尿激酶型纖溶酶原激活物生物傳感器的構(gòu)建及鑒定

崔鋼華， 饒　烽， 王　琰， 曹薇薇， 劉　偉，王維山，史晨輝

(1.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨一科，新疆 石河子832000；2.石河子大學 新疆地方民族與地方病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000)

尿激酶型纖溶酶原激活物生物傳感器的構(gòu)建及鑒定

崔鋼華1,2， 饒烽1,2， 王琰1,2， 曹薇薇2， 劉偉2，王維山1,2，史晨輝1,2

(1.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨一科，新疆 石河子832000；2.石河子大學 新疆地方民族與地方病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000)

目的：構(gòu)建含有增強型青色熒光蛋白-尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)作用底物(substrate)-黃色熒光蛋白變體(YPet)融合蛋白的真核表達載體(ECFP-uPA substrate-linker-YPet)，即uPA的生物傳感器。方法：以Src-biosensor為模板，Primer Premier 5.0軟件設計YPet引物，設計時5′端引入uPA底物序列及Linker，兩端連接酶切位點及保護堿基。以pMDTM-18T為中間載體，通過基因工程方法構(gòu)建含有ECFP-uPA substrate-linker-YPet的真核表達載體。然后轉(zhuǎn)染293T細胞，24 h后觀察轉(zhuǎn)染效率和融合蛋白表達情況，在熒光顯微鏡下，應用MetaFlour FRET 4.6軟件觀察并測量uPA生物傳感器熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。結(jié)果：經(jīng)過PCR和雙酶切鑒定，克隆片段和酶切片段均與uPA substrate分子大小相符。細胞轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染效率達40%。免疫熒光檢測，uPA生物傳感器在293T細胞膜表達，用重組人uPA(rhuPA)刺激轉(zhuǎn)染細胞可以檢測到FRET現(xiàn)象。結(jié)論：成功構(gòu)建uPA生物傳感器,該生物傳感器能夠作為活細胞分子探針用于研究uPA的時空變化。

尿激酶型纖溶酶原激活物；生物傳感器；熒光共振能量轉(zhuǎn)移；骨性關(guān)節(jié)炎

尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,uPA)是絲氨酸蛋白水解酶家族的主要成員，uPA家族包括尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)、尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(urokinase-type plasminogen activator receptors,uPAR)和纖溶酶原激活劑抑制劑(plasminogen activator inhibitor，PAIs)[1]。uPA可以在生理和病理條件下與uPAR結(jié)合，從而影響組織修復和細胞遷移、介導細胞外基質(zhì)蛋白的水解、裂解膠原蛋白酶及激活其他蛋白水解酶，同時還可以直接降解細胞外基質(zhì)及基底膜[2]。uPA也被證明與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有高度關(guān)聯(lián)[3]。最近一項研究[4]結(jié)果表明:uPA在基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)介導的骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)軟組織降解過程中起著關(guān)鍵作用,但uPA在OA病變的各類信號傳導通路中起何種作用仍未見相關(guān)研究報道。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)是指2個熒光發(fā)色基團足夠靠近時，能量從一種受激發(fā)的熒光基團以非輻射的方式轉(zhuǎn)移到另一個熒光基團的物理現(xiàn)象[5]。FRET技術(shù)可以實現(xiàn)在體、原位條件下，對蛋白質(zhì)之間相互作用進行實時動態(tài)檢測，真實反映生理條件下細胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間的相互聯(lián)系。因此FRET技術(shù)已經(jīng)成為亞細胞領(lǐng)域敏感、快速、有效地追蹤細胞內(nèi)信號分子(蛋白)等相互作用的有效方法[6]。FRET技術(shù)用于分子探針即作為生物傳感器(biosensor)已被用于監(jiān)測有機化合物的濃度[7]、鳥苷三磷酸酶的活化[8]、蛋白質(zhì)磷酸化[9]和細胞內(nèi)機械應力的研究[10]等多個領(lǐng)域。本研究通過基因工程的相關(guān)方法和FRET技術(shù)構(gòu)建uPA biosensor，這將有助于研究uPA在OA病變的信號傳導通路中的作用，為實現(xiàn)OA基因的靶點治療提供可靠的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌株、細胞和主要試劑Src biosensor由美國霍普金斯大學曹旭教授惠贈，pMDTM-18T購自寶生物工程有限公司，人胚腎293T細胞、大腸桿菌DH5α為本實驗室保存。T4DNA連接酶、DNA聚合酶購自美國Thermo公司，核酸相對分子質(zhì)量Marker、相關(guān)限制性內(nèi)切酶等購自日本Takara公司，細胞轉(zhuǎn)染試劑Liopfectamine 2000購自美國Invitrogen公司，所用質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司，細胞培養(yǎng)試劑(DMEM、胎牛血清)購自美國Gibco公司，抗綠色熒光蛋白抗體(一抗)和TRITC標記的山羊抗鼠IgG(二抗)購置中杉金橋公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2熒光成像系統(tǒng)Zeiss Axiovert 200M 倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)，配備有CFP(BP436/25、FT455、BP480/40)、YFP(BP500/25、FT515、BP535/30)和CFP-YFP-FRET(BP436/25、FT455、BP535/30)3個濾光片,安裝有MetaFlour軟件。

1.3PCR引物根據(jù)Src-biosensor 中YPet的DNA序列，應用Primer Premier 5.0軟件設計引物。在上游引物5′端引入合適的酶切位點和保護堿基備用，并添加uPA作用底物堿基序列,P1:ACATGCATGCATAGCGGCAGGAGCGCCAAC-GCCGGCGGCAGCGGCGGCACCATGTCTAAA-

GGTGAAGAATTATTC；P2:GGAATTCTTA-

CTATTTGTACAATTCATTC[單下劃線分別表示SphⅠ和EcoRⅠ酶切位點,雙下劃線表示uPA作用底物的堿基序列，波浪線表示Linker(一段無意義的DNA序列)]，委托上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.4YPet基因的合成PCR反應采用25 μL體系，包含PCR Master Mix(2×) 12.5 μL,20 μmol·L-1引物P1和P2各0.5 μL，5 mmol·L-1的Taq酶0.5 μL，模板DNA 2 μL和ddH2O 9 μL。反應條件：94℃、5 min，94℃、0.5 min,55℃、0.5 min,72℃、0.5 min,72℃、10 min,34個循環(huán)。

1.5產(chǎn)物的克隆、鑒定與載體的構(gòu)建將Src biosensor(含有pcDNA 3.1)和通用載體pMDTM-18T進行Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切處理，將酶切產(chǎn)物ECFP-Linker-Substrate(Src作用底物)-YPet片段插入pMDTM-18T相應的位點，獲得中間重組子Src-pMDTM-18T，再用SphⅠ和EcoRⅠ雙酶切中間重組子Src-pMDTM-18T和PCR產(chǎn)物，并將YPet的PCR產(chǎn)物插入相應酶切位點，獲得另一個中間重組子uPA-pMDTM-18T，最后通過Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切處理uPA-pMDTM-18T，將ECFP-substrate(uPA作用底物)-Linker-YPet片段插入pcDNA 3.1載體中，獲得uPA biosensor真核表達質(zhì)粒。uPA biosensor重建質(zhì)粒流程圖見圖1。

圖1　uPA biosensor重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖

Fig.1Flow chart of construction of uPA biosensor

1.6細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染采用10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T細胞。轉(zhuǎn)染前1 d，細胞用0.05%胰蛋白酶消化，鋪入Petri皿中，每皿密度為2×104個細胞。待細胞生長融合至60%～70%時，根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明，uPA載體質(zhì)粒和Lipofectamine 2000按比例4 μg∶7 μL進行轉(zhuǎn)染，24 h后用Zeiss Axiovert 200M 倒置熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達情況。

1.7免疫組織化學將上述轉(zhuǎn)染細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，PBS(溫浴)洗2次，每次1 min，加入1 mL 4%多聚甲醛(冰浴)，4℃放置30 min，然后用冰浴的PBS洗3次，加入山羊血清封閉室溫放置30 min，加一抗(1∶50)后37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中放置2 h，洗一抗，再上二抗(1∶100)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中放置2 h后避光，PBS洗3次后熒光顯微鏡下觀察。

1.8熒光成像及TRET檢測①校正因子計算：Zeiss Axiovert 200M 倒置熒光顯微鏡，采用100倍油鏡。分別選取CFP (BP436/25,FT455,BP480/40)、YPet (BP500/25,FT515,BP535/30)和CFP-YPet-FRET (BP436/25,FT455,BP535/30)3個濾光片分別作為供體、受體和FRET3個通道的濾光片。分別采用單獨轉(zhuǎn)染并表達pCFP和pYPet的細胞來檢測并計算供體的校正因子A和B，MetaFlour FRET軟件計算供體及受體串色常數(shù)，得到校正后的FRET。②FRET檢測：將濾光片轉(zhuǎn)到CFP通道，鏡下確定視野，選定待測細胞，將濾光片轉(zhuǎn)到FRET通道，拍照獲取單張細胞圖片，對待測細胞圈定幾個感興趣的區(qū)域，同時選定1個無細胞的背景區(qū)域，用以扣除背景信號，連續(xù)采集CFP、YPet和FRET 3個通道的圖片；將前面計算出的供體校正因子A和受體校正因子B輸入MetaFlour FRET 4.6軟件自帶公式，運用校正的方法計算出校正FRET，顯示FRET效率。

2　結(jié)　果

2.1PCR基因的克隆以引物P1和P2利用高保真PCR技術(shù)擴增含酶切位點和保護堿基的YPet產(chǎn)物，產(chǎn)物基因全長780 bp。見圖2。

M1:DNA marker Ⅱ 1 200 bp;M2:DNA marker Ⅲ 4 500 bp;Lane 1:PCR product.

圖2YPet的PCR產(chǎn)物

Fig.2PCR product of YPet

2.2uPA biosensor的構(gòu)建及鑒定以Src-biosensor為起點，通過中間載體pMDTM-18T，依次獲得Src-pMDTM-18T和uPA-pMDTM-18T2個中間重組子，最后獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ECFP-substrate-linker-YPet(uPA biosensor),主要部分結(jié)構(gòu)示意圖見圖3。PCR鑒定(PCR 產(chǎn)物substrate-linker-YPet約為780 bp)和雙酶切鑒定(pMDTM-18T-ECFP載體約為3 892 bp,substrate-linker-YFP約為780 bp)電泳見圖4和圖5，送上海生工生物技術(shù)公司測序驗證。

CMV:CMV promoter; ECFP:Enhanced cyan fluorescent protein; Linker:A nonsense DNA sequence; YPet:Yellow fluorescent protein variant.

圖3uPA biosensor主要部分結(jié)構(gòu)示意圖

Fig.3Domain structure of uPA biosensor

Lane 1:uPA biosensor vector PCR product；M：DNA marker Ⅲ 4 500 bp.

圖4uPA biosensor載體PCR鑒定圖

Fig.4Identification of conducted uPA biosensor vector by PCR

M:DNA marker Ⅲ 4 500 bp;Lane 1:uPA-pMDTM-18T digested bySphⅠandEcoRⅠ.

圖5uPA-pMDTM-18T 中間重組子雙酶切鑒定

Fig.5Identification of conducted uPA-pMDTM-18T by double restriction enzyme

2.3293T細胞中uPA biosensor的表達和FRET值檢測在488 nm激光轉(zhuǎn)染 uPA biosensor的293T細胞，采用515 nm的GFP通道觀察：細胞可以發(fā)出較強的綠色熒光，整體轉(zhuǎn)染效率達到40%(圖6，見插頁二)。免疫熒光證實293T細胞膜表達uPA biosensor(圖7，見插頁二)。另外除了能在ECFP通道和YPet通道看到均勻分布的青色和黃色熒光外，還可以在FRET通道看到明顯的黃色熒光即FRET現(xiàn)象(圖8，見插頁二)。

2.4重組人uPA(rhuPA)誘導uPA biosensor融合蛋白的動力學研究將uPA biosensor質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細胞，表達24 h后，觀察uPA誘導處理前后uPA biosensor融合蛋白FRET現(xiàn)象的變化情況。細胞分為對照組(n=5)和實驗組(n=5),對照組加入PBS液，實驗組加入rhuPA(0.1 ng·L-1)。對照組在實驗記錄內(nèi)，YPet和ECFP的熒光強度無任何變化；實驗組在rhuPA處理前20 min,ECFP和YPet的熒光強度無變化，在添加rhuPA處理后，出現(xiàn)了ECFP熒光強度明顯增強而YPet的熒光強度明顯減弱的現(xiàn)象，YPet/ECFP的強度也明顯減弱，變化持續(xù)時間40 min,之后YPet/ECFP的強度逐漸趨于穩(wěn)定。見圖9(插頁二)和圖10。基于ECFP和YPet熒光強度隨時間變化的比率，證實uPA biosensor被rhuPA激活并發(fā)生了空間構(gòu)象的變化。

圖10Excel分析轉(zhuǎn)染uPA biosensor的293T細胞在rhuPA刺激下的FRET

Fig.10 FRET in 293T cells transfected with uPA biosensor after incubation with rhuPA with Excel analysis

3　討　論

本研究構(gòu)建uPA bisonsor時，選擇了2種質(zhì)粒，即Src biosensor和中間載體pMDTM-18T，且兩者均有合適的酶切位點，便于用基因工程的方法構(gòu)建uPA biosensor。在uPA作用底物兩端分別添加供體和受體熒光蛋白，即ECFP和YPet，兩者與CFP和YFP相比不僅熒光強度有所增加而且有更好的光譜重疊，極大地提高了FRET效率，根據(jù)uPA被激活后作用于其底物(substrate)，使ECFP和YPet空間構(gòu)象變化改變了供、受體熒光蛋白的方向和距離，產(chǎn)生FRET現(xiàn)象。通過檢測FRET變化數(shù)據(jù)可以跟蹤觀察uPA被激活的時間和空間信息。

本研究將uPA biosensor轉(zhuǎn)染入293T細胞中，轉(zhuǎn)染效率達40%，并在FRET通道觀察到了FRET現(xiàn)象，說明uPA biosensor融合蛋白在活細胞中得到表達，能夠產(chǎn)生FRET現(xiàn)象，即在活細胞中證明了uPA biosensor構(gòu)建成功，并且采用免疫組織化學方法證明了uPA biosensor的膜表達。本研究嘗試采用rhuPA與293T細胞共孵育，rhuPA處理前20 min，可以看到ECFP和YPet熒光強度無變化，在添加rhuPA處理后，出現(xiàn)了ECFP熒光強度明顯增強而YPet熒光強度明顯減弱的現(xiàn)象，YPet/ECFP的強度也明顯減弱，且rhuPA處理20 min后變化最明顯,之后YPet/ECFP的強度逐漸趨于穩(wěn)定，上述結(jié)果進一步驗證了uPA可以作用于uPA biosensor產(chǎn)生FRET現(xiàn)象。

近年來大量研究證實了各種因素導致關(guān)節(jié)軟骨降解與合成之間的代謝失衡是OA軟骨退變的主要原因，uPA和MMPs是最為重要的降解酶[11-12]。uPA不僅可以影響軟骨代謝的過程，還可以直接降解軟骨細胞外基質(zhì)，更為重要的是uPA激活MMPs酶原，與活化的MMPs共同促進軟骨組織的降解[13-14],而且本課題組的前期研究[15-16]結(jié)果表明：OA滑膜襯里層細胞可見大量uPA/uPA RNA表達現(xiàn)象，在OA患者血清及關(guān)節(jié)液中uPA和MMP-3的表達水平均明顯升高，與關(guān)節(jié)退變程度一致。應用MMPs抑制劑——強力霉素進行干預后，兔OA模型中軟骨退變的進程明顯降低，而且可逆轉(zhuǎn)早期軟骨退變[17]。本課題組成功構(gòu)建了高效靶向uPA-siRNA慢病毒載體，已經(jīng)證實其可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染軟骨細胞并高效抑制uPA基因表達并促進軟骨細胞增殖[18]。上述研究結(jié)果證實了uPA在軟骨退變中發(fā)揮著始動因子的作用。另外學者[19-21]發(fā)現(xiàn)：Wnt/β-catenin信號通路在OA的發(fā)生發(fā)展中起著極其重要的作用，但uPA與該信號途徑的關(guān)系未見文獻報道。本課題組在后續(xù)實驗中，將uPA biosensor轉(zhuǎn)染到關(guān)節(jié)軟骨細胞，用于探討uPA與Wnt/β-catenin信號通路以及MMPs的調(diào)控關(guān)系，這將有助于更深入地了解OA的病因和發(fā)病機制，為OA基因的靶點治療提供可靠的理論依據(jù)。

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Construction and identification of urokinase-type plasminogen activator biosensor plasmid

CUI Ganghua1,2,RAO Feng1,2,WANG Yan1,2,CAO Weiwei2,LIU Wei2,WANG Weishan1,2,SHI Chenhui1,2

(1.Department of Orthopedics,First Affiliated Hospital,School of Medical Sciences,Shihezi University,Shihezi 832000,China; 2.Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases,Ministry of Education,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

ObjectiveTo construct the eukaryotic expression vector urokinase-type plasminogen activator (uPA) biosensor which was the composition of the fusion protein enhanced cyan fluorescent protein -uPA (substrate)-yellow fluorescent protein variant (ECFP-uPA substrate-linker-YPet).Methods By the template Src-biosensor,the YPet primers were designed by Primer Premier 5.0 software,and the restriction enzyme sites,uPA substrate gene sequence and linker were added in its 5′ end.With the intermediate vector pDMTM-18T,an eukaryotic expression vector which contained a fusion protein of ECFP-uPA substrate-linker-YPet was constructed by genetic engineering.Then the uPA biosensor was transfected into 293T cells.The transfection efficiency and expression of fusion proteins were observed after 24 h.Fluorescence resonance energy transfer (FRET) was observed by the inversion fluorescence microscope and measured by the MetaFlour FRET 4.6 software.ResultsThe uPA biosensor vector was confirmed by the fragment of PCR and double restriction enzyme digestion.The transfection efficiency was nearly 40%.The immunofluorescence detection results displayed that uPA biosensor fusion protein expressed in the 293T cells membrane and the FRET of uPA biosensor in the living 293T cells was observed after incubation with the recombinant human uPA(rhuPA).ConclusionuPA biosensor is successfully constructed and it could be used as a molecular probe to study the temporal and spatial variation of uPA in living cells.

urokinase-type plasminogen activator; biosensor; fluorescence resonance energy transfer; osteoarthritis

1671-587Ⅹ(2015)06-1124-06

10.13481/j.1671-587x.20150605

2015-02-02

國家自然科學基金資助課題(81160225,81260453,81360451)；新疆兵團醫(yī)藥衛(wèi)生專項基金資助課題(2013BA020);新疆兵團國際交流與合作專項基金資助課題(2012BC002，2011BC004)；新疆兵團科技創(chuàng)新團隊專項基金資助課題(2014CC002)

崔鋼華(1988-)，男，河南省漯河市人，在讀醫(yī)學碩士，主要從事關(guān)節(jié)外科學方面的研究。

王維山，副教授，副主任醫(yī)師，碩士研究生導師 (Tel：0993-2859427，E-mail:wwsmc2002@sina.com)；

史晨輝,教授,碩士研究生導師(Tel：0993-2859427，E-mail:sch7890@yahoo.com)

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