淫羊藿苷對(duì)NB4白血病細(xì)胞株增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制

宋　飛，高素君，張?jiān)莆?，杜雅哲，王　露，王瑞芳，蘇　龍

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長(zhǎng)春 130021)

淫羊藿苷對(duì)NB4白血病細(xì)胞株增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制

宋飛，高素君，張?jiān)莆担叛耪?，王露，王瑞芳，蘇龍

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的：研究淫羊藿苷(ICA)對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞株增殖和凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。方法：選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 NB4細(xì)胞，隨機(jī)分為空白對(duì)照組和不同濃度(4、8、16、32和64 μmol·L-1)ICA組，采用MTT法檢測(cè)作用不同時(shí)間(24、48和72 h)后各組 NB4細(xì)胞增殖活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞24 h時(shí)細(xì)胞周期進(jìn)程及48 h時(shí)凋亡情況，采用Western blotting法檢測(cè)各組NB4細(xì)胞48 h時(shí)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間(24、48和72 h)后，各ICA組細(xì)胞增殖抑制率高于空白對(duì)照組(P<0.05)，隨ICA濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05)。各濃度ICA(4、8、16、32和64 μmol·L-1)組NB4細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡率分別為(6.52±4.12)%、(10.07±2.36)%、(15.41±3.64)%、(25.18±1.24)%和(29.41±1.43)%，與空白對(duì)照組[(2.39±1.87)%]比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。各濃度ICA(8、16、32和64 μmol·L-1)組NB4細(xì)胞24 h后 S期NB4細(xì)胞百分率降低，G1期細(xì)胞百分率升高，與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blotting 檢測(cè)，與空白對(duì)照組比較，各濃度ICA組NB4細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。結(jié)論：ICA通過(guò)抑制Bcl-2蛋白表達(dá)水平和上調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞株凋亡。

淫羊藿苷；白血??；NB4細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

淫羊藿為中國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，其主要成分為黃酮類化合物，淫羊藿苷(Icariin,ICA)就是從淫羊藿中提取的黃酮類單體成分。國(guó)內(nèi)外研究表明：ICA對(duì)多種實(shí)體瘤細(xì)胞具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用。在血液系統(tǒng)腫瘤方面，ICA可抑制急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡及分化[1-2]，同時(shí)對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞也具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用[3]。急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)NB4細(xì)胞株具有t(15;17)(q22;q21)，且PML/RARα融合基因陽(yáng)性，是體外研究APL的理想模型。有關(guān)ICA對(duì)APL作用的研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究探討ICA對(duì)典型APL NB4細(xì)胞株的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用及機(jī)制，旨在為ICA在APL治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器ICA粉劑由南京澤朗科技公司提供，純度為98%，用二甲基亞砜(DMSO)配制成母液，-20℃保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋(使DMSO濃度<0.1%)；溴化四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)Sigma公司)，用10 mL PBS溶解50 mg MTT，使其濃度為5 g·L-1，4℃避光保存，2周內(nèi)使用；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；Armexinv/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(北京碧云天生物制品公司)；Bcl-2(兔抗人)和BAX(兔抗人)抗體(武漢博士德生物制品公司)；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔 IgG(美國(guó)Sigma公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Piece Biotechnology公司)；Western blotting細(xì)胞裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)公司)。BB16UVCO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Eppendorf公司)，水浴式電轉(zhuǎn)印槽DYY-Ⅲ40B型(北京六一儀器廠)，凝膠自動(dòng)成像儀GDS 8000和電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，Sundrise自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(美國(guó)Tecan公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)NB4細(xì)胞為懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞株，由本實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPML 1640培養(yǎng)基中，常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，加入等體積不同濃度ICA，使終濃度為4、8、16、32和64 μmol·L-1，空白對(duì)照組中加等體積培養(yǎng)液，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NB4細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，加入等體積終濃度分別為4、8、16、32和64 μmol·L-1ICA，空白對(duì)照組中加等體積培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)平行孔，37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育20、44和68 h后，加入20 μL/孔MTT(5 g·L-1)，同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，加入100 μL/孔新三聯(lián)溶液，繼續(xù)上述條件下培養(yǎng)12 ～ 16 h后，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)各孔吸光度(A570)值，取3孔平均值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，檢測(cè)對(duì)照組和各濃度ICA組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 = (1-實(shí)驗(yàn)組A570值/對(duì)照組A570值) × 100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)程以1×106個(gè)細(xì)胞接種，ICA組藥物濃度為8、16、32和64 μmol·L-1，空白對(duì)照組加等體積培養(yǎng)液，作用24 h后，收集細(xì)胞，PBS洗2次，75%冷乙醇固定12 h以上，上機(jī)前棄乙醇，PBS洗1次，加入Rnase 100 mg·L-1，加入5 g·L-1碘化丙啶(PI)染色劑，室溫下避光染色30 min，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，利用CellQuest分析軟件分析各組G1和S期NB4細(xì)胞所占百分率。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率ICA組藥物終濃度分別為4、8、16、32和64 μmol·L-1，空白對(duì)照組加等體積的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞1×106個(gè)，冷PBS洗滌2次后，用Annexin結(jié)合緩沖液50 μL懸浮細(xì)胞，加Annexin Ⅴ/FITC 5 μL，室溫下避光放置10 min，加PI 10 μL，混合后室溫避光放置5 min，冷PBS洗1次，再加300 μL Annexin結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，立即在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，結(jié)果以細(xì)胞凋亡率表示。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6Western blotting法檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組藥物終濃度分別為8、16、32和64 μmol·L-1，空白對(duì)照組加等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，按照蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PVDF)。用含脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，加入一抗(Bcl-2 1∶800，Bax 1∶800)，室溫孵育60 min，4℃過(guò)夜，加入HRP偶聯(lián)的二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，ECL試劑顯色。ZEISS全自動(dòng)圖像分析儀分析，以Image J分析軟件測(cè)量條帶灰度值，以目的條帶與β-actin條帶灰度值比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)　果

2.1MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率ICA呈濃度依賴性抑制NB4細(xì)胞增殖，隨著ICA濃度的增加，ICA各濃度組增殖抑制率逐漸升高，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ICA作用NB4細(xì)胞后，其增殖抑制率也呈時(shí)間依賴性。見(jiàn)表1。

表1　各濃度ICA組作用24、48和72 h時(shí)NB4細(xì)胞增殖抑制率

*P<0.05 compared with blank control group.

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期與空白對(duì)照組比較，各濃度ICA組S期NB4細(xì)胞百分率降低(P<0.05)，隨著藥物濃度的增加，G1期細(xì)胞百分率升高(P<0.05)，且呈濃度效應(yīng)關(guān)系。見(jiàn)表2。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率各濃度ICA(4、8、16、32和64 μmol·L-1)組NB4細(xì)胞48 h時(shí)細(xì)胞凋亡率分別為(6.52±4.12)%、(10.07±2.36)%、(15.41±3.64)%、(25.18±1.24)%和(29.41±1.43)%，與空白對(duì)照組(2.39±1.87)%比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平各濃度ICA( 8、16、32和64 μmol·L-1)組NB4細(xì)胞48 h時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)水平高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表3。

表2各組NB4細(xì)胞各周期細(xì)胞百分率

*P<0.05 compared with blank control group.

Lane 1: Blank control group；Lane 2-5:8,16,32,64 μmol·L-1ICA groups.

圖1Western blotting 法檢測(cè)各組NB4細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.1Electrophoregram of expressions of apoptosis-associated proteins in NB4 cells detected by Western blotting method in various groups after treated for 48 h

表3各組NB4細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

Tab.3Expression levels of apoptosis-associated proteins in NB4 cells in various groups

GroupBcl-2/β-actinBax/β-actinBlankcontrol1.203±0.0250.235±0.075ICA(μmol·L-1) 80.064±0.011*0.312±0.056* 160.053±0.005*0.421±0.008* 320.041±0.023*0.503±0.075* 640.029±0.007*0.624±0.126*

*P<0.05 compared with blank control group.

3　討　論

APL是一類預(yù)后良好的白血病，骨髓中以異常的早幼粒細(xì)胞增多為主，90%以上伴有特征性染色體改變：t(15;17)(q22；q21)，形成PML/RARα融合基因，臨床上以出血為主要表現(xiàn)，長(zhǎng)期生存率達(dá)80%以上。

早期研究[1-3]顯示：ICA可抑制急性髓系白血病細(xì)胞HL-60及慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其分化和凋亡，但對(duì)APL細(xì)胞株國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究選用典型APL細(xì)胞NB4細(xì)胞株，ICA對(duì)其增殖影響的結(jié)果表明：ICA顯著抑制NB4細(xì)胞增殖，且呈時(shí)間-劑量依賴性。許多中藥的有效成分能夠作用于腫瘤細(xì)胞周期某一環(huán)節(jié)，從而使細(xì)胞增殖受阻、誘導(dǎo)凋亡。研究[4-6]發(fā)現(xiàn)：ICA可使胃癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而抑制腫瘤增殖，還可逆轉(zhuǎn)人甲狀腺癌SW579細(xì)胞系的惡性表型，通過(guò)下調(diào)Id-1 mRNA水平來(lái)激活p21基因表達(dá)[7]，從而使SW579細(xì)胞從S期向G1/G0期逆轉(zhuǎn)，完成誘導(dǎo)分化。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ICA對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制的機(jī)制為影響細(xì)胞周期，對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞ICA在細(xì)胞周期中的作用機(jī)制不盡相同。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度ICA處理NB4細(xì)胞24 h后，G1期細(xì)胞比例明顯增多，而S期細(xì)胞比例減少，使細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，干擾DNA的復(fù)制，這可能是ICA抑制NB4細(xì)胞增殖的主要機(jī)制。

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的主動(dòng)死亡過(guò)程，是維持器官組織細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的主要機(jī)制。細(xì)胞凋亡失控是腫瘤過(guò)度生長(zhǎng)的重要原因，促進(jìn)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤治療的方法。多項(xiàng)研究[8-11]表明：ICA可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: NB4細(xì)胞經(jīng)不同濃度的(4、8、16、32和64 μmol·L-1)ICA作用48 h后，其凋亡率分別為6.52%、10.07%、15.41%、25.18%和29.41%，與空白對(duì)照組比較，各濃度ICA組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見(jiàn)ICA對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用具有濃度依賴性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ICA可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制NB4細(xì)胞增殖。

細(xì)胞凋亡途徑分為外源性和內(nèi)源性2條信號(hào)通路：外源性途徑即膜表面死亡受體途徑，內(nèi)源性途徑即線粒體途徑。線粒體作為細(xì)胞生命活動(dòng)控制中心，是凋亡的感受器和放大器[12-16]，其中Bcl-2家族對(duì)線粒體內(nèi)促凋亡因子的釋放具有調(diào)控功能。Bcl-2家族成員包括Bcl-2/Bax、Bcl-xl/Bcl-xs和Bak等，其相互作用參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其中以Bcl-2/Bax的作用尤為重要[17-19]。國(guó)內(nèi)已有多項(xiàng)研究[8-10]證明：ICA可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制涉及到Bcl-2、Bax和PCNA等多種凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。ICA還可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧誘導(dǎo)骨肉瘤Saos 2細(xì)胞凋亡[11]。本研究結(jié)果顯示：ICA作用NB4細(xì)胞48 h后，Bcl-2表達(dá)水平下調(diào)，Bax表達(dá)水平上調(diào)，Bax/Bcl-2比值增大，提示ICA誘導(dǎo)凋亡作用可能與Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)改變有關(guān)，推測(cè)凋亡涉及到線粒體途徑。

綜上所述，ICA可抑制NB4細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究結(jié)果為治療APL的藥物研究提供了新的思路，但目前為止實(shí)驗(yàn)僅局限于體外研究階段，ICA對(duì)NB4細(xì)胞的體內(nèi)效應(yīng)尚需進(jìn)一步研究。

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Influence of icaritin in proliferation and apoptosis of NB4 leukemia cells and its mechanism

SONG Fei,GAO Sujun,ZHANG Yunwei,DU Yazhe, WANG Lu,WANG Ruifang,SU Long

(Tumor Center, First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo investigate the influence of icariin (ICA) on the proliferation and apoptosis of acute promyelocytic leukemia NB4 cells, and to explore its mechanism.Methods The NB4 cells at logarithm growth phase were selected and randomly divided into blank control group,different doses (4，8，16，32，64 μmol·L-1) of ICA groups.Afer the NB4 cells were treated with ICA for different time (24，48，72 h),MTT assay was used to detect the inhibitory rates of NB4 cells,flow cytometry was used to analyze the apoptosis and the cell cycle of the NB4 cells,and the expression levels of apoptosis-associated proteins were detected by Western blotting method.ResultsAfer the cells were cultivated for different time(24，48，72 h),the inhibitory rates of the cells in different doses of ICA groups were higher than those in control group (P<0.05) and they were increased in a dose-and time-dependent manner (P<0.05).The apoptotic rates of NB4 cells in different doses of ICA group 48 h after treatment were (6.52±4.12)%,(10.07±2.36)%,(15.41±3.64)%,(25.18±1.24)% and (29.41±1.43)%,and they were higher than that in control group (2.39%±1.87%) (P<0.05).The flow cytometry results showed that after the cells were cultivated for 24 h in different doses of ICA groups，the number of NB4 cells at S phase was lower than those in control group (P<0.05)，and the number of NB4 cells at G1phase was increased (P<0.05). The expression levels of Bcl-2 in ICA groups were significantly lower than that in control group (P<0.05),while the expression levels of Bax were higher than that in control group (P<0.05).ConclusionICA can induce the apoptosis of NB4 cells via inhibiting the expression level of Bcl-2 and up-regulating the expression level of Bax.

Icaritin;leukemia;NB4 cells;apoptosis

1671-587Ⅹ(2015)06-1181-05

10.13481/j.1671-587x.20150616

2015-08-19

吉林省科技廳自然科學(xué)基金資助課題(3D5111013428；2008)

宋飛(1986-)，女，山東省泰安市人，醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事血液病的基礎(chǔ)與臨床方面的研究。

高素君，教授，碩士研究生導(dǎo)師(Tel：0431-88782157，E-mail：sujung@sina.com)

R-332；R552

A