姜黃素對大鼠肝纖維化防治作用*

吳雄健 朱海燕

（贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 贛州 341000）

肝纖維化是由多種原因所引起的慢性肝損害所致病理改變，是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)細(xì)胞外間質(zhì)成分過度異常地沉積，影響肝臟的功能[1]。姜黃素是一種酚類化合物，近年來研究發(fā)現(xiàn)其具有抗肝纖維化作用。但是，目前國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于姜黃素抗肝纖維化作用的研究多限在肝星狀細(xì)胞水平觀察姜黃素對一些細(xì)胞因子、核因子等的影響，在動物實驗水平觀察姜黃素防治肝纖維化作用及其機制的研究較少見。本文采用四氯化碳中毒誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，分析姜黃素的抗肝纖維化作用及其可能機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性清潔級SD大鼠60只，體重120～160 g，由原第一軍醫(yī)大學(xué)動物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 分組造模

60只大鼠正常飼養(yǎng)1周后，隨機分為A（正常組）、B（模型組）、C（高劑量姜黃素組）、D（中劑量姜黃素組）、E（低劑量姜黃素組）、F（陽性組）共6組，每組各10只。其中A組不予任何處理，其他5組大鼠給予恒量四氯化碳油溶液（天津市北宏試劑廠分析純）0.175 ml（四氯化碳與食用花生油以1∶6的比例配制）腹腔注射造模，3次/周（周一、周三、周五各1次），共8周。C、D、E組建模同時按每只大鼠100 g體重分別給予20、10、5 mg姜黃素灌胃（上海三愛思試劑有限公司分析純），3次/周，共8周；F組建模同時按每只大鼠100 g給予秋水仙堿（昆明制藥集團股份有限公司）0.01 mg灌胃，1次/d，5次/周（周一、周三、周四、周五、周日各1次），共8周。

1.2.2 取材

8周后處死大鼠，留取大鼠全血，并分離出血清，-7 ℃保存待測；留取肝左葉浸泡于10%中性甲醛溶液中固定至少24 h待檢。

1.2.3 檢測方法

比色法檢測血清活性氧（ROS）水平；鱟試驗法檢測血清內(nèi)毒素；TBA法檢測肝組織勻漿中丙二醛（MDA）含量；電泳遷移率試驗（EMSA）檢測肝組織中對肝組織核因子-kB（NF-kB）的活性，結(jié)果用圖像分析軟件Image Plus進(jìn)行條帶灰度面積分析，計算NF-kB活性值（灰度值）；免疫組織化學(xué)雙染色檢測肝組織中NF-kB和肌源性特異性標(biāo)志物結(jié)合蛋白（desmin），確定NF-kB在肝星狀細(xì)胞的表達(dá)；免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中轉(zhuǎn)化生長因子-b1（TGF-b1）、血小板衍生長因子-BB（PDGF-BB）、CTGF水平；RT-PCR法檢測肝組織中金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）的mRNA水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 血清ROS水平

經(jīng)四氯化碳造模后模型組血清ROS水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；給予姜黃素后，ROS水平下降，且隨著劑量的增大下降趨勢明顯，其中高劑量姜黃素組與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 大鼠血清ROS及內(nèi)毒素水平比較（x ±s）

2.2 血清內(nèi)毒素水平

模型組血清內(nèi)毒素水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同劑量姜黃素組內(nèi)毒素水平明顯下降，組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量姜黃素組、中劑量姜黃素組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.3 肝組織MDA含量

模型組MDA含量明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)姜黃素治療后，MDA均有下降，高劑量姜黃素組與低劑量黃素組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高、中劑量姜黃素組與模型組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

2.4 肝組織NF-kB活性

姜黃素可降低NF-kB同源序列的結(jié)合活性，且呈劑量依賴性；NF-kB活性（灰度值）檢測結(jié)果顯示，模型組活性明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各劑量姜黃素組活性明顯降低，且呈劑量依賴性，高、中劑量姜黃素組組分別與低劑量姜黃素組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各劑量姜黃素組與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 大鼠肝組織MDA、NF-kB活性及表達(dá)量化分析（x ±s）

2.5 肝組織NF-kB表達(dá)

正常組NF-kB僅極少量表達(dá)于匯管區(qū)血管壁；模型組可見纖維間隔和匯管區(qū)大量表達(dá)，且呈長橢圓形或梭形，且著色較深；高劑量姜黃素組僅少量表達(dá)于匯管區(qū)，中劑量姜黃索組和陽性組在纖維間隔和匯管區(qū)可見表達(dá)，與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量姜黃索組在纖維間隔和匯管區(qū)可見明顯表達(dá)，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；高劑量姜黃素組分別與中、低劑量姜黃素組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

2.6 肝組織TGF-b1表達(dá)

正常組僅少量表達(dá)于于中央靜脈周圍肝細(xì)胞；模型組大量表達(dá)于變性的肝細(xì)胞及其周圍肝竇壁、匯管區(qū)和纖維間隔；隨著姜黃素劑量的增大，表達(dá)量均有下降，不同劑量姜黃素組組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量姜黃素組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性組表達(dá)量低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

表3 大鼠肝組織TGF-b1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-l mRNA表達(dá)量化分析（x ±s）

2.7 肝組織PDGF-BB表達(dá)

正常組PDGF-BB僅在門靜脈血管內(nèi)有少量表達(dá)；模型組在匯管區(qū)間隔內(nèi)細(xì)胞、炎細(xì)胞、竇旁細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，陽性染色面積比例明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)姜黃素治療后表達(dá)明顯減少，主要見于血竇旁、匯管區(qū)，其中高劑量姜黃素組陽性面積比例與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量姜黃素組分別與中、低劑量姜黃素組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

2.8 肝組織TIMP-l mRNA表達(dá)

正常組僅有微量表達(dá)，而模型組表達(dá)量明顯增加，與正常組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各劑量姜黃素組TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯降低，與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量姜黃素組與低劑量黃素組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表 3）。

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同途徑，是肝臟受到各種慢性損傷后發(fā)生的一種修復(fù)反應(yīng)，其實質(zhì)是由于膠原和其它細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成與降解失衡，導(dǎo)致在肝內(nèi)過量沉積[2]。四氯化碳造模過程中，機體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，氧自由基攻擊肝細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，激活的肝巨噬細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞）釋放出多種細(xì)胞因子，如使肝星狀細(xì)胞（HSC）活化轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并產(chǎn)生大量的ECM，從而導(dǎo)致肝纖維化的形成[3-4]。

姜黃素為中藥姜黃的提取物，毒副作用小，具有廣泛的藥理活性，能清除自由基、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和調(diào)控基因表達(dá)，是目前抗肝纖維化作用及機理研究的試驗藥物。本研究結(jié)果表明，姜黃素對血清中ROS和內(nèi)毒素水平及肝組織中MDA、NF-kB、TGF-b1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1 mRNA表達(dá)均有不同程度的抑制作用，且與劑量也有一定的相關(guān)性。其中，內(nèi)毒素可直接產(chǎn)生肝細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)和激發(fā)肝星狀細(xì)胞的基因和表型發(fā)生改變，不同劑量姜黃素組內(nèi)毒素水平明顯下降，可延緩肝纖維化的進(jìn)程[5-6]；經(jīng)姜黃素治療后，肝組織中的MDA水平下降，提示姜黃素為良好的抗氧化物質(zhì)，可穩(wěn)定細(xì)胞膜，通過抗氧化作用，抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生[7-8]；NF-kB在肝纖維化時增強活性，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重肝損傷和纖維化程度，姜黃素可降低NF-kB同源序列的結(jié)合活性，高劑量姜黃素組僅少量NF-kB表達(dá)于匯管區(qū)，由此表明姜黃素通過抑制NF-kB的激活而導(dǎo)致抗凋亡作用，進(jìn)而促進(jìn)HSC凋亡[9-10]；經(jīng)姜黃素治療后，肝組織TGF-b1、PDGF-BB表達(dá)明顯減少，提示姜黃素可降低TGF-bl的促纖維化效應(yīng)，從而減緩HSC的激活、增殖[11-12]，下調(diào)PDGF-BB的表達(dá)，降低PDGF與其受體結(jié)合，使PDGF的促增殖效應(yīng)得到有效抑制[13]；各劑量姜黃素組TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯降低，說明姜黃素可抑制TIMP-1的基因表達(dá)，促進(jìn)ECM降解，減輕肝纖維化程度[14]。

本研究中先采用EMSA技術(shù)以檢測NF-kB在肝組織中的表達(dá)活性，再用免疫組化雙染色檢測NF-kB和結(jié)蛋白，以確定其在HSC中的表達(dá)。其中EMSA和免疫組化雙染色是本研究中的兩個技術(shù)難點。再者本研究從動物實驗水平觀察姜黃素對肝纖維化的治療作用也是本研究的一個亮點。

綜上，本研究證實姜黃素通過多種機制治療肝纖維化，具有保護(hù)肝功能、改善肝臟病理學(xué)變化等功效，對臨床進(jìn)一步應(yīng)用姜黃素抗肝纖維化具有一定的參考價值，但其在人體內(nèi)的功效有待進(jìn)一步探討。

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