián)合用藥對骨肉瘤細(xì)胞生長的影響，本研究將氟尿嘧啶聯(lián)合順鉑作用于骨肉瘤細(xì)胞株MG-63，觀察其對MG-63細(xì)胞生長和TRPV5、TRPV6蛋白表達(dá)的影響，為氟尿嘧啶聯(lián)合順鉑應(yīng)用于臨床治療骨肉瘤奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株來自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，用含10%胎牛血清(Hyclone公司,美國)、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素雙抗合劑(Invitrogen公司，美國)的DMEM/高糖(Gibco公司，美國)培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份公司)；氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司)；Cell Counting Kit(CCK-8)試劑盒和細(xì)胞凋亡-Hoechst試劑盒(海門市碧云天生物科技有限公司)；TRPV5和TRPV6單克隆抗體(Sigma公司，美國)。倒置相差顯微鏡和正置顯微鏡(Olympus公司，日本)，酶標(biāo)儀(TECAN公司,瑞士)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)。

1.2CCK-8法測定各組MG-63細(xì)胞生長抑制率實(shí)驗(yàn)分對照組、氟尿嘧啶組、順鉑組和氟尿嘧啶聯(lián)合順鉑組4組。制備MG-63細(xì)胞懸液，以5×104mL-1細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每組設(shè)5個平行孔，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)過夜后取出培養(yǎng)板，各組分別加入不同濃度的藥物各1 μL，其中氟尿嘧啶組氟尿嘧啶終濃度分別為5、10、20、50、100和200 mg·L-1；順鉑組順鉑終濃度分別為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000和5.000 mg·L-1);對照組不加任何藥物。分別于24、48和72 h后取出細(xì)胞進(jìn)行CCK-8檢測，操作方法嚴(yán)格按照CCK-8檢測試劑盒說明書進(jìn)行。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值，按以下公式計(jì)算抑制率。細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組的A450值/對照組A450值)×100。

1.3Hoechst染色法檢測各組MG-63細(xì)胞凋亡率采用Hoechst染色試劑盒，氟尿嘧啶組終濃度分別為5、10、20、50、100和200 mg·L-1；順鉑組終濃度分別為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000和5.000 mg·L-1，二者聯(lián)合用藥的組合編號分別是：1、2、3、4、5和6。細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.1，細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞濃度為5×104mL-1，分別于培養(yǎng)24、48和72 h進(jìn)行檢測，染色方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，在熒光顯微鏡下檢測呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長約350 nm，發(fā)射波長約460 nm。

1.4免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測MG-63細(xì)胞在加藥前后TRPV5和TRPV6蛋白表達(dá) 按5×104mL-1的細(xì)胞密度接種細(xì)胞于35 mm培養(yǎng)皿中，72 h后對細(xì)胞行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，具體方法見參考文獻(xiàn)[7]。一抗為抗TRPV5和抗TRPV6單克隆抗體，對照染色以PBS代替一抗。采用Imagepro Plus 6.0分析軟件處理免疫組織化學(xué)圖片，分析其A值，以此來檢測蛋白表達(dá)水平。

2　結(jié)　果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 氟尿嘧啶組、順鉑組和氟尿嘧啶聯(lián)合順鉑用藥組24、48和72 h時細(xì)胞中黑色顆粒增多，胞體回縮，細(xì)胞密度減小，細(xì)胞狀態(tài)變差，且隨著藥物作用時間的延長及藥物濃度的增加細(xì)胞形態(tài)越來越不規(guī)則，細(xì)胞老化或死亡。100 mg·L-1氟尿嘧啶、2.0 mg·L-1順鉑及二者聯(lián)合用藥后MG-63細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生長狀態(tài)的變化情況。見圖1。

圖1　各組不同時間MG-63細(xì)胞形態(tài)(×200)

2.2CCK-8法檢測不同濃度氟尿嘧啶作用不同時間MG-63細(xì)胞生長抑制率與5 mg·L-1氟尿嘧啶組比較，10、20、50、100和200 mg·L-1氟尿嘧啶組MG-63細(xì)胞的生長抑制率增加(P<0.05)；與24 h比較，隨著時間的延長，48和72 h時細(xì)胞生長抑制率明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.3CCK-8法檢測不同濃度順鉑作用不同時間MG-63細(xì)胞生長抑制率與0.125 mg·L-1順鉑組比較，0.250、0.500、1.000、2.000和5.000 mg·L-1DDP組MG-63細(xì)胞生長抑制率逐漸升高(P<0.05)；與24 h比較，隨著時間的延長，48和72 h細(xì)胞的生長抑制率明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.4CCK-8法檢測不同濃度氟尿嘧啶聯(lián)合順鉑作用不同時間MG-63細(xì)胞生長抑制率與5 mg·L-1氟尿嘧啶聯(lián)合0.125 mg·L-1DDP組比較，其他各濃度組MG-63細(xì)胞生長抑制率逐漸升高(P<0.05)，與24 h比較，隨著時間的延長，48 h 和72 h時細(xì)胞的生長抑制率明顯升高(P<0.05)。見表3。

表1不同濃度氟尿嘧啶作用不同時間MG-63細(xì)胞生長抑制率

*P<0.05 compared with 5 mg·L-1fluorouracil group;△P<0.05 compared with 24 h .

表2不同濃度順鉑作用不同時間MG-63細(xì)胞生長抑制率

*P<0.05 compared with 0.125 mg·L-1DDP group;△P<0.05 compared with 24 h.

表3不同濃度氟尿嘧啶聯(lián)合順鉑作用不同時間MG-63細(xì)胞生長抑制率

*P<0.05 compared with 1 group;△P<0.05 compared with 24 h.

2.5Hoechst染色法檢測MG-63細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，細(xì)胞質(zhì)密度增加，核質(zhì)濃縮。見圖2(插頁四)。 與對照組比較，各組MG-63細(xì)胞凋亡率逐漸升高(P<0.01)，與24 h比較，隨著時間的延長，48和72 h時細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。見表4。

表4各組MG-63細(xì)胞凋亡率

GroupApoptoticrate(t/h) 244872Control1.17±0.033.21±0.886.08±1.27Fluorouracil3.58±0.27*6.78±0.54*△13.21±2.13*△DDP6.12±0.42*11.41±0.32*△20.74±0.98*△Fluorouracil+ DDP11.29±0.64*25.14±1.14*△45.15±2.45*△

*P<0.01 compared with control group;△P<0.01 compared with 24 h.

2.6MG-63細(xì)胞在加藥前后TRPV5和TRPV6蛋白表達(dá)水平MG-63細(xì)胞在加藥之前TRPV5和TRPV6蛋白表達(dá)明顯，當(dāng)加入氟尿嘧啶和順鉑72 h時，TRPV5和TRPV6蛋白表達(dá)水平明顯降低，與加藥前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3(插頁四)和表5。

表5加入氟尿嘧啶和順鉑前后MG-63細(xì)胞TRPV5和TRPV6蛋白表達(dá)水平

*P<0.05 compared with before treatment.

3　討　論

生長區(qū)域的骨最容易發(fā)生骨肉瘤，越來越多的證據(jù)[8-11]表明：骨肉瘤從本質(zhì)上講是一種分化疾病，即來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化發(fā)生了遺傳和表觀遺傳變異，從而轉(zhuǎn)化成了骨肉瘤，呈現(xiàn)出一種高的轉(zhuǎn)移潛能。盡管外科手術(shù)移除了原發(fā)骨肉瘤，并相繼進(jìn)行幾個周期的放療和化療，但是由于其侵襲性和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，患者往往伴有不良的預(yù)后,患者的存活率不到20%。雖然骨肉瘤患者對某些化療藥物耐藥，但是目前來說當(dāng)患者進(jìn)行手術(shù)治療后就需要行化療作為輔助治療。

氟尿嘧啶為嘧啶類的氟化物，屬于抗代謝抗腫瘤藥，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶核苷核，干擾DNA合成。對RNA的合成也有一定的抑制作用。臨床用于結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、頭頸部鱗癌、皮膚癌、肝癌和膀胱癌等。DDP屬細(xì)胞周期非特異性藥物，具有細(xì)胞毒性，可抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過程，并損傷其細(xì)胞膜上結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用。臨床對于卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、惡性淋巴瘤、頭頸部鱗癌、甲狀腺癌及成骨肉瘤等多種實(shí)體腫瘤的治療均能顯示療效。

近期有文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道：氟尿嘧啶聯(lián)合DDP用于肺癌、鼻咽癌及胃癌的治療效果明顯，但是還尚無用于骨肉瘤治療的報(bào)道。所以本實(shí)驗(yàn)采用氟尿嘧啶與順鉑聯(lián)合用藥于骨肉瘤細(xì)胞株MG-63，觀察二者聯(lián)合用藥對細(xì)胞增殖及凋亡影響。本研究結(jié)果顯示：MG-63細(xì)胞加入不同藥物作用24、48和72 h后，細(xì)胞密度減小，細(xì)胞狀態(tài)變差，而且隨著藥物作用時間的延長及藥物濃度的增加細(xì)胞形態(tài)越來越不規(guī)則，細(xì)胞生長狀態(tài)越來越差。氟尿嘧啶和順鉑對MG-63細(xì)胞的抑制作用顯著，且隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用逐漸增強(qiáng)。二者聯(lián)合對MG-63細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)，二者具有疊加作用，隨著時間的延長，兩者對細(xì)胞的抑制作用呈增強(qiáng)趨勢。細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，細(xì)胞質(zhì)密度增加，核質(zhì)濃縮，氟尿嘧啶和順鉑單獨(dú)用藥24、48和72 h后，隨著作用時間的延長，凋亡率逐漸增加，72 h時聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率達(dá)到(45.15±2.45)%。

上皮性鈣通道成員鈣離子通道TRPV5/TRPV6表現(xiàn)為對鈣離子具有高度選擇性,對鈣離子代謝及骨代謝有著非常重要的作用[14]。最近的研究[15]表明：細(xì)胞的生存是受鈣離子濃度調(diào)控的，如細(xì)胞的增殖和凋亡，而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，一些鈣離子調(diào)節(jié)的信號通路也是參與其中的，TRPV5TRPV6作為腫瘤的標(biāo)志物對于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也是非常重要[4]。在非小細(xì)胞肺癌中TRPV5TRPV6就呈高表達(dá)[15]。因此，研究骨肉瘤細(xì)胞中TRPV5和TRPV6的表達(dá)情況及其影響因素將有深遠(yuǎn)意義。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中存在TRPV5和TRPV6表達(dá)，陽性染色部位主要定位于一些腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)，當(dāng)加入氟尿嘧啶和順鉑72 h后，TRPV5和TRPV6蛋白表達(dá)水平明顯降低，證明了二者聯(lián)合應(yīng)用對骨肉瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用。雖然TRPV5和TRPV6在骨肉瘤細(xì)胞中的少許表達(dá)，只能說明在骨肉瘤中也可能存在TRPV5及TRPV6通道，但可望在今后的研究中以更靈敏的實(shí)驗(yàn)技術(shù)來檢測或者以更多的樣本數(shù)來揭示其表達(dá)規(guī)律。

綜上所述，氟尿嘧啶聯(lián)合順鉑可以提高M(jìn)G-63細(xì)胞增殖抑制及凋亡作用，同時對MG-63細(xì)胞TRPV5和TRPV6蛋白表達(dá)具有明顯的抑制作用。本研究結(jié)果為今后氟尿嘧啶與順鉑聯(lián)合應(yīng)用于骨肉瘤的臨床治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Inhibitory effect of fluorouracil combined with DDP on human osteosarcoma cell line MG-63 and its influence in expressions of TRPV5 and TRPV6 proteins

NA Jian1,DAI Weixiang1,MA Chao1,ZHANG Xiaodong1,SHAO Changqing1,LIU Yong1,WANG Xiuli2, LIU Ying2

(1. Department of Orthopedics,Xuzhou Central Hospital, Jiangsu Province, Xuzhou 221009, China;2. Xuzhou Cardiovascular Disease Institute, Jiangsu Province, Xuzhou 221009, China)

ObjectiveTo study the inhibitory effect of fluorouracil combined with DDP on the growth of human osteosarcoma cell line MG-63, and to explore its influence on the expressions of transient receptor potential vanilloid 5 (TRPV5) and transient receptor potential vanilloid 6 (TRPV6) proteins.MethodsThe MG-63 cells were cultured by the density of 5×104mL-1.Fluorouracil group, DDP group, fluorouracil+DDP group and control group containing 10% FBS were set up.The inhibitory rates of growth of MG-63 cells at different time were detected by CCK-8 assay.The apoptosis of MG-63 cells after treated with different drugs was determined by Hoechst staining Kit.The immunocytochemical staining was used to treatent to detect the expressions of TRPV5 and TRPV6 before and after treatment.Results Fluorouracil and DDP both inhibited the growth of MG-63 cells in a time- and dose- dependent manner.There were a lot of black particles in the MG-63 cells and the cells were smaller, aging or death when they were exposed to fluorouracil or DDP.Compared with 24 h group, the inhibitory rates of proliferation of MG-63 cells after treated with the sigle drug of fluorouracil or DDP for 48 and 72 h were increased significantly (P<0.05).Compared with control group,the apoptotic rates of MG-63 cells in fluorouracil group and DDP group 24,48,and 72 h after treatment were increased (P<0.01) in a time-dependent manner.The expression levels of TRPV5 and TRPV6 in MG-63 cells 72 h after treatment of fluorouracil and DDP were decreased significantly compared with before treatment(P<0.05).ConclusionFluorouracil, DDP and fluorouracil combined with DDP could significantly inhibit the proliferation of MG-63 cells, induce the apoptosis, and decrease the expression levels of TRPV5 and TRPV6.

fluorouracil; cisplatin; osteosarcoma;osteosarcoma cell line MG-63; transient receptor potential vanilloid

1671-587Ⅹ(2015)06-1201-06

10.13481/j.1671-587x.20150620

2015-05-15

江蘇省衛(wèi)生廳“六大人才高峰”項(xiàng)目資助課題(2014-WSW-065)；江蘇省徐州市科技發(fā)展項(xiàng)目資助課題(XM13B052)； 江蘇省徐州市科技發(fā)展項(xiàng)目資助課題(XM13B086)

那鍵(1976-)，男，遼寧省大連市人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事骨病、人工關(guān)節(jié)和骨質(zhì)疏松的基礎(chǔ)與臨床方面的研究。

王秀力, 助理研究員，碩士研究生導(dǎo)師(Tel:0516-83956610,E-mail：wxljsq@163.com)

R738.1

A