Dectin-1和TLR4在煙曲霉菌性角膜炎大鼠角膜組織中的表達(dá)及其在角膜炎發(fā)病中的作用

任　毅，甘勝偉,李平華

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，重慶400016)

Dectin-1和TLR4在煙曲霉菌性角膜炎大鼠角膜組織中的表達(dá)及其在角膜炎發(fā)病中的作用

任毅，甘勝偉,李平華

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，重慶400016)

目的：探討煙曲霉菌感染大鼠角膜后Dectin-1和Toll樣受體-4(TLR4)表達(dá)及炎癥因子的分泌特點(diǎn)，闡明其在大鼠角膜炎發(fā)病中的作用。方法：40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)和煙曲霉菌性角膜炎組(n=30)，對(duì)照組不予任何干預(yù)，煙曲霉菌性角膜炎組給予雙眼煙曲霉菌感染造模，分別于感染12 h(n=10，12 h組)、24 h(n=10，24 h組)和48 h(n=10，48 h組)后取角膜組織，ELISA法檢測(cè)IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10和NF-κB水平，免疫組織化學(xué)法、RT-PCR法及Western blotting法測(cè)定角膜組織中Dectin-1和TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果：大鼠造模均成功，眼角膜裂隙燈檢測(cè)觀察可見對(duì)照組眼睛清澈，感染煙曲霉菌后，12 h組眼睛表面有明顯的一層薄膜，薄膜與健康的角膜邊界清晰；24 h組可見眼部有一層白色的浸潤(rùn)灶形成，且表面粗糙；48 h組角膜白色浸潤(rùn)灶進(jìn)一步加深，且范圍明顯擴(kuò)大，基本覆蓋了整個(gè)眼球。煙曲霉菌感染后，12 h組、24 h組和48 h組角膜組織中炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，其中24 h組和48 h組明顯高于12 h組(P<0.05)，48 h組明顯高于24 h組(P<0.05)；免疫組織化學(xué)檢測(cè)，大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4表達(dá)水平隨著感染時(shí)間的增加逐漸增加，RT-PCR法和Western blotting法檢測(cè)，大鼠眼角膜組織煙曲霉菌性角膜炎組(12 h組、24 h組和48 h組)Dectin-1和TLR4蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，其中24 h組和48 h組明顯高于12 h組(P<0.05)，48 h組明顯高于24 h組(P<0.05)。結(jié)論：Dectin-1和TLR4在受到煙曲霉菌感染后可過量分泌，進(jìn)而造成大鼠炎性相關(guān)因子表達(dá)，最終促使角膜炎的發(fā)生。

真菌性角膜炎；煙曲霉菌；模式識(shí)別受體-1；Toll樣受體-4

真菌性角膜炎(fungal keratitis)是困擾醫(yī)學(xué)界的一個(gè)難題[1]，該病發(fā)病急，治療難度大，屬于嚴(yán)重致盲性眼病的一種。既往的研究[2]表明：真菌性角膜炎不易康復(fù)可能與免疫損傷密切相關(guān)，Dectin-1和Toll樣受體-4(Toll-like receptor,TLR4)是介導(dǎo)免疫反應(yīng)的2個(gè)重要因子，同時(shí)也是促炎性因子，Chai 等[3]曾發(fā)現(xiàn)Dectin-1和TLR4在眼角膜中有一定的表達(dá)；Leal等[4]指出：Dectin-1和TLR4促進(jìn)角膜炎的發(fā)生可能與刺激中性粒細(xì)胞表達(dá)有關(guān)。但關(guān)于上述2種蛋白表達(dá)的定量分析國(guó)內(nèi)外還沒有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)Dectin-1和TLR4在大鼠煙曲霉菌性角膜炎各病程角膜組織中的表達(dá)，闡明Dectin-1和TLR4在大鼠角膜炎發(fā)病中的作用，為真菌性角膜炎治療提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器健康SD大鼠40只，雄雌各半，體質(zhì)量300～400 g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK渝2007-0001，造模前所有大鼠均用眼科裂隙燈檢查無相關(guān)眼部疾病感染；IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB試劑盒購于德國(guó)Roche Diagnostics GmbH公司,多克隆抗體Dectin-1和TLR4、單克隆抗體β-actin購于美國(guó)Santa Cruz公司，相應(yīng)二抗購于金斯瑞生物科技有限公司，ECL發(fā)光試劑盒購于江蘇碧云天生物有限公司，總RNA提取試劑盒購自北京天根公司，引物購于南京金斯瑞生物科技有限公司，SYBR Green通用型qPCR Master Mix 購自瑞士Roche生物；Real-time PCR擴(kuò)增儀購自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株煙曲霉菌(Aspergillusfumigutus，AF)標(biāo)準(zhǔn)菌種購于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物研究所，低溫保存，實(shí)驗(yàn)前解凍，接種到含有一定量的沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)時(shí)控制溫度為25℃，培養(yǎng)6～9 d后取出，用消毒后的生理鹽水反復(fù)吹打斜面，吸出，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子，制成孢子濃度為108CFU·mL-1的菌懸液，振蕩混勻。

1.3大鼠分組及模型的建立40只SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和煙曲霉菌性角膜炎組，對(duì)照組(n=10,全程不予任何干預(yù))，煙曲霉菌性角膜炎組分為感染12 h組(n=10，12 h 組)、24 h組(n=10，24 h組)和48 h組(n=10，48 h組)，所有大鼠在實(shí)驗(yàn)前3 d給予氯霉素眼液點(diǎn)雙眼，每天4次；實(shí)驗(yàn)時(shí)用1%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠(1 mL/100 g體質(zhì)量)，大鼠及實(shí)驗(yàn)操作人員常規(guī)消毒后開始眼科造模手術(shù)，眼科造模手術(shù)全程在顯微鏡下進(jìn)行。用4 mm環(huán)鉆在角膜中央進(jìn)行定位，之后用無菌手術(shù)刀刮除角膜中央4 mm左右的上皮層，上述步驟完成后汲取菌懸液20滴，滴在刮除上皮的角膜面，蓋上角膜接觸鏡(由重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)院眼科實(shí)驗(yàn)室自制，使用Parafilm M 封口膜模壓制)。對(duì)照組給予同樣量的無菌生理鹽水滴入，最后進(jìn)行瞼裂縫合。分別于12、24和48 h后打開瞼裂，照相后取出全眼角膜，行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.4ELASA法檢測(cè)大鼠角膜中相關(guān)炎性因子表達(dá)從超低溫冰箱中取出角膜病灶區(qū)組織5 mg，加入50 μL組織蛋白裂解液，超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞(300 W)，電子勻漿機(jī)勻漿后，離心提取上述上清液以BCA法定量，定量后采用相應(yīng)試劑盒測(cè)定IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB水平。

1.5免疫組織化學(xué)染色免疫組織化學(xué)染色參照PV9000二步法免疫組織化學(xué)試劑盒說明書。工作濃度配好后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光鏡觀察，以圖片中褐色顆粒數(shù)量和顏色程度判斷其表達(dá)水平。

1.6RT-PCR法檢測(cè)檢測(cè)大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4 mRNA表達(dá)水平稱取15 mg角膜病灶區(qū)組織，總RNA提取試劑盒提取總RNA，總RNA定量，定量后每個(gè)樣本取2 μg行逆轉(zhuǎn)錄cDNA；逆轉(zhuǎn)出的cDNA用試劑盒提供的相應(yīng)預(yù)混液行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增次數(shù)為36次，擴(kuò)增條件按照引物說明書進(jìn)行；擴(kuò)增出DNA片段行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀拍照采集數(shù)據(jù)，Image J軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度值，用β-actin作內(nèi)參，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。β-actin引物設(shè)計(jì)：上游引物，5′-GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3′；下游引物，5′-ACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGTGG-3′；產(chǎn)物長(zhǎng)度123 bp。Dectin-1引物設(shè)計(jì)：Primer A，5′-CGTATCGGGGTATTCGGAGA-3′，Primer B，5′-CCATGCTAGGTGATGCTAGG-3′；產(chǎn)物長(zhǎng)度343 bp。TLR4引物設(shè)計(jì)：上游引物，5′-CGTATACGACGAGTTCCAGT-3′；下游引物，5′-GGACTTGTTGGACGTCGAGA-3′；產(chǎn)物長(zhǎng)度356 bp。以相應(yīng)蛋白熒光強(qiáng)度值/β-actin熒光強(qiáng)度值的比值作為Dectin-1和TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.7Western blotting法檢測(cè)大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4蛋白表達(dá)水平取出眼角膜病灶區(qū)組織10 mg，加入100 μL組織蛋白裂解液，用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞(300 W)，電子勻漿機(jī)勻漿后，離心提取上述上清液，并用BCA法測(cè)定蛋白含量，在定量后取樣本40 μg進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，電泳結(jié)束后半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗過夜，第2天洗膜3次，之后加入相應(yīng)二抗，最后洗膜3次，暗室內(nèi)ECL曝光洗片，掃描儀掃描膠片后用Image J軟件計(jì)算灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以相應(yīng)蛋白灰度值/β-actin灰度值的比值作為蛋白表達(dá)水平。

2　結(jié)　果

2.1眼科裂隙燈觀察模型建立處死大鼠前，用眼科裂隙燈觀察大鼠角膜：對(duì)照組大鼠眼球清澈，無真菌感染發(fā)生，12 h組眼球表面有明顯的一層薄膜，薄膜與健康角膜邊界清晰；24 h組可見整個(gè)眼部均有一層白色浸潤(rùn)灶形成，且表面粗糙，眼球上方可見明顯血絲；48 h組角膜白色浸潤(rùn)灶進(jìn)一步加深，且范圍明顯擴(kuò)大，基本覆蓋了整個(gè)眼球。上述結(jié)果提示成功建立大鼠模型。見圖1(插頁三)。

2.2ELISA法測(cè)定眼角膜組織中炎性因子表達(dá)水平12 h組、24 h組和48 h組IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，上述5個(gè)指標(biāo)均呈逐步升高的趨勢(shì)，其中24 h組和48 h組明顯高于12 h組(P<0.05)，48 h組明顯高于24 h組(P<0.05)。見表1。

2.3免疫組織化學(xué)染色觀察大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4蛋白表達(dá)及菌絲12 h組、24 h組和48 h組大鼠角膜組織中褐色顆粒數(shù)量和顏色呈逐步增加的趨勢(shì)；此外，相關(guān)角膜最外圍可見一層菌絲生長(zhǎng)，進(jìn)一步提示造模成功。見圖2(插頁三)。

2.4RT-PCR法檢測(cè)大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4 mRNA表達(dá)12 h組、24 h組以及48 h組大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，同時(shí)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其mRNA表達(dá)水平呈逐步升高的趨勢(shì)，其中24 h和48 h組明顯高于12 h組(P<0.05)，48 h組明顯高于24 h組(P<0.05)。見圖3和表2。

表1　ELISA法檢測(cè)各組大鼠角膜組織中炎性因子水平

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with 12 h group；#P<0.05 compared with 24 h group.

Lane 1,2:Control group; Lane 3,4:12 h group; Lane 5,6:24 h group; Lane 7,8:48 h group.

圖3各組大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4 mRNA表達(dá)電泳圖

Fig.3Electrophoregram of expressions of Dectin-1 and TLR4 mRNA in corneal tissue of rats in various groups

表2Dectin-1/β-actin 和TLR4/β-actin 的定量分析

Tab.2Quantitative analysis of Dectin-1/β-actin and TLR4/β-actin

GroupDectin-1TLR4Control0.31±0.010.19±0.01Fungalkeratitis 12h0.78±0.03*0.58±0.03* 24h1.05±0.05*△0.90±0.05*△ 48h1.45±0.04*△#1.17±0.04*△#

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with 12 h group；#P<0.05 compared with 24 h group.

2.5Western blotting法檢測(cè)大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4蛋白表達(dá)12 h組、24 h組和48 h組大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，其中24 h和48 h組明顯高于12 h組(P<0.05)，48 h組也明顯高于24 h組(P<0.05)。見圖4和表3。

Lane 1,2:Control group; Lane 3,4:12 h group; Lane 5,6:24 h group; Lane 7,8:48 h group.

圖4各組大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.4Electrophoregram of expressions of Dectin-1 and TLR4 in corneal tissue of rats in various groups

表3Dectin-1/β-actin 和TLR4/β-actin 的定量分析

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with 12 h group；#P<0.05,compared with 24 h group.

3　討　論

煙曲霉菌屬于曲霉菌屬中一種最為常見的、同時(shí)也是致病性最強(qiáng)的一種病原菌，近年來關(guān)于煙曲霉菌感染角膜致使其發(fā)生炎癥的報(bào)道越來越多，同時(shí)相關(guān)研究報(bào)道也逐年增加，但關(guān)于其感染的確切機(jī)制還沒有明確的文獻(xiàn)報(bào)道[5]。煙曲霉菌角膜炎是最嚴(yán)重的感染性角膜病之一，由于一般抗菌藥物難以完全殺死煙曲霉菌，所以治療難度大，一經(jīng)感染常引起角膜潰瘍和角膜穿孔，甚至可能發(fā)生失明[6-7]。我國(guó)由于人口眾多，同時(shí)人們之間交流頻繁，致使本病發(fā)病率逐年升高[8]，給患者帶來了嚴(yán)重身心負(fù)擔(dān)。

Dectin-l是一種較為常見的C型凝集素樣模式識(shí)別受體，其在體內(nèi)主要由DCs以及巨噬細(xì)胞表達(dá)，該蛋白一般表達(dá)量極少，當(dāng)真菌感染后，巨噬細(xì)胞可識(shí)別真菌細(xì)胞壁上的甘露聚糖以及葡聚糖，導(dǎo)致Dectin-l信號(hào)通路激活，促進(jìn)Dectin-l的大量分泌[9-11]。Balderramas等[12]研究發(fā)現(xiàn)：Dectin-1可以與ITAM結(jié)合，激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而造成炎性反應(yīng)的發(fā)生，促進(jìn)IL-1和IL-6等炎癥因子的釋放。TLR是人體內(nèi)一種較為常見的天然免疫受體，以往的研究證實(shí)TLR基因與果蠅胚胎背、腹側(cè)的發(fā)育有關(guān)[13-15]。隨著研究的不斷深入，醫(yī)學(xué)界證實(shí)哺乳動(dòng)物體內(nèi)也有類似的同源性受體，同時(shí)將這一類受體歸為TLR家族，這其中TLR4是最為常見的一種[16]，其可以介導(dǎo)內(nèi)毒素/脂多糖應(yīng)答的最主要受體，與TLR4細(xì)菌感染引起的膿毒血癥以及炎癥因子IL-10有密切關(guān)聯(lián)[17]，當(dāng)真菌感染發(fā)生后，Dectin-l可與TLR4共同作用，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生。

目前國(guó)內(nèi)還沒有關(guān)于煙曲霉菌角膜炎中Dectin-1以及TLR4聯(lián)合作用促進(jìn)角膜炎發(fā)生和發(fā)展的研究。本研究結(jié)果顯示：大鼠造模均成功，在煙曲霉菌感染12 h后，角膜組織中炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組;免疫組織化學(xué)、Western blotting法和RT-PCR法測(cè)定大鼠眼角膜組織提取液，12 h、24 h和48 h組大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4蛋白及mRNA表達(dá)水平也明顯高于對(duì)照組。本研究結(jié)果并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[12，17]綜合提示：煙曲霉菌感染可以促進(jìn)Dectin-1和TLR4蛋白及mRNA表達(dá)，Dectin-1表達(dá)水平的升高，促進(jìn)了NF-κB過量分泌，而NF-κB過量分泌又進(jìn)一步促進(jìn)了IL-1和IL-6表達(dá)水平的升高， TLR4表達(dá)的升高則促進(jìn)了角膜炎性因子IL-10過度分泌，最終促進(jìn)了真菌性角膜發(fā)生。

綜上所述，Dectin-1和TLR4是炎性促發(fā)因子，在煙曲霉菌感染后可促使其過量分泌，造成大鼠炎性相關(guān)因子表達(dá)，促進(jìn)了角膜炎的發(fā)生。

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Expressions of TLR4 and Dectin-1 in cornea tissue of rats with Aspergillus fungal keratitis and their effects in pathogenesis of keratitis

REN Yi,GAN Shengwei,LI Pinghua

(Department of Ophthalmology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

ObjectiveTo explore the expressions of Dectin-1 and Toll-like receptor 4 (TLR4) and the secretory charateristics of inflammatory factors of theAspergillusfumigatusinfected cornea of the rats,and to clarify theirs role in the pathogenesis of rat keratitis.Methods 40 SD rats were separated into control group(n=10) and aspergillus keratitis group(n=30).The rats in aspergillus keratitis group were infected byAspergillusfumigatusin two eyes for 12,24 and 48 h,and the cornea tissue was took and ELISA kit was used to detect the level of inflammatory cytokines IL-1,TNF-a,IL- 6,IL-10,and NF-κB; immunohistochemistry,Western blotting and RT-PCR methods were used to determine the Dectin-1 and TLR4 protein and mRNA expressions.ResultsThe rat models were successfully established.The eyes of the rats in control group were limpid tested by corneal slit lamp,however,there existed a clear boundary film on the surface of eyes of the rats in aspergillus keratitis group infected for 12 h,white infiltrates and bloodshot in the eyes in 24 h group and the white infiltrates were further strengthened and almost covered the entire eyes in 48 h group. The order of inflammatory cytokines IL-1,TNF-α,IL-6,IL-10,NF-κB was:48 h group>24 h group>12 h group>control group(P<0.05),so did the expression levels of Dectin-1 and TLR4 protein and mRNA in various groups tested by Western blotting and RT-PCR methods.The expression levels of Dectin-1 and TLR4 were increased with the prolongation of time investigated by immunohistochemical staining.ConclusionDectin-1 and TLR4 are secreted in excess after the eyes are infected with fumigatus,which promotes the expressions of related inflammatory cytokines and results in the occurrence of keratitis.

fungal keratitis;Aspergillusfumigatus; Dectin-1; Toll-like receptor

1671-587Ⅹ(2015)06-1176-05

10.13481/j.1671-587x.20150615

2015-02-26

重慶市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科技項(xiàng)目資助課題(cstc2011jjA10003)

任毅(1981-)，男，四川省鄰水縣人，主治醫(yī)師，在讀醫(yī)學(xué)碩士，主要從事角膜及眼表疾病方面的研究。

李平華，教授，碩士研究生導(dǎo)師(Tel：023-68894420， E-mail:lipinghua@126.com)

R772.21

A