黃芩苷對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其機(jī)制

賴明廣，青海濤，王立生 ，劉圣活

(1.廣東省深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院腔鏡中心，廣東 深圳518100；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510515；3.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科，廣東 深圳518020)

黃芩苷對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其機(jī)制

賴明廣1，青海濤2，王立生3，劉圣活1

(1.廣東省深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院腔鏡中心，廣東 深圳518100；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510515；3.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科，廣東 深圳518020)

目的：探討黃芩苷對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響，并闡明其作用機(jī)制。 方法：SW480細(xì)胞分為空白對(duì)照組，25、50和100 μmol·L-1黃芩苷組，采用CCK-8法檢測(cè)SW480細(xì)胞增殖活性，Annexin Ⅴ-FITC和DAPI染色觀察SW480細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，Western blotting法檢測(cè)凋亡蛋白Bcl-2、caspase 3和caspase 9表達(dá)水平。 結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，50和100 μmol·L-1黃芩苷組SW480細(xì)胞增殖活性在24、48和72 h均明顯降低(P<0.01)，25 μmol·L-1黃芩苷組SW480細(xì)胞增殖活性在48和72 h明顯降低(P<0.01)。50 μmol·L-1黃芩苷作用48 h時(shí)SW480細(xì)胞處于早期或晚期凋亡狀態(tài)，細(xì)胞核呈濃縮和破碎狀態(tài)。與空白對(duì)照組比較，25、50和100 μmol·L-1黃芩苷組caspase 3和caspase 9蛋白表達(dá)水平明顯升高 (P<0.05或P<0.01)，Bcl 2蛋白表達(dá)水平明顯降低 (P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：黃芩苷可以誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與線粒體途經(jīng)有關(guān)。

黃芩苷；SW480細(xì)胞；細(xì)胞凋亡； Bcl 2；caspase 3；caspase 9

黃芩在我國(guó)藥用歷史悠久，迄今已有2千多年的應(yīng)用歷史。黃芩苷(baicalin)是黃芩的干燥根中提取的有效成分之一，又稱黃芩黃素，其單體的化學(xué)名為6,7-三羥基黃酮。研究[1-3]表明：黃芩苷具有抑菌、清熱、利尿、降壓、利膽、鎮(zhèn)靜、抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)等活性，還可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，具有明顯的抗腫瘤活性，但具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和機(jī)制尚不清楚[4-7]。結(jié)腸癌是胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率和死亡率都有逐漸上升的趨勢(shì)。2014年世界衛(wèi)生組織分析表明：中國(guó)新增癌癥病例和死亡人數(shù)為世界首位,其中大腸癌位列第3位[8]。美國(guó)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果[9]顯示：惡性腫瘤中大腸癌的發(fā)病率及致死率均居第3位。因此，針對(duì)結(jié)腸癌進(jìn)行預(yù)防與治療的新藥物研發(fā)是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外的研究[10-11]提示：黃芩苷能夠抑制腸癌的增生和誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞的凋亡，但具體作用機(jī)制不明。本研究對(duì)黃芩苷誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡作用及可能的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器 人結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW480由深圳市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代保存。黃芩苷購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，CCK-8購(gòu)自日本Dojindo公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和DAPI購(gòu)自南京凱基生物公司， caspase 3和caspase 9抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。酶標(biāo)儀為美國(guó)BIO-TEK公司產(chǎn)品，型號(hào)ELx800；顯微鏡為日本奧林巴斯，型號(hào)IX71。

1.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和黃芩苷組，根據(jù)藥物濃度設(shè)25、50和100 μmol·L-13個(gè)濃度組， 觀察各組細(xì)胞的增殖、凋亡及相關(guān)凋亡蛋白的變化情況。

1.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性用胰蛋白酶消化狀態(tài)良好的SW480細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1，在96孔板中每孔加入50 μL細(xì)胞懸液，則每孔含5 000個(gè)細(xì)胞。將培養(yǎng)板置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，棄上清，加入終濃度為25、50和100 μmol·L-1黃芩苷細(xì)胞培養(yǎng)液，空白對(duì)照組用不含黃芩苷的細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng) 24、48和72 h，加入CCK-8溶液10 μL，混勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(A)值。以A值大小表示細(xì)胞增殖活性，A值越大細(xì)胞增殖活性越高;反之亦然。

1.4Annexin V-FITC染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞,按每孔16 000～28 000個(gè)細(xì)胞將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)12 h，設(shè)置空白對(duì)照組和50 μmol·L-1黃芩苷組，再培養(yǎng)48 h。將樣品用PBS洗滌2次,在500 μL的Binding Buffer中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，5 μL Propidium Iodide，混勻;將上述溶液滴于蓋玻片表面均勻覆蓋；室溫、避光5 min，于熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.5DAPI染色觀察細(xì)胞核特征形態(tài)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，按每孔16 000～28 000個(gè)細(xì)胞將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)12 h，設(shè)立空白對(duì)照組和50 μmol·L-1黃芩苷組，再培養(yǎng)48 h。用4%多聚甲醛固定10 min以上，蒸餾水洗滌2 次，加入200 μL DAPI染色液，室溫放置5 min，吸除DAPI染色液， PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.6Western blotting法檢測(cè)凋亡蛋白Bcl-2、caspase 3和caspase 9表達(dá)水平收集空白對(duì)照組和25、50、100 μmol·L-1黃芩苷組處理48 h的細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解SW480細(xì)胞，提取總蛋白，后用 10%分離膠 SDS-PAGE電泳。濕轉(zhuǎn)參數(shù)：恒流 110 mA，轉(zhuǎn)膜180 min；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,4℃孵育一抗封閉過夜，再室溫孵育二抗1 h。一抗分別為兔抗人β-actin(1∶2 000)，鼠抗人Bcl-2(1∶2 000)，兔抗人caspase 3(1∶2 000)，鼠抗人caspase 9(1∶2 000)。TBST洗滌，ECL 顯色，化學(xué)發(fā)光拍照，對(duì)圖像進(jìn)行灰度值數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)　果

2.1CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組 SW480增殖活性CCK-8法檢測(cè)結(jié)果：與對(duì)照組比較，50和100 μmol·L-1黃芩苷組SW480細(xì)胞增殖活性在24、48和72 h均明顯下降(P<0.01)。與對(duì)照組比較，25 μmol·L-1黃芩苷組SW480細(xì)胞增殖活性在48和72 h明顯下降(P<0.01)。見表1。

表1　CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組 SW480細(xì)胞增殖活性

*P<0.01 compared with blank control group.

2.2SW480細(xì)胞凋亡的特征性形態(tài)學(xué)表現(xiàn)①Annexin V-FITC染色：Annexin V通過與凋亡早期細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，故Annexin V被認(rèn)為是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的指標(biāo)，其在藍(lán)光熒光照射下呈綠色，易于鑒定?；?Propidium Iodide,PI)是一種核酸染料，其不易穿過完整的細(xì)胞膜，但對(duì)于凋亡中晚期的細(xì)胞或者死亡細(xì)胞，PI能夠透過受損的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。熒光顯微鏡觀察結(jié)果：50 μmol·L-1黃芩苷組的SW480細(xì)胞有凋亡的形態(tài)，雙色合成圖中只顯綠色的細(xì)胞屬于早期凋亡，既顯綠色又顯紅色的細(xì)胞則屬于晚期凋亡。見圖1(插頁(yè)三)。 ②DAPI染色：DAPI可穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合，凋亡晚期或死亡的細(xì)胞在顯微鏡下可以看到藍(lán)色熒光的細(xì)胞核。熒光顯微鏡觀察顯示：實(shí)驗(yàn)組(50 μmol·L-1黃芩苷)細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、細(xì)胞核裂解為碎塊。見圖2(插頁(yè)三)。

2.3SW480細(xì)胞中caspase 3和caspas 9蛋白表達(dá)水平Western blotting法檢測(cè)結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，25、50和100 μmol·L-1黃芩苷組caspase 3和caspase 9蛋白表達(dá)水平明顯升高 (P<0.05或P<0.01)，Bcl 2蛋白表達(dá)水平明顯降低 (P<0.05或P<0.01)。見圖3和表2。

Lane 1:Blank control group;Lane 2-4: 25,50,and 100 μmol·L-1baicalin groups.

圖3Western blotting法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2,caspase 3和caspase 9表達(dá)

Fig.3Expressions of apoptosis-related proteins Bcl-2,caspase 3 and caspase 9 detected by Western blotting method

表2　各組SW480細(xì)胞中Bcl-2、 caspase 3和caspase 9蛋白相對(duì)表達(dá)水平

*P<0.05,**P<0.01 compared with blank control group.

3　討　論

黃芩苷是從中藥黃芩干燥的根中提取的一種天然化合物,是黃芩的主要生物活性成分,對(duì)大腸癌和宮頸癌等腫瘤均有一定的治療作用[12-13]，但目前黃芩苷抗腫瘤的作用機(jī)制仍不十分清楚，黃芩苷使用的劑量范圍和適宜的給藥方法尚不明確，阻礙了其在臨床的應(yīng)用[14-15]。本研究結(jié)果顯示：黃芩苷對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖有抑制作用，其抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性，同時(shí)黃芩苷能誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示：黃芩苷組的細(xì)胞核部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，并有高度凝聚、邊緣化，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生破碎小體，細(xì)胞形態(tài)呈凋亡狀態(tài)，初步判斷黃芩苷具有誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡的作用。細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展受到精確調(diào)控，各種胞外凋亡信號(hào)通過特定的信號(hào)通路傳至胞內(nèi)，激活靶分子而引發(fā)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡分為caspase依賴型和caspase非依賴型。caspase依賴型通過線粒體途徑和死亡受體途徑2種方式啟動(dòng)凋亡；線粒體凋亡通路由含BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2家族構(gòu)成，包含Bid、Bad、Bim、Harikari和Noxa等，在接受到胞內(nèi)的死亡信號(hào)后該信號(hào)通路激活[16-17]。細(xì)胞色素C (Cyt C)的釋放是線粒體凋亡路徑的關(guān)鍵步驟,在ATP/dATP協(xié)助下，Cyt C與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1) 結(jié)合后形成多聚體，通過Apaf-1氨基端的caspase募集結(jié)構(gòu)域募集胞質(zhì)中的caspase 9前體，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的caspase 3，完成相應(yīng)底物的剪切，引起細(xì)胞凋亡[18]。目前，研究較多的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的分子包括Bcl-2、caspase 3和caspase 9等[19-21]。本研究結(jié)果表明：黃芩苷作用SW480細(xì)胞48 h，Bcl-2表達(dá)水平隨著藥物濃度的升高而下降，caspase 3和caspase 9蛋白表達(dá)則相反，提示黃芩苷誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡可能與線粒體途徑有關(guān)。

綜上所述，黃芩苷可以抑制SW480細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與線粒體途徑有關(guān)。

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Induction effect of baicalin on apoptosis of human colon cancer SW480 cells and its mechanism

LAI Mingguang1，QING Haitao2，WANG Lisheng3LIU Shenghuo1

(1.Laparoscope Center,Shenzhen Longgang Hospital of TCM,Guangdong Province,Shenzhen 518100,China;2. Department of Gastroenterology,Nanfang Hospital,Nanfang Medical University,Guangzhou 510515,China;3.Department of Gastroenterology,Jinan University of Medical Sciences,Shenzhen Municipal People’s Hospital,Shenzhen 518020,China)

Objective To investigate the influence of baicalin in human colon cancer SW480 cells,and to clarify its mechanism.Methods The SW480 cells were cultured and divided into blank control and 25,50 and 100 μmol·L-1baicalin groups.The proliferation activity was detected with CCK-8 assay.The morphological changes of SW480 cells were detected by Annexin Ⅴ-FITC and DAPI coloration.The protein expression levels of Bcl-2,caspase 3 and caspase 9 were detected by Western blotting method.Results The CCK-8 assay results showed that the proliferation activities of SW480 cells in 25,50 and 100 μmol·L-1baicalin groups were decreased significantly compared with blank control group at the time points of 24 h,48 h and 72 h (P<0.01),the proliferation activities of SW480 cells in 25 μmol·L-1baicalin groups were decreased significantly compared with blank control group at the time points of 48 and 72 h (P<0.01).Cell shrinkage and nucleus fragmentation were observed in the SW480 cells after treated with 50 μmol·L-1baicalin for 48 h.The Western blotting assay results showed that compared with blank control group,the protein expression levels of caspase 3 and caspase 9 in 25,50 and 100 μmol·L-1baicalin groups were increased significantly (P<0.05 orP<0.01),and the protein expression levels of Bcl 2 in 25,50 and 100 μmol·L-1baicalin groups were decreased significantly (P<0.05 orP<0.01).Conclusion Baicalin can induce the apoptosis in SW480 cells,and the effect might be involved with the mitochondrial apoptotic pathway．

baicalin;SW480 cells;apoptosis；Bcl-2；caspase 3；caspase 9

1671-587Ⅹ(2015)06-1158-05

10.13481/j.1671-587x.20150612

2015-05-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(81201662)

賴明廣(1980-)，男，廣東省深圳市人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事大腸癌的基礎(chǔ)與臨床方面的研究。

賴明廣，主治醫(yī)師(Tel: 0755-89911830，E-mail: lmg198002@163.com)

R363.2

A