TTF1-NP誘導(dǎo)人肝癌 HepG-2細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用

肖　斌，劉榮榮，劉炳彤，張學(xué)武

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 延吉133000)

TTF1-NP誘導(dǎo)人肝癌 HepG-2細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用

肖斌，劉榮榮，劉炳彤，張學(xué)武

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 延吉133000)

目的：通過不同劑量長白山珍珠梅黃酮納米粒(TTF1-NP)分別誘導(dǎo)不同種人肝癌細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞凋亡，探討TTF1-NP對不同細(xì)胞的作用及涉及的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用機制。方法：以體外培養(yǎng)的不同種人肝癌細(xì)胞(Hep3B、HepG-2和PLC/PRF/5)和人肝細(xì)胞(Chang Liver)為模型，實驗分為陰性對照組、陽性對照組(5-Fu)和TTF1-NP實驗組，TTF1-NP處理濃度分別為50、100和200 μmol·L-1。采用MTT法檢測TTF1-NP對不同種細(xì)胞的生長抑制作用，選擇最佳抑制效果細(xì)胞(HepG-2)為主要研究細(xì)胞株；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用Western blotting和免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵蛋白表達情況；通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯丁酸(4-PBA)作用，再次檢測相關(guān)蛋白的表達情況。 結(jié)果:與陰性對照組比較，不同濃度的TTF1-NP組4種細(xì)胞生長抑制率升高(P<0.05或P<0.01)，且呈一定的濃度和時間依賴關(guān)系。細(xì)胞凋亡檢測，與陰性對照組比較，TTF1-NP實驗組隨藥物濃度增加其細(xì)胞凋亡率逐漸上升(P<0.05或P<0.01)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵蛋白GRP78和caspase-4 隨著TTF1-NP濃度增加，表達水平逐漸升高(P<0.05或P<0.01)。4-PBA有效抑制GRP78和caspase-4表達，與TTF1-NP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。 結(jié)論： TTF1-NP可誘導(dǎo)人肝癌 HepG-2 細(xì)胞凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑是 TTF1-NP 誘導(dǎo)人肝癌 HepG-2 細(xì)胞凋亡的主要作用機制之一。

珍珠梅黃酮納米粒；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；肝腫瘤

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)反應(yīng)是真核生物體內(nèi)一個復(fù)雜的、多功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與生物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡、自噬和氧化應(yīng)激等多種生物現(xiàn)象[1-2]。研究[3-4]表明：ERS 參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。ERS 通過活化未折疊蛋白反應(yīng)、介導(dǎo)自噬、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激等發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤生長的作用，ERS 與肝癌的發(fā)生、發(fā)展也密切相關(guān)。長白山珍珠梅(Sorbaria Sorbifolia) 屬薔薇科植物，被《抗癌中藥大辭典》收錄為長白山抗癌藥。本課題組前期研究[5-6]發(fā)現(xiàn)：珍珠梅發(fā)揮抗癌作用的主要成分為5，2′，4′- 三羥基- 6，7，5′- 三甲氧基黃酮(TTF1)，TTF1可以抑制小鼠S180肉瘤及人肝癌HepG-2細(xì)胞生長，其主要作用機制與抑制腫瘤血管生成及活化線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。珍珠梅黃酮納米粒(TTF1-NP)是以生物體內(nèi)可降解材料硬脂酸為載體，采用乳化-低溫固化法制備生物體，可降解吸收的直徑為150～200 nm的新劑型。本實驗探討TTF1-NP誘導(dǎo)人肝癌HepG-2 細(xì)胞凋亡過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用機制，為在天然植物中篩選新的抗肝癌藥物提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器人肝癌細(xì)胞(HepG-2、Hep3B和PLC/PRF/5)和人正常肝細(xì)胞(Chang Liver)為本教研室凍存。TTF1由延邊大學(xué)藥學(xué)院關(guān)麗萍老師惠贈，小牛血清和DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品，Annexin V-FITC凋亡試劑盒為美國BD公司產(chǎn)品，caspase-4、GRP78和β-actin抗體為英國Abcom公司產(chǎn)品，蛋白檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。DYY-7C電泳儀為北京市六一儀器廠產(chǎn)品，BioSpectrum 300凝膠成像系統(tǒng)為美國UVP公司產(chǎn)品，RT-6000雷杜酶標(biāo)儀為深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品。

1.2TTF1-NP的制備依據(jù)參考文獻[7]，分別稱取處方量的Poloxamer 188、TTF1、脂酸和卵磷脂置于100 mL具塞錐形瓶中，加入適量的雙蒸水，于(74 ±3)℃ 水浴下，磁力攪拌溶解，分別構(gòu)成水相及有機相。用注射器將有機相緩慢注入攪拌(1 000 r·min-1) 的水相中，得到半透明納米乳劑。將納米乳劑迅速加入至一定體積的攪拌的水相中( 0～2 )℃，繼續(xù)攪拌1 h，即得到TTF1- SLN混懸液。然后進行TTF1-SLN表征確定、包封率及體外釋放度的測定。

1.3細(xì)胞及培養(yǎng)HepG-2、Hep3B、PLC/PRF/5和Chang Liver分別用含有10%小牛血清和1×105U·L-1DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中全濕常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于下一步實驗。

1.4MTT法檢測TTF1-NP對多種細(xì)胞的生長抑制作用取對數(shù)生長期的HepG-2、Hep3B、PLC/PRF/5和Chang Liver細(xì)胞，接種于96孔板中(6×103/孔)。培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，分為50、100和200 μmol·L-1TTF1-NP實驗組，陰性對照組(DMEM常規(guī)培養(yǎng))及陽性對照組(5-Fu 10 μmol·L-1)。分別培養(yǎng)24、48和72 h，加入5 g·L-1MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h，加入180 μL二甲基亞砜(DMSO)，測定570 nm處各孔內(nèi)吸光度(A)值。細(xì)胞生長抑制率=(1-樣本平均A值/陰性對照組平均A值)×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡按1.3實驗分組后，將各組細(xì)胞收集到15 mL離心管內(nèi)，1 000 r·min-1離心5 min，冰PBS制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)(保證每個樣本數(shù)大約1×106個細(xì)胞)。1 000 r·min-1離心5 min，棄去離心管內(nèi)液體，用200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，避光孵育室溫20 min，加入 Annexin V 10 μL，避光室溫靜止10 min。1 000 r·min-1離心5 min，棄去液體，重新加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，每個樣本加入5 μL PI，避光孵育。上機檢測。采用FACSDiva 4.1 軟件對結(jié)果進行分析，結(jié)果以凋亡細(xì)胞百分率表示。

1.6Western blotting法檢測樣品GRP78和caspase-4蛋白表達提取1.4各實驗組全蛋白。陰性對照組和100 μmol·L-1TTF1-NP實驗組分別加入ERS 抑制劑4-PBA作用48 h后，提取陰性對照組、陰性對照加4-PBA組、100 μmol·L-1TTF1-NP實驗組和100 μmol·L-1TTF1-NP實驗組加4-PBA組的全蛋白。按照考馬斯亮藍(lán)蛋白檢測試劑盒說明書操作，計算各蛋白樣品濃度。制備相關(guān)分子質(zhì)量的凝膠，加樣，電泳(80 V, 60 ～90 min)，轉(zhuǎn)膜(100 V，30～60 min)。取出膜浸泡在5% 脫脂奶粉中，室溫封閉2 h。加入抗體caspase-4 (1∶1 000) 和 GRP78 (1∶1 000) 4℃，過夜，PBS 清洗細(xì)胞，滴加二抗 (1∶5 000)，室溫2 h，PBS 清洗細(xì)胞。曝光，拍照。 應(yīng)用Image J軟件對所得條帶進行灰度分析。

1.7免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測樣品GRP78和caspase-4表達將各實驗組細(xì)胞清洗后，4% 多聚甲醛固定20 min，山羊血清室溫封閉30 min。濕盒內(nèi)孵育一抗 caspase-4(1∶100)、GRP78 (1∶100) 4℃ 孵育過夜，PBS 清洗后加二抗(1∶1 000)37℃ 孵育2 h。適量 A 液與 B液等體積混合，細(xì)胞爬片內(nèi)加入約100 μL 混合液，避光孵育 20 min。PBS 清洗細(xì)胞，二甲苯內(nèi)浸泡 15 min，晾干，中性樹膠封片。

2　結(jié)　果

2.1TTF1-NP 制備長白山珍珠梅在乙酸乙酯回流多次提取、減壓濃縮、反復(fù)分離及氯仿-甲醇的梯度洗脫作用下，得到TTF1單體化合物。見圖 1。以硬脂酸為載體，采用乳化-低溫固化法最終制成平均粒徑為(195.2±35.2)nm和平均包封率為64.57%的TTF1-NP。

2.2MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率不同濃度的TTF1-NP處理不同時間后，4種細(xì)胞生長均受到不同程度的抑制，且呈一定的濃度和時間依賴關(guān)系。人肝癌HepG-2細(xì)胞在相同作用時間內(nèi)抑制率最高，達到72.6%，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；人正常肝細(xì)胞Chang Liver 細(xì)胞抑制較弱，與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。以下實驗選取人肝癌 HepG-2細(xì)胞為實驗對象。

圖15，2′，4′-三羥基-6，7，5′-三甲氧基黃酮單體化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Fig.1Chemical structure of TTF1

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率陰性對照組細(xì)胞存活率為91.3%，凋亡率僅為4.9%。TTF1-NP實驗組和5-Fu組細(xì)胞的存活率逐漸下降、凋亡率逐漸上升。50、100和200 μmol·L-1TTF1-NP實驗組和陽性對照組凋亡率依次為：50.0%、86.2%、89.6%和90.1%，與陰性對照組(4.9%)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2A和B。

2.4免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測ERS關(guān)鍵蛋白表達 經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測，ERS起始反應(yīng)信號蛋白GRP78及ERS特異性促凋亡蛋白caspase-4陰性對照組細(xì)胞呈多角形，結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)棕色淡染，50 μmol·L-1TTF1-NP組細(xì)胞形態(tài)略有改變，100 μmol·L-1TTF1-NP組細(xì)胞變圓；200 μmol·L-1TTF1-NP組細(xì)胞數(shù)減少明顯，且核邊移，深染，固縮，細(xì)胞變小，胞質(zhì)棕色深染。見圖 3(插頁二)。

2.5TTF1-NP 對 ERS 關(guān)鍵因子表達陰性對照組ERS反應(yīng)起始蛋白GRP78和凋亡蛋白caspase-4均有表達，但表達量較低，隨著TTF1-NP劑量增加，GRP78和caspase-4表達水平顯著升高，與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4A和B。

2.6TTF1-NP 與 ERS 抑制劑對ERS關(guān)鍵因子表達陰性對照組GRP78、caspase-4蛋白與加入4-PBA后蛋白表達無明顯變化，TTF1-NP 實驗組GRP78、caspase-4 蛋白表達量增加，加入4-PBA后表達量明顯下降(P<0.05)，定性分析結(jié)果見圖5A，定量分析結(jié)果見圖5B。

表1TTF1-NP作用下人肝癌HepG-2、Hep3B、PLC/PRF/5和Chang Liver細(xì)胞的生長抑制率

*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group.

3　討　論

通過不同濃度(50、100和200 μmol·L-1)TTF1-NP分別處理人肝癌HepG-2、Hep3B、PLC/PRF/5和人正常肝Chang Liver細(xì)胞24、48和72 h結(jié)果顯示：TTF1-NP對4種細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，有時間和濃度依賴性，對正常肝細(xì)胞Chang Liver抑制作用弱，對3種人肝癌細(xì)胞抑制作用均較強。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：TTF1-NP可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且有一定的劑量依賴性，說明研究TTF1-NP抗腫瘤作用有一定的科學(xué)意義。

當(dāng)ERS發(fā)生時，GRP78首先感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的壓力，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的三大跨膜感受器蛋白PERK、ATF6和IRE-1解離、活化并大量表達[8-11]。caspase-12是ERS反應(yīng)的特異性凋亡蛋白，只在ERS反應(yīng)中被活化，當(dāng)ERS強度過強或持續(xù)時間過長時，可以引起IRE1活化并募集內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的TRAF2，剪切無活性的caspase-12前體，生成活性caspase-12片斷，激活下游相關(guān)caspase家族成員，啟動caspase 家族級聯(lián)反應(yīng)，促進凋亡。人體中caspase-12基因以其同源因子caspase-4形式表達，功能與鼠科類動物體內(nèi)的caspase-12相同。Wang等[12]和Afrin等[13]研究發(fā)現(xiàn)：caspase-12/4可以作為ERS關(guān)鍵凋亡因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Western blotting 和免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示:TTF1-NP導(dǎo)致人肝癌HepG-2細(xì)胞GRP78、caspase-4蛋白表達水平逐漸升高，表明ERS參與了 TTF1-NP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程。

A:Annexin-Ⅴ FITC/PI double-staining method;B:Apoptotic rate.

圖2Annexin-Ⅴ FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

Fig.2Apoptosis detected by Annexin-Ⅴ FITC/PI double-staining method

A:Western blotting method;Lane 1:Vehiche group;Lane 2-4:50,100 and 200 μmol·L-1TTF1-NP groups;Lane 4:5-Fu group.B:Expression levels of GRP78 and caspase-4 proteins.

圖4Western blotting法檢測ERS關(guān)鍵蛋白表達

Fig.4Expressions of ERS key proteins detected by Western blotting method

A:Western blotting method;Lane 1:Vehiche group;Lane 2-4:50,100 and 200 μmol·L-1TTF1-NP groups;Lane 4:5-Fu group.B:Expression levels of GRP78 and Caspase 4 proteins.

圖5Western blotting法檢測4-PBA作用后ERS關(guān)鍵蛋白表達

Fig.5Expressions of ERS key proteins after treated with 4-PBA detected by Western blotting method

加入ERS抑制劑4-PBA后，4-PBA可以抑制TTF1-NP誘導(dǎo)活化的GRP78和caspase-4蛋白的表達，進一步證實了TTF1-NP可以通過活化ERS誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡。

本實驗通過檢測TTF1-NP誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡及ERS關(guān)鍵蛋白表達變化表明:TTF1-NP可以抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞生長，ERS的活化是其作用機制之一。本課題組將針對TTF1-NP抗腫瘤作用機制進行深入研究。

[致謝：本文得到延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院鄭益星教授的大力幫助，在此致以謝意！]

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Induction effect of TTF1-NP on human hepatoma cell apoptosis through ERS-mediated pathway

XIAO Bin,LIU Rongrong,LIU Bingtong,ZHANG Xuewu

(Department of Biochemistry and Molecular Biology,College of Medical Sciences,Yanbian University,Yanji 133000,China)

Objective To explore the effects of different doses of 5,2′,4′-trihydroxy-6,7,5′-trimethoxyflavone nanoparticles (TTF1-NP) on the apoptosis of human hepatoma cells and human normal hepatocytes, and to explore their mechanisms through endoplasmic reticulum stress (ERS)-meditated apoptosis pathway. MethodsThe human hepatoma cell lines (HepG2,Hep3B and PLC/PRF/5) and human hepatocytes (Chang Liver) were used as cell model,and divided into vehicle,5-Fu and TTF1-NP treated groups with the concentrations of 50,100 and 200 μmol·L-1respectively. The inhibitory effects of TTF1-NP on the cell growth were assessed using MTT assay and the best inhibitory one (HepG-2) was selected as the main research cell lines.Flow cytometry was used to detect the TTF1-NP-induced apoptosis; Western blotting and immunocytochemistry were used to determine the expressions of ERS key proteins.Finally,the expressions of key proteins were detected by Western blotting after using the ERS inhibitor 4-PBA.ResultsCompared with vehicle group,the inhibitory rates of growth of 4 kinds of human hepatoma cells in different concentrations of TTF1-NP groups were increased(P<0.05 orP<0.01); moreover,the inhibitory effects of TTF1-NP were in a time- and dose-dependent manner.Compared with vehicle group,the apoptotic rates of the cells in TTF1-NP groups were increased in a dose-dependent manner(P<0.05 orP<0.01); the expression levels of ERS key proteins GRP78 and caspase-4 were increased with the increasing of the concentration of TTF1-NP(P<0.05 orP<0.01).The expression levels of ERS key proteins GRP78 and caspase-4 induced by TTF1-NP were inhibited by ERS inhibitor 4-PBA(P<0.05 orP<0.01).ConclusionTTF1-NP can induce the apoptosis of HepG2 cells; ERS pathway plays a central role in TTF1-NP-induced apoptosis of HepG-2 cells.

5,2′,4′-trihydroxy-6,7,5′-trimethoxyflavone nanoparticles; endoplasmic reticulum stress; apoptosis;liver neoplasms

1671-587Ⅹ(2015)06-1118-06

10.13481/j.1671-587x.20150604

2015-04-14

國家自然科學(xué)基金資助課題(81260655)；吉林省科技廳科技發(fā)展計劃項目資助課題(201215242)

肖斌(1988-)，女，吉林省大安市人，在讀醫(yī)學(xué)博士，主要從事分子腫瘤學(xué)方面的研究。

張學(xué)武，教授，博士研究生導(dǎo)師(Tel：0433-2435102，E-mail：zhangxuewu@ybu.edu.cn)

R735.7

A