RNA干擾血管緊張素原基因表達對前脂肪細胞3T3-L1分化的影響

黃志立，張麗君，伍麗華，王　妍，楊汝德

(1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055；2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

RNA干擾血管緊張素原基因表達對前脂肪細胞3T3-L1分化的影響

黃志立1，張麗君1，伍麗華2，王妍1，楊汝德2

(1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055；2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

目的：構(gòu)建靶向血管緊張素原(AGT)基因的RNA干擾質(zhì)粒，研究AGT基因?qū)κ笄爸?T3-L1分化的影響。方法：設(shè)計靶向AGT的小分子RNA干擾片段(AGT-shRNA)，以未靶向任何DNA的小分子RNA(Non-shRNA)為對照，利用載體psiRNA-U6.1/Neo構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染鼠前脂肪細胞3T3-L1并篩選到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，RT-PCR和SDS-PAGE法分別檢測AGT基因沉默效果，通過顯微鏡觀察和脂肪細胞分化標志物檢測來確定AGT基因干擾對3T3-L1細胞分化的影響。結(jié)果：成功構(gòu)建AGT干擾質(zhì)粒，與對照組比較，AGT基因轉(zhuǎn)錄水平受到顯著抑制(P<0.05)，AGT蛋白表達水平也僅為對照的43.86%。AGT基因干擾后3T3-L1細胞脂質(zhì)水平和甘油-3-磷酸脫氫酶(GPDH)活性仍隨分化時間延長呈上升趨勢，但增長量明顯低于對照組(P<0.05)。結(jié)論：RNA干擾AGT基因可明顯抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化，提示脂肪組織中的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)與脂肪代謝有重要關(guān)聯(lián)。

血管緊張素原；RNA干擾；3T3-L1；分化

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對穩(wěn)定心血管系統(tǒng)功能、維持體液平衡和調(diào)節(jié)血壓有重要作用，與高血壓和糖尿病等疾病關(guān)系密切[1]。在RAS中，血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)是產(chǎn)生具有生物活性血管緊張素的前體物質(zhì)，其在腎素和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶催化下依次轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ(angiotensinⅠ，AngⅠ)和血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)，AngⅡ是RAS最主要的生物活性肽，通過循環(huán)系統(tǒng)到達遠端組織，與心臟、血管、腎臟及腦組織等靶器官的特異性受體(angiotensin receptor，AT)結(jié)合，產(chǎn)生信號傳導(dǎo)而發(fā)揮其生理功能[2]。脂肪組織中表達RAS的所有組分，肥胖者同時伴有RAS的過度活躍，提示脂肪組織RAS與脂肪代謝及肥胖有密切關(guān)聯(lián)[1,3]。以往研究[4-8]主要針對RAS活性物質(zhì)AngⅡ以及其受體AT1與AT2展開，卻得到相互矛盾的結(jié)果，部分研究[4-6]顯示提高AngⅡ水平會促進人和鼠前脂肪細胞分化，而另一些研究[7-8]結(jié)果卻表明RAS會抑制脂肪合成。為了排除RAS各組分間的相互影響，本研究以RAS的源頭AGT為目標，構(gòu)建靶向鼠前脂肪細胞AGT基因的RNA干擾(RNAi)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化3T3-L1細胞，通過沉默AGT基因來探討RAS對脂肪細胞分化增殖的影響，為研究RAS影響脂肪細胞分化的機制以及RNAi新技術(shù)的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器鼠前脂肪細胞3T3-L1購自中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究所。質(zhì)粒psiRNAT-U6.1/Neo購自GenScript公司，大腸桿菌TOP-10由本實驗室細胞服務(wù)平臺提供。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、KpnⅠ，DNA和RNA提取試劑盒，RT-PCR試劑盒SYBR○RPremix Ex TaqTM(Takara 公司，日本)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司，美國)，LipofectamineTM2000和TRIZOL(Life Technologies公司，美國)，DEX、IBMX、胰島素和DHAP(Sigma公司，美國)。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(BINDER公司，德國)，酶標儀(Spectramax M2，美國)，倒置熒光相差顯微鏡(LEICA DMIRB公司，德國)，電泳及凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)，熒光定量PCR儀(Roche公司，德國)。引物合成和DNA測序委托上海生工生物工程公司完成。

1.2RNAi質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)NCBI中查找到的小鼠AGT基因序列(NM 007428)，利用Ambion提供的在線siRNA模板序列設(shè)計軟件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)設(shè)計出2組靶向鼠AGT的siRNA序列，由于2組實驗結(jié)果相近，論文數(shù)據(jù)只選取其中一組，將其命名為AGT-shRNA。此外，還設(shè)計一條與NCBI數(shù)據(jù)庫中任何小鼠基因均無同源性的片段作為實驗對照，標記為Non-shRNA。根據(jù)質(zhì)粒載體psiRNAT-U6.1/Neo的基因序列，整條序列應(yīng)該分別包括BamHⅠ酶切黏性末端互補片段、19個堿基靶序列、LOOP環(huán)、19個堿基靶序列的互補序列、終止信號以及HindⅢ酶切黏性末端的互補片段共6個區(qū)域。用于構(gòu)建重組干擾質(zhì)粒的寡核苷酸序列見表1。

表1　用于構(gòu)建重組干擾質(zhì)粒的寡核苷酸序列

委托生工生物工程(上海)公司合成表1中的寡核苷酸片段，90℃加熱10 min，室溫靜置1 h，使之退火成雙鏈。PsiRNAT-U6.1/Neo載體經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切成線性載體，再經(jīng)T4連接酶分別與AGT-shRNA和Non-shRNA片段連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP-10，篩選重組子，進行酶切分析和測序鑒定。

1.3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞株的獲得及誘導(dǎo)分化鼠前脂肪細胞3T3-L1培養(yǎng)于含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基中，按照每孔2×104個細胞接種于24孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞匯合至80%，更換無抗生素無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。采用LipofectamineTM2000試劑，以每孔1 μg將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入3T3-L1鼠前脂肪細胞株中，37℃培養(yǎng)。6 h后更換無抗生素DMEM培養(yǎng)基(含10%FCS)，37℃培養(yǎng)24 h。為了篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的3T3-L1細胞，在培養(yǎng)基中加入抗生素G418至終濃度為600 mg·L-1，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d換液，10～14 d后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后，挑取單克隆增殖。對應(yīng)重組質(zhì)粒，將獲得的細胞株分別用AGT-shRNA和Non-shRNA表示。將細胞在普通DMEM培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)2 d(將此時的細胞狀態(tài)定義為0 d)，更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(無血清DEME培養(yǎng)基中含有0.5 μmol·L-1胰島素、0.25 μmol·L-1地塞米松和0.5 nmol·L-1IBMX)，37℃分別培養(yǎng)0～12 d，根據(jù)實驗需要在不同時間收獲細胞。

1.4RT-PCR法檢測AGT基因mRNA表達水平提取3T3-L1細胞總RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit操作方法逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用SYBR○RPremix Ex TaqTMKit進行RT-PCR，AGT基因的轉(zhuǎn)錄水平以管家基因β-actin為對照。其中擴增AGT基因的引物：上游引物，5′-GCTTGTCTAGGTTGGCGCTGA-3′； 下游引物，5′-CAGGTGCTCTTGTTGTGGTAAAGG-3′；擴增β-actin基因的引物：上游引物，5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′； 下游引物，5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′ 。PCR反應(yīng)體系是20 μL，PCR循環(huán)反應(yīng)條件：95℃、10 s，60℃(AGT)或56℃(β-actin)、10 s；72℃、10 s，實驗數(shù)據(jù)采用PCR儀配套軟件進行相對定量，AGT基因mRNA表達水平計算公式：2Ct(AGT,AGT-shRNA)-Ct(β-actin,AGT-shRNA)/2Ct(AGT,Non-shRNA)-Ct(β-actin,Non-shRNA)，轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細胞AGT基因mRNA表達水平為100%，AGT基因干擾后其mRNA表達水平以相對于陰性對照的百分數(shù)表示。

1.5SDS-PAGE蛋白電泳檢測AGT蛋白表達水平分別用AGT-shRNA質(zhì)粒和Non-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞，同時進行無義轉(zhuǎn)染作為空白對照，48 h后收集3組細胞，用Bradford法檢測蛋白濃度。按照每孔20 μg的上樣量對樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照后，采用Quantity One軟件進行蛋白條帶灰度的相對定量分析，結(jié)果以百分數(shù)表示。

1.6吸光光度法檢測3T3-L1細胞的分化水平通過檢測甘油-3-磷酸脫氫酶(glycerol phosphate dehydrogenase,GPDH)活性和胞內(nèi)脂質(zhì)水平反映前脂肪細胞的分化水平。分別在第4、8和12天收集細胞，培養(yǎng)6孔板，吸盡培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細胞2～3次，每孔加入0.5 mL預(yù)冷的細胞超聲破碎液，刮下貼壁細胞，使用超聲破碎儀在冰浴中破碎30 s，4℃、12 000 g離心15 min，收集上清液至96孔板，并加入反應(yīng)混合液(100 mmol·L-1三乙醇胺-HCl緩沖液， pH 7.5、2.5 mmol·L-1EDTA，0.12 mmol·L-1NADH和0.1 mmol·L-1β-巰基乙醇)，加入0.2 mmol·L-1DHAP啟動反應(yīng)，以NADH的消耗速率測定GPDH活性。利用酶標儀在340 nm處檢測數(shù)據(jù)，蛋白水平測定采用Bradford法，GPDH活性以U·g-1蛋白表示(1 U=1 mol NADH/min)[9]。分別收集在轉(zhuǎn)染并誘導(dǎo)分化后第0、2、4、6、8、10和12天的3T3-L1細胞，用油紅O染色方法測定細胞脂質(zhì)積累變化，具體方法如下：吸盡培養(yǎng)液，細胞用PBS洗3次后加入10%甲醛溶液，固定30 min，加入異丙醇漂洗，待異丙醇徹底揮發(fā)后加入300 μL油紅O，染色30 min，PBS沖洗3次，洗凈未著色染料，于倒置顯微鏡下觀察細胞分化程度，再加入250 μL異丙醇提取油紅O，振蕩10 min，取200 μL在波長500 nm處測吸光度(A)值，A值的大小直接反映細胞脂質(zhì)水平，以此判定脂肪細胞的分化程度。

2　結(jié)　果

2.1RNAi質(zhì)粒的酶切分析結(jié)果將AGT-shRNA和Non-shRNA基因片段(表1)分別與質(zhì)粒psiRNA-U6.1/Neo重組，構(gòu)建成重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒分別用3種酶進行2組雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。質(zhì)粒psiRNA-U6.1/Neo經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后會產(chǎn)生大小為6 029 和351 bp的2條片段，而重組質(zhì)粒雙酶切后的2條片段大小分別為5 983和397 bp(圖1A)。未重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切后會產(chǎn)生6 035和345 bp 2條片段，而重組質(zhì)粒由于KpnⅠ酶切位點被外源基因所替換，雙酶切后只會產(chǎn)生一條大小為6 380 bp的片段(圖1B)，結(jié)果與預(yù)期相符。經(jīng)上海生工生物工程公司測序，確定重組質(zhì)粒已構(gòu)建成功。

A：EcoRⅠ/HindⅢ; B：EcoRⅠ/KpnⅠ. M：100 bp ladder DNA marker；Lane 1：psiRNA-U6.1/Neo；Lane 2：AGT-shRNA； Lane 3：Non-shRNA .

圖1重組質(zhì)粒的酶切分析電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of degestion of recombinant plasmids with restriction endonucleases

2.2RT-PCR法與SDS-PAGE檢測AGT基因mRNA及蛋白表達水平RT-PCR以β-actin作為本底對照， AGT基因干擾后其mRNA表達水平明顯降低(P<0.05),只有陰性對照的(53.00±0.08)%。AGT蛋白電泳結(jié)果經(jīng)Quantity One軟件進行相對定量分析，得出AGT蛋白條帶的灰度相對量：無義轉(zhuǎn)染和陰性對照的AGT相對含量分別為總蛋白的7.12%和7.57%，結(jié)果接近，而AGT基因沉默組的AGT蛋白相對含量為總蛋白的3.32%，為陰性對照組的43.86%，見圖2。上述結(jié)果表明：AGT基因干擾后，mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平均受到抑制。

Lane 1：3T3-L1 group；Lane 2：Non-shRNA group；Lane 3：AGT-shRNA group；M:Protein marker.

圖2SDS-PAGE電泳檢測各組3T3-L1細胞中AGT蛋白表達電泳圖

Fig.2Electrophoregram of expressions of AGT protein in 3T3-L1 cells in various groups detected by SDS-PAGE

2.32組3T3-L1細胞的分化水平誘導(dǎo)分化開始后，前脂肪細胞內(nèi)的GPDH活性不斷增加，并隨著分化進行逐漸增加，在脂肪細胞分化末期(第12天)GPDH酶活性達到峰值。AGT基因沉默后細胞GPDH活性仍然隨著分化時間的延長呈上升趨勢，但與對照比較其活性水平降低，尤其在第8和12天差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。細胞油紅染色檢測脂質(zhì)水平：各組細胞的胞內(nèi)脂質(zhì)積累均在誘導(dǎo)第6天后迅速增加，但與對照比較，AGT基因抑制導(dǎo)致胞內(nèi)脂質(zhì)水平下降，其中第6和8天差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。2組誘導(dǎo)分化至第12天時細胞經(jīng)油紅染色后在顯微鏡鏡下觀察，AGT基因沉默組細胞的脂質(zhì)積累明顯弱于陰性對照。見圖5(插頁四)。

* P<0.05 vs Non-shRNA.

Fig.3Activities of GPDH in 3T3-L1 adipocytes after AGT gene silencing

* P<0.05 compared with Non-shRNA.

Fig.4Levels of lipids in 3T3-L1 adipocytes after AGT gene silencing

3　討　論

肥胖是繼心腦血管病和癌癥之后人類健康的第3大殺手。肥胖者往往伴有高血糖、高血壓和高血脂等代謝綜合征，并且是2型糖尿病的高危人群[1]。對脂肪組織中RAS的研究表明：該系統(tǒng)與脂肪細胞分化、積累、代謝，肥胖、高血壓和2型糖尿病等疾病等有密切關(guān)聯(lián)[10]，但其相關(guān)機制仍不明確。以往的研究表明：RAS會促進脂肪細胞分化，但也有完全相反的報道[1-3,11]。究其原因：首先,RAS對脂肪細胞的調(diào)控機制復(fù)雜，脂肪細胞產(chǎn)生的Ang Ⅱ?qū)ψ陨淼淖饔眉从凶苑置诤团苑置诘确绞絒12]；其次，各種生物活性因子之間相互影響，尤其是內(nèi)源和外源RAS組分、脂肪來源與非脂肪來源的RAS組分之間相互影響[3]；此外，實驗方法的選用也可能是原因之一。在體外細胞實驗中，常采用外源添加Ang Ⅱ和(或)Ang Ⅱ受體阻斷劑的方法，但Huang等[13]在其研究中也質(zhì)疑AT1受體阻斷劑可能會與Ang Ⅱ互相干擾，導(dǎo)致對脂肪細胞影響結(jié)果不明，因此合理的研究方法至關(guān)重要。 RNAi是一門新興技術(shù)，RNAi不是完全的基因敲除，而是通過小分子RNA來沉默目的基因，達到抑制、干擾其表達的目的，由于其具有操作方便、周期短和成本低等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用在功能基因組學(xué)、藥物篩選、細胞信號途徑和基因治療等研究領(lǐng)域[14-15]。本實驗室首次報道了將該技術(shù)應(yīng)用在RAS對前脂肪細胞分化影響的研究中[16]，從而避免了前述各種外源添加因子相互干擾的現(xiàn)象。本課題組的前期研究[5-6]結(jié)果表明：外源添加Ang Ⅱ會促進3T3-L1分化和脂質(zhì)積累，并上調(diào)多種相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平，在本研究中通過RNAi技術(shù)沉默AGT基因獲得了相似的結(jié)果。轉(zhuǎn)染了AGT-shRNA干擾質(zhì)粒的3T3-L1細胞，其AGT基因mRNA和蛋白表達水平分別降低至對照的53%和43.86%，并且在分化過程中，細胞的GPDH酶活性和脂質(zhì)水平也明顯降低。GPDH是產(chǎn)生甘油-3-磷酸的唯一催化酶，是甘油三酯合成的限速酶，而甘油三酯是細胞中脂質(zhì)水平的重要指標，甘油三酯和酯質(zhì)水平是前脂肪細胞分化成熟重要標志，其水平的降低說明前脂肪細胞的分化隨著AGT基因的沉默受到明顯的抑制，該結(jié)論與本課題組在人前脂肪細胞HPA-v中的研究結(jié)果一致[16]，證明AGT基因沉默對前脂肪細胞分化的抑制作用沒有種屬差異性，但其分子機制尚需研究。此外，本研究也驗證了利用RNAi技術(shù)建立目的基因沉默的體外細胞模型是一種有效的研究方法。

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Influence of angiotensinogen gene silencing on differentiation of preadipocytes 3T3-L1

HUANG Zhili1,ZHANG Lijun1,WU Lihua2,WANG Yan1,YANG Rude2

(1. School of Applied Chemistry and Biological Technology,Shenzhen Polytechnic,Shenzhen 518055,China；2. School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Sciences and Technology,Guangzhou 510640,China)

Objective To construct the angiotensinogen (AGT)-targeting RNA interfering plasmids,and to explore the effect of AGT gene on the differentiation of preadipocytes 3T3-L1 in the mice.MethodsThe small hairpin RNA (AGT-shRNA) interference plasmids,with a scrambled Non-shRNA as control,were constructed on the basis of the activity of U6 promoter-driven expression vector psiRNA-U6.1/Neo and transfected into the mouse preadipocytes 3T3-L1.Two cell lines were generated from stable transfections.RT-PCR and SDS-PAGE were performed to monitor the mRNA and protein expressions of AGT gene, respectively.The effect of adipose AGT on the differentiation of 3T3-L1 was investigated through microscopic observation and profiling of adipocyte differentiation markers.ResultsBoth AGT-shRNA and Non-shRNA interference vectors were successfully constructed; the expression of AGT mRNA was inhibited(P<0.05)and the expression of AGT protein was 43.86% of control.Both adipocyte differentiation markers,intracytoplasmic lipid levels and glycerol-3-phophate dehydrogenase (GPDH) activities were increased during the differentiation of preadipocytes 3T3-L1,but the data were lower than those in control group(P<0.05).ConclusionAGT gene silencing can significantly inhibit the differentiation of preadipocytes 3T3-L1,which demonstrates that there is important relationship between adipocyte metabolism and renin-angiotensin system (RAS) in adipose tissue.

angiotensinogen; RNA interference; 3T3-L1; differentiation

1671-587Ⅹ(2015)06-1195-06

10.13481/j.1671-587x.20150619

2015-04-21

廣東省教育廳產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項目資助課題(2012B091100408)；深圳市科技計劃項目資助課題(07KJba160);廣東省深圳市創(chuàng)新委新興產(chǎn)業(yè)公共技術(shù)服務(wù)平臺項目資助課題(GGJS20130331152344401)

黃志立(1974-)，女，四川省興文縣人，副教授，工學(xué)博士，主要從事生物技術(shù)應(yīng)用方面的研究。

張麗君，副教授(Tel:0755-26019560,E-mail:c7zlj@szpt.edu.cn)

R34；R329.28