骨橋蛋白和趨化因子受體4在卵巢腫瘤組織中的表達及其意義

王　堃，張愛臣，盛敏佳，潘　穎，佟玲玲，孫小淳

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長春 130033)

骨橋蛋白和趨化因子受體4在卵巢腫瘤組織中的表達及其意義

王堃，張愛臣，盛敏佳，潘穎，佟玲玲，孫小淳

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長春 130033)

目的：分析骨橋蛋白(OPN)和趨化因子受體4(CXCR4)在不同卵巢組織中的表達，探討二者在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的作用。方法：選取正常卵巢組織(20例)、卵巢良性上皮性腫瘤組織(20例)和上皮性卵巢癌組織(40例)，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測不同卵巢組織中OPN和CXCR4表達，分析不同臨床特征上皮性卵巢癌組織中OPN蛋白和CXCR4蛋白表達率。結(jié)果： OPN在上皮性卵巢癌組織的陽性表達率高于在正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織表達率，不同分化程度(G1、G2和G3期)上皮性卵巢癌組織陽性表達率組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ⅲ-Ⅳ期上皮性卵巢癌組織中OPN陽性表達率明顯高于Ⅰ-Ⅱ期組(P<0.05)，在不同組織學(xué)分型上皮性卵巢癌組織(卵巢漿液性囊腺癌、卵巢黏液性囊腺癌和卵巢子宮內(nèi)膜樣癌)中OPN陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CXCR4在正常卵巢組織及卵巢良性腫瘤組織中均無陽性表達，在上皮性卵巢癌組織中呈陽性表達。CXCR4在上皮性卵巢癌不同病理分級(高分化G1、中分化G2和低分化G3)、不同臨床分期(Ⅰ-Ⅱ期、Ⅲ-Ⅳ期)、不同組織學(xué)分型(漿液性囊腺癌、黏液性囊腺癌和子宮內(nèi)膜樣癌)組織中陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：OPN和CXCR4在卵巢腫瘤細胞中表達水平與腫瘤細胞的惡性程度具有一定關(guān)聯(lián)，提示OPN和CXCR4表達通路可能成為卵巢癌治療的一個新靶點。

骨橋蛋白；趨化因子受體4蛋白；卵巢腫瘤；免疫組織化學(xué)

卵巢惡性腫瘤(ovarian cancer，OC)是女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一，其中上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)約占卵巢惡性腫瘤的80%，且在我國發(fā)病率呈上升趨勢，發(fā)病年齡趨于年輕化。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種分泌型糖基化磷蛋白，在胃癌[1]、乳腺癌[2]、卵巢癌[3]等惡性腫瘤組織中均高表達， Yeatman 等[4]研究發(fā)現(xiàn)OPN在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。CXC趨化因子受體4[chemokine (CXC-subfamily receptor 4,CXCR4]是腫瘤細胞表達最普遍的趨化腫瘤組織因子受體，在促進腫瘤細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等多種生理、病理過程中發(fā)揮著重要的作用[5-6]。目前國內(nèi)外報道中未見對于OPN和CXCR4在腫瘤中同時表達的研究。本研究擬通過對OPN和CXCR4在不同卵巢癌組織中表達情況的研究，探討二者在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)系及作用，為卵巢癌的治療開辟新思路。

1　資料與方法

1.1病理組織標(biāo)本選取2009年1月—2010年12月吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院、吉林大學(xué)第二醫(yī)院卵巢腫瘤切除標(biāo)本共80例，其中卵巢上皮性癌40例，卵巢良性上皮性腫瘤20例，正常卵巢組織20例。40例卵巢上皮性癌包括漿液性囊腺癌20例，黏液性囊腺癌10例，子宮內(nèi)膜樣癌10例；高分化癌(G1)10例，中分化癌(G2)9例，低分化癌(G3)21例；按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2000年對原發(fā)性卵巢惡性腫瘤的手術(shù)-病理分期標(biāo)準(zhǔn)分期：Ⅰ-Ⅱ期15例，Ⅲ-Ⅳ期25例(有淋巴轉(zhuǎn)移的13例)。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或激素治療。卵巢良性上皮性腫瘤20例，其中漿液性囊腺瘤15例，黏液性囊腺瘤5例。20例正常卵巢組織來自卵巢瘤樣病變、子宮肌瘤或功能性子宮出血、子宮脫垂患者行全子宮、雙附件切除術(shù)患者，經(jīng)病理證實卵巢組織無異常者。病理診斷經(jīng)2名高年資病理醫(yī)師確診。

1.2主要試劑兔抗人OPN多克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，兔抗人CXCR4單克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司)，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3實驗方法所有組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，制成4 μm切片。采用免疫組織化學(xué)方法，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。具體步驟詳見說明書。用已知陽性片及陰性片分別作為陽性及陰性對照。

1.4免疫組織化學(xué)染色OPN和CXCR4 2種蛋白均主要在細胞漿內(nèi)表達。每張切片于400倍光鏡下隨機選取4個視野，采用Motic Images Advanced 3.2 圖像分析軟件，圖像分析結(jié)果以灰度值表示，灰度值越大表達強度越弱，灰度值越小表達強度越強。-表示陰性，+表示輕度陽性，表示中等陽性，表示強陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。各組間OPN和CXCR4陽性表達率比較采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)　果

2.1免疫組織化學(xué)方法檢測OPN在不同卵巢組織中陽性表達率OPN陽性表達為胞內(nèi)有棕黃色顆粒。OPN蛋白在癌組織、良性腫瘤組織、正常組織均有表達,癌組織中陽性表達率與其他2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)， 良性腫瘤組織與正常組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1和圖1(插頁四)。

表1OPN在不同卵巢組織中的陽性表達率

Tab.1Expression rates of OPN in different ovarian tissues

GroupnOPNexpression-+—Percentage(η/%)Normalovarian201915 Benignovariantumor2018210 Ovariancancer40103075*△

*P<0.05 compared with normal ovarian group;△P<0.05 compared with benign ovarian tumor group.

2.2不同臨床病理特征上皮性卵巢癌組織中OPN蛋白表達率OPN在G1、G2和G3期上皮性卵巢癌組織中均呈陽性表達，陽性表達率組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； OPN在Ⅰ-Ⅱ期癌組織和在Ⅲ-Ⅳ期癌組織中均呈陽性表達，陽性表達率組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。OPN在漿液性囊腺癌、黏液性囊腺癌和子宮內(nèi)膜樣癌組織中均呈陽性表達,陽性表達率組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2不同病理特征上皮性卵巢癌組織中OPN陽性表達率

Tab.2Positive expression rates of OPN in epithelial ovarian cancer tissue with different pathologic features

FeaturenOPNexpression-+-Percentage(η/%)Pathologicgrade Highdifferentiation108220 Middledifferentiation92778 Lowdifferentiation21021100Clinicalstage Ⅰ-Ⅱ158747 Ⅲ-Ⅳ2522392Histologicaltype Serous2051575 Mucous102880 Endometrioidcarcinoma103770

2.3免疫組織化學(xué)方法檢測不同卵巢組織中CXCR4表達CXCR4陽性表達為胞內(nèi)有棕黃色顆粒。CXCR4在卵巢正常組織及卵巢良性腫瘤組織不表達，在上皮性卵巢癌組織中陽性表達率為63%。卵巢癌組織中CXCR4陽性表達率高于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織(χ2=21.429，P<0.05)。見表3和圖2(插頁四)。

表3CXCR4在不同卵巢組織中的表達

Tab.3Expreeions of CXCR4 in different ovarian tissues

GroupnCXCR4expression-+-Percentage(η/%)Normalovarian202000Benignovariantumor202000Ovariancancer40152563

2.4不同臨床病理特征上皮性卵巢癌組織中CXCR4陽性表達率CXCR4蛋白在G1、G2和G3期上皮性卵巢癌組織中均呈陽性表達,陽性表達率三者間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CXCR4在Ⅰ-Ⅱ期癌組織與Ⅲ-Ⅳ期巢癌組織中均呈陽性表達，陽性表達率組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CXCR4在漿液性囊腺癌、黏液性囊腺癌和子宮內(nèi)膜樣癌組織中均呈陽性表達,陽性表達率組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4不同臨床病理特征上皮性卵巢癌組織中CXCR4陽性表達率

Tab.4Positive expression rates of CXCR4 in epithelial ovarian cancer tissue with different clinicopathologic features

FeaturenCXCR4expression-+-Percentage(η/%)Pathologicgrade Highdifferentiation105550 Middledifferentiation95444 Lowdifferentiation21111048Clinicalstage Ⅰ-Ⅱ1541173 Ⅲ-Ⅳ25121352Histologicaltype Serous2091155 Mucous105550 Endometrioidcarcinoma104660

3　討　論

上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移是多種蛋白協(xié)同作用的一個過程。已有研究[4]證實：OPN在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，主要參與腫瘤的轉(zhuǎn)移[7]及免疫逃逸[8]；Ray等[9]首次報道了CXCR4與腫瘤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)，其不僅可促進腫瘤細胞增殖及抑制凋亡，還可以引起細胞內(nèi)肌動蛋白的聚合和偽足的形成，從而促進腫瘤細胞的運動和遷移。

OPN和CXCR4在卵巢腫瘤細胞表面呈陽性均表達。OPN與整合素αVβ3相互作用，通過活化核因子κB(NF-κB)途徑從而抑制細胞凋亡，也可通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-AKT 信號途徑抑制細胞的凋亡，進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長與轉(zhuǎn)移。而核因子κB(胞外信號活化轉(zhuǎn)錄因子)可上調(diào)CXCR4的表達[10]，即核因子κB 借助于位于p65和p50亞基的非經(jīng)典反應(yīng)元件結(jié)合到CXCR4啟動子的-66至+ 7 序列位置，從而上調(diào)CXCR4的表達與轉(zhuǎn)錄，促進CXCR4與之配體SDF-1的結(jié)合，進而促進腫瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移，同時OPN能夠上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達，進而激活生長因子、黏附分子和蛋白水解酶及其受體，使凝血酶原被激活，進而促進腫瘤新生血管的形成。VEGF又可通過自分泌途徑，誘導(dǎo)CXCR4在癌細胞中的表達[11]。

本研究結(jié)果顯示：OPN蛋白在上皮性卵巢癌組織中的陽性表達率明顯高于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織。Rosen 等[12]發(fā)現(xiàn)：OPN 在正常卵巢上皮細胞、交界性卵巢腫瘤及漿液性卵巢癌組織中表達依次升高；Kim 等[13]發(fā)現(xiàn)：OPN在侵襲性及交界性卵巢腫瘤組織中的表達水平明顯高于卵巢良性腫瘤及卵巢正常組織。本研究結(jié)果還顯示：卵巢上皮性癌中組織分化程度越低，OPN陽性表達率越高。Coppola 等[14]研究發(fā)現(xiàn)：OPN在多種腫瘤組織中高表達，而且OPN 的表達與腫瘤的病理分級有密切關(guān)聯(lián)，為判斷卵巢癌的惡性程度及預(yù)后提供了必要的理論參考依據(jù)。本研究還證實了OPN的陽性表達率在Ⅲ-Ⅳ期上皮性卵巢癌組織中明顯高于Ⅰ-Ⅱ期上皮性卵巢癌組織。Matsuura等[15]報道：OPN的高表達能增強卵巢癌的侵襲作用。本研究結(jié)果顯示：上皮性卵巢癌組織中CXCR呈陽性表達，在其余組織中均不表達。研究[16]發(fā)現(xiàn)：多種癌組織中均有CXCR4表達。本研究結(jié)果顯示：在上皮性卵巢癌組織中，CXCR4與上皮性卵巢癌的分化程度、臨床分期及組織學(xué)分型均無關(guān)聯(lián)。Retz等[17]證實：CXCR4在膀胱癌腫瘤細胞中表達，而且其在浸潤性腫瘤中的表達水平高于在淺表性腫瘤的表達，在正常膀胱黏膜中不表達。Ottaiano等[18]研究發(fā)現(xiàn)：大腸癌細胞表面高表達CXCR4。CXCR4雖與上皮性卵巢癌的病理分級、臨床分期及組織分型無關(guān)聯(lián)，但其在上皮性卵巢癌組織中的表達強度明顯高于正常組織及良性上皮性卵巢腫瘤組織，提示CXCR4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起至關(guān)重要的作用。本文作者推測：阻斷SDF-1/CXCR4生物軸可以抑制腫瘤的發(fā)生和增殖，阻斷SDF-1 /CXCR4生物軸，有望成為腫瘤靶向治療的新途徑。

綜上所述，OPN與CXCR4表達的上調(diào)能夠促進上皮性卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，以O(shè)PN與CXCR4表達通路為靶點，抑制其表達，可能為上皮性卵巢癌的治療提供一種基因治療的新方法。

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Expressions of OPN and CXCR4 in human epithelial ovarian cancer tissue and their clinical significances

WANG Kun，ZHANG Aichen，SHENG Minjia，PAN Ying，TONG Lingling，SUN Xiaochun

(Department of Obstetrics and Gynecology,China-Japan Union Hopsital,Jilin University,Changchun 130033,China)

ObjectiveTo analyze the expressions of osteopontin(OPN) and chemokine(CXC-subfamily)receptor 4(CXCR4) in different ovarian tissues,and to explore the role of OPN and CXCR4 in occurrence,development and metastasis of human ovarian cancer.Methods The expressions of OPN and CXCR4 in normal ovarian tissue(n=20),benign ovarian epithelial tumor(n=20) and epithelial ovarian cancers tissues(n=40) were detected by immunohistochemical SP method, and the expression rates of OPN and CXCR4 in epithelial ovarian cancer tissue with different clinical characteristics were analyzed.ResultsThe positive expressions rate of OPN in epithelial ovarian cancer tissue was significantly higher than those in normal ovarian tissue and benign ovarian tumor tissue,and there were significant differences in the positive expression rates of OPN between different pathological stages (G1,G2,G3) of epithelial ovarian cancer (P<0.05).Meanwhile,the positive expression rate of OPN in Ⅲ-Ⅳ epithelial ovarian cancer tissue was significantly higher than that in Ⅰ-Ⅱ epithelial ovarian cancer tissue (P<0.05).However,there were no significant differences of the positive expression rates of OPN among different histological types of epithelial ovarian cancer tissue (P>0.05).There was no positive expression of CXCR4 protein in normal ovarian tissue and benign ovarian tumor tissues ,but there was positive expression in epithelial ovarian cancer tissue.Besides,the expressions of CXCR4 protein were not significantly different among different pathological grades,different clinical stages and different histological types (P>0.05).ConclusionThe OPN and CXCR4 expression levels are correlated with the degrees of malignancy in epithelial ovarian tumor,therefore the CXCR4 and OPN expression pathways may be the new targets for ovarian cancer therapy.

osteopontin;chemokine(CXC-subfamily)receptor 4; ovarian neoplasms;immunohistochemistry

1671-587Ⅹ(2015)06-1186-04

10.13481/j.1671-587x.20150617

2015-04-07

吉林省科技廳國際合作項目資助課題(20150414036GH)；吉林省財政廳科研項目資助課題(2012008)

王堃(1982-)，女，黑龍江省牡丹江市人，醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事婦科腫瘤方面的研究。

張愛臣,教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師(Tel：0431-84995960，E-mail：zhangac2015@126.com)

R737.71

A