16S rRNA基因在肺炎支原體鑒定中的應用

程忠雨 周亮 湯海霞

·臨床研究·

16S rRNA基因在肺炎支原體鑒定中的應用

程忠雨 周亮 湯海霞

目的 我們通過比較利用16S rRNA基因和血清學檢驗方法在診斷肺炎支原體感染中的效果差異，期待找到一種快速有效的方法來鑒定支原體肺炎，并建立一套完善的支原體肺炎臨床診斷標準。方法 將我院呼吸科收治的140例患者分成兩組，16S rRNA基因組70例，用16S rRNA基因進行檢驗；血清學檢驗組70例，用血清學檢驗方法進行檢驗。通過比較檢驗結(jié)果的假陽性率、靈敏度和檢驗平均耗時判定診斷方法在診斷肺炎支原體感染中效果的差異。結(jié)果 血清學檢驗組靈敏度為65%，假陽性率為36%，檢驗平均耗時為3 h；16S rRNA基因檢驗組靈敏度為85%，假陽性率為21%，檢測平均耗時為0.5 h。計數(shù)資料采用χ2檢驗的處理方式，以P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論 16S rRNA基因檢驗作為一種新型的診斷技術，在診斷肺炎支原體感染中相比傳統(tǒng)的血清學檢驗方法具有明顯的優(yōu)勢，無論在靈敏度、檢驗結(jié)果的假陽性率和檢驗耗時上都優(yōu)勢明顯，可考慮作為一種常用的支原體肺炎臨床診斷標準之一。

肺炎支原體；16S rRNA；聚合酶鏈式反應；血清學檢驗方法；肺炎

肺炎支原體(M.Pneumonia)作為一種無細胞壁的寄生微生物，能夠引起很多哺乳動物呼吸系統(tǒng)嚴重病變，同時也是引發(fā)人類肺炎的常見病原微生物之一[1]，比如上呼吸道感染、間質(zhì)性肺炎等。臨床上由肺炎支原體引發(fā)的疾病病癥通常不明顯，經(jīng)過2～3周的潛伏期后，才會引發(fā)相應的癥狀，例如口干、發(fā)熱、咳嗽以及不明原因的頭痛和肌肉酸痛等。由肺炎支原體引發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病與普通流行性感冒所表現(xiàn)的癥狀具有相似點，因此不易做出相應的臨床鑒別診斷。由于較難診斷為肺炎支原體感染，常常錯過最佳的治療時期，導致并發(fā)癥的產(chǎn)生，最終給患者的身心造成嚴重的損害。常用的肺炎支原體檢測方法主要有血清學法，包括酶聯(lián)免疫吸附法、凝集素試驗法和明膠顆粒凝集法等，隨著分子生物學的發(fā)展，診斷方法逐漸多元化，出現(xiàn)了PCR診斷法、核酸診斷試驗法等。

16S rRNA基因是原核微生物的標志性基因，具有高度保守性，常用來作為標志性基因用于原核微生物的鑒別和分類。不同生物的16S rRNA基因具有不同的保守區(qū)和可變區(qū)，通過該區(qū)域設計特異性引物即可擴增出特異的目的片段，從而判定原核微生物的種屬特性；另外我們也可以利用原核微生物的16S rRNA基因通用引物對其基因組進行擴增，將擴增出來的目的片段進行測序，根據(jù)測序結(jié)果判定該微生物的種屬特性[2]。因此我們期待找到一種快速有效的方法來鑒定支原體肺炎，并具有快速的檢測速度和較高的檢測靈敏度，從而為建立一套完善的支原體肺炎臨床診斷標準提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 選取2013年至今我院呼吸科收治的140例患者，其中男78例，女62例，平均分成兩組。16S rRNA基因組70例，其中男40例，女30例；血清學檢驗組70例，其中男38例，女32例。16S rRNA基因組和血清學檢驗組均有口干、發(fā)熱、咳嗽以及不明原因的頭痛和肌肉酸痛等癥狀。16S rRNA基因組70例，用16S rRNA基因進行檢驗；血清學檢驗組70例，用血清學檢查方法進行檢驗。兩組患者的年齡組成均大于3歲，并且性別和年齡分布均勻。

1.2 診斷方法

1.2.1 16S rRNA基因檢驗法 患者住院后，我們在第2天清晨從患者深部呼吸道分泌物取樣檢測。首先我們將患者頭部后仰，采用鼻咽拭子采樣法進行采樣，將樣品稀釋處理后，利用原核生物16S rRNA通用引物對其基因組進行擴增，將擴增的目的片段測序后序列在國家生物技術信息中心數(shù)據(jù)庫中進行比對。與肺炎支原體16S rRNA基因序列一致并伴有上述臨床癥狀的我們認為是肺炎支原體感染[3]。

1.2.2 血清學檢驗方法 機體感染肺炎支原體后，體內(nèi)會發(fā)生免疫反應，血液中不但出現(xiàn)相應的抗體還會產(chǎn)生凝集素，凝集素與相應抗原(O型紅細胞)在一定的條件下反應產(chǎn)生IgM型抗體。我們通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(MP－IgM＞1∶80)結(jié)合上述臨床癥狀的判定為肺炎支原體感染。

1.3 統(tǒng)計方法 計數(shù)資料采用χ2檢驗的處理方式，如果P值小于0.05，則認為兩種檢驗(16S rRNA基因檢驗法和血清學檢驗方法)差異明顯，計數(shù)資料以百分比表示。

2 研究結(jié)果

通過比較檢驗結(jié)果的假陽性率、靈敏度和檢驗平均耗時判定診斷方法在診斷肺炎支原體感染中效果的差異。結(jié)果顯示，血清學檢驗組靈敏度為65%，假陽性率為36%，檢驗平均耗時為3 h；16S rRNA基因檢驗組靈敏度為85%，假陽性率為21%，檢驗平均耗時為0.5 h(表1)。

表1 兩種方法檢測肺炎支原體結(jié)果

從上表中可以看出16S rRNA基因作為一種新型的診斷技術，在診斷肺炎支原體感染中相比傳統(tǒng)的血清學檢驗方法具有明顯的優(yōu)勢，無論在靈敏度、檢驗結(jié)果的假陽性率和檢驗耗時上都優(yōu)勢明顯，比較差異具有統(tǒng)計學意義，可考慮作為一種臨床上常用的支原體肺炎診斷標準之一[4]。

3 討論

由肺炎支原體誘發(fā)的肺炎在臨床患者中占有比較大的比例，但是由于其臨床癥狀不典型，往往被誤認為其他原因所引起的肺炎，錯過最佳的診療時間。近年來隨著人們對肺炎支原體流行病學特征認識的加深，隨著分子生物學研究技術的發(fā)展，人們對肺炎支原體的檢測逐漸有了新的手段和方法。傳統(tǒng)的檢測肺炎支原體的方法主要以血清學手段為主[5]，但是該方法靈敏度低、耗時長，很難滿足快速診斷的臨床需求，因此開發(fā)一種高效、快速、準確有效的肺炎支原體檢測方法變得十分迫切。本研究通過對臨床病例的分組研究，證明了16S rRNA基因作為一種新型的診斷技術相比傳統(tǒng)的血清學檢驗方法具有明顯的優(yōu)勢，具有一定的開發(fā)價值。

[1]王責年，馬進強，蘇艾云.肺炎支原體感染的實驗室診斷進展[J].診斷學理論與實踐，2009，8(4)：458-460.

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[3]陳倩，施圣云，胡正，等.南京地區(qū)急性呼吸道感染兒童支原體、衣原體和常見呼吸道報道病毒病原學分析[J].中國當代兒科雜志，2010，12(6)：450-454.

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[5]王勇，祝曉瑩，袁紅瑛.泌尿生殖道支原體感染及耐藥性研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2009(6)：702-704.

2014-12-01)

1005-619X(2015)04-0369-02

10.13517/j.cnki.ccm.2015.04.012

264309 山東省榮成市第二人民醫(yī)院呼吸科