實(shí)時熒光定量PCR 檢測CD44v2在膀胱及尿路上皮癌中的表達(dá)＊

劉小榮，王永翔，趙立明，趙小東，劉學(xué)軍，任玉林，李少君

（甘肅省第二人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.泌尿外科，甘肅蘭州730050）

CD44最初被確認(rèn)為一種淋巴細(xì)胞歸巢受體和跨膜糖蛋白，一般表達(dá)在胚胎干細(xì)胞［1］。在淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和增生的上皮細(xì)胞中都可檢測到，也可見于腫瘤細(xì)胞表面。CD44及其變異體在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用，與乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、膽管癌、前列腺癌等多種腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系［2－4］。本文應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)檢測CD44變異體（CD44v）2蛋白在膀胱及尿路上皮細(xì)胞癌中的表達(dá)，旨在探討CD44v2與膀胱及尿路上皮細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)之間的關(guān)系，以及明確其臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院泌尿外科2010年1月至2014年1月膀胱部分切除或全切除手術(shù)患者70例。所有患者手術(shù)切除標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為膀胱及尿路上皮癌，其中男56例、女14例，年齡29～83歲，平均56 歲。根據(jù)國際抗癌協(xié)會（UTCC）制定的TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，對上述人群進(jìn)行膀胱移行細(xì)胞癌臨床分期如下：Tis～Ta期13例，T1期24例，T2期20例，T3期9例，T4期4例；病理Ⅰ級25例，Ⅱ級23例，Ⅲ級22例；初發(fā)組49例，復(fù)發(fā)組21例；單發(fā)組49例，多發(fā)組21例。另外，采集正常膀胱黏膜組織標(biāo)本20例，來自行經(jīng)恥骨上前列腺摘除術(shù)的患者，經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常膀胱黏膜組織。

1.2 儀器與試劑 API7500實(shí)時熒光定量PCR 儀，主要試劑購自北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司，包括核酸提取液B、Taq酶系、CD44v2PCR Mix、CD44v2陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取 取約50mg膀胱黏膜組織轉(zhuǎn)移至1.5mL干凈離心管中，加1mL生理鹽水混勻，用研磨器研制成勻漿，12 000r／min離心5 min，棄上清液，沉淀加50μL 核酸提取液，充分混勻，100 ℃處理10min，12 000r／min離心5min，取上清4μL做PCR 反應(yīng)。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增 從試劑盒中取出CD44v2PCR Mix、Taq酶，室溫融化并振蕩混勻后，10 000r／min離心10s。CD44v2引物序列為，正向：ATC ACC GAC AGC ACA GAC AGA AT；反向：AAC CAT GAA AAC CAA TCC CAG G。測試反應(yīng)體系配置為：CD44v2PCR Mix 24μL，Taq酶系2μL，然后向各管中分別加入4μL處理后樣品或CD44v2陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品（使用前用陰性質(zhì)控品梯度稀釋10倍、100倍、1 000倍，拷貝數(shù)分別為1×106、1×105、1×104copies／mL）或陰性質(zhì)控品。設(shè)置反應(yīng)體系為30μL，樣品名稱，標(biāo)記熒光基團(tuán)種類（報(bào)告基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為TAMRA）和循環(huán)條件：95 ℃30s，然后95 ℃5s、60 ℃30s共40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0軟件，樣本陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為以有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 總體情況 標(biāo)準(zhǔn)曲線r＝0.99，陽性循環(huán)閾值（Ct值）為35，基因拷貝數(shù)為1×104copies／mL。CD44v2 在正常膀胱及尿路上皮細(xì)胞中不表達(dá)，在70例膀胱及尿路上皮癌組織標(biāo)本中有30例為陽性表達(dá)，陽性率為42.9%。

2.2 CD44v2表達(dá)與膀胱及尿路上皮細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及其復(fù)發(fā)之間的關(guān)系 （1）CD44v2表達(dá)與TNM 分期的關(guān)系：淺表性癌（Tis～T1期）與浸潤性癌（T2～T4期）比較，陽性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.01＜0.05）。（2）CD44v2 表達(dá)與世界衛(wèi)生組織（WHO）病理分級的關(guān)系：CD44v2陽性表達(dá)率隨病理分級增加而升高，高分化膀胱及尿路上皮癌（Ⅰ級）與低分化膀胱及尿路上皮癌（Ⅱ～Ⅲ級）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.04＜0.05）。（3）CD44v2蛋白表達(dá)與復(fù)發(fā)間的關(guān)系：初發(fā)與復(fù)發(fā)患者間腫瘤組織CD44v2表達(dá)的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.33＞0.05）。（4）CD44v2蛋白與腫瘤數(shù)量的關(guān)系：腫瘤單發(fā)與多發(fā)患者腫瘤組織CD44v2 表達(dá)的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.69＞0.05）。見表1。

表1 CD44v2蛋白表達(dá)與TNM 分期、病理分級、復(fù)發(fā)及腫瘤數(shù)的關(guān)系（n）

3 討 論

腫瘤的生長依賴于腫瘤細(xì)胞與宿主組織外基質(zhì)之間的相互作用。CD44是一種蛋白形式的細(xì)胞表面黏附因子，參與細(xì)胞－細(xì)胞、細(xì)胞－基質(zhì)之間的特異性粘連過程［5］。人類CD44基因位于11號染色體短臂（11p13）上，長約92kb，至少有21個外顯子，根據(jù)編碼蛋白的表達(dá)方式分為2型：其中10個固定外顯子位于基因兩端，每端各5個，轉(zhuǎn)錄時固定表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄片段存在于所有CD44蛋白中，稱為標(biāo)準(zhǔn)型CD44基因（CD44s）；在固定的外顯子中間有6～15個外顯子僅表達(dá)于核RNA 的剪接體中，轉(zhuǎn)錄時只存在于一定的CD44轉(zhuǎn)錄子中，不固定的表達(dá)，稱為CD44v基因，主要包括CD44v1～10［6－7］。

CD44s蛋白是存在于多種組織細(xì)胞的表面糖蛋白，而CD44v蛋白主要存在于發(fā)育成熟階段的組織器官細(xì)胞表面［8］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者通過基因水平、蛋白水平兩個方面檢測尿液中CD44，從而對膀胱腫瘤的分化、浸潤、數(shù)量、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后作了大量的研究。目前關(guān)注較多的主要是CD44s、CD44v2、CD44v6、CD44v8～10對膀胱腫瘤的診斷。CD44s及CD44v的異常表達(dá)，與膀胱及尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，但目前仍未得出統(tǒng)一的結(jié)論，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CD44s表達(dá)缺失同時伴有CD44v表達(dá)增高與腫瘤分化程度較差、分期較晚有顯著關(guān)系［9］，CD44s在膀胱尿路上皮癌中持續(xù)表達(dá)，但在分化差的浸潤性癌中表達(dá)下降。但也有研究認(rèn)為膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱黏膜組織中都有CD44s和CD44v2蛋白的表達(dá)，結(jié)果是CD44v2 與腫瘤的分級，分期無關(guān)，認(rèn)為CD44v2不能作為診斷膀胱癌的一個指標(biāo)［10］。而本研究應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR 方法檢測了人正常膀胱黏膜及膀胱尿路上皮癌組織中CD44v2蛋白的表達(dá)，探討了CD44v2陽性表達(dá)與病理分級、臨床分期、腫瘤數(shù)量及復(fù)發(fā)的關(guān)系，結(jié)果CD44v2蛋白在正常膀胱黏膜上皮無表達(dá)，拷貝數(shù)小于1×102copies／mL。在70 例膀胱及尿路上皮癌中陽性表達(dá)是30 例（42.9%），Ct值均小于35，基因拷貝數(shù)均大于1×104copies／mL。CD44v2的表達(dá)在不同膀胱及尿路上皮癌TNM 分期和病理分級間有明顯差異，CD44v2有助于對膀胱及尿路上皮癌的早期診斷，可作為一個參考指標(biāo)［11］。

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