apelin對脂多糖誘導的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡和骨架改變的影響及機制

劉煥龍，朱忠寧，鹿夢溪，蘇素文，裴庭梅，陳雪彥（.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院藥學部，河北石家莊 050000；.河北醫(yī)科大學藥理學教研室，河北石家莊，05007；.華北理工大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，河北唐山 06009）

apelin對脂多糖誘導的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡和骨架改變的影響及機制

劉煥龍1，朱忠寧2，鹿夢溪3，蘇素文2，裴庭梅2，陳雪彥2
（1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院藥學部，河北石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學藥理學教研室，河北石家莊，050017；3.華北理工大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，河北唐山 063009）

目的 探討apelin對脂多糖（LPS）誘導的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞（PMVEC）凋亡、骨架改變的影響及作用機制。方法 采用體外組織貼塊法培養(yǎng)大鼠PMVEC，激光共聚焦顯微鏡觀察LPS 10 mg·L-1分別處理0，3，6，12，24和48 h PMVEC骨架結(jié)構(gòu)的改變；另取PMVEC加入apelin 1和10 nmol·L-1或p38抑制劑SB203580 10 μmol·L-1預處理，2 h后加入LPS 10 mg·L-1作用24 h后，AnnexinⅤ/PI染色法檢測大鼠PMVEC凋亡，Western蛋白印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白BAX和BCL-2的水平；同時還采用Western蛋白印跡法檢測LPS 10 mg·L-1作用0，5，15，30，60，120和240 min，或apelin 1和10 nmol·L-1預處理2 h后加入LPS 10 mg·L-1作用30 min后p38絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）磷酸化水平的變化。結(jié)果 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，LPS明顯誘導了大鼠PMVEC骨架重排，apelin 1和10 nmol·L-1預處理明顯干預了LPS誘導的PMVEC應力纖維的形成和細胞骨架形態(tài)的改變。AnnexinⅤ/PI染色結(jié)果表明，apelin 1和10 nmol·L-1預處理明顯抑制了LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡，早期凋亡率由（43.8±4.6）%分別降至（33.7± 6.9）%和（11.2±3.0）%（P＜0.05），晚期凋亡率由（54.3±3.4）%分別降至（29.5±4.6）%和（9.0±1.6）%（P＜0.05），并不同程度地逆轉(zhuǎn)了BAX和BCL-2的表達失衡情況（P＜0.05）。Western蛋白印跡結(jié)果顯示，LPS作用5 min即明顯誘導大鼠PMVEC中p38 MAPK磷酸化水平增高（P＜0.05），且在30 min時磷酸化水平達到最高（P＜0.01），apelin預處理明顯抑制了LPS作用30 min誘導的p38 MAPK磷酸化水平的增高（P＜0.01）。p38抑制劑SB203580預處理明顯抑制了LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡，早期（36.7±3.8%）和晚期凋亡率（38.3±7.5%）分別降至（19.7±4.7）%和（15.7±3.6）%（P＜0.01）。結(jié)論 apelin明顯干預了LPS誘導的大鼠PMVEC骨架蛋白重排以及凋亡損傷，這一保護作用與其抑制p38 MAPK信號通路有關(guān)。

apelin；脂多糖；肺微血管內(nèi)皮細胞；細胞凋亡；細胞骨架

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.005

肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVEC）在肺損傷過程中既是首位受損傷的靶細胞，又是活躍的炎癥細胞和效應細胞，在疾病發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［1］。生理條件下它們依靠其正常的增殖和凋亡平衡維持著細胞數(shù)量的穩(wěn)定和血管功能的正常。在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的肺損傷疾病中，激活的PMVEC作為靶細胞最易遭到損傷，從而導致凋亡或壞死，這些改變與細胞骨架的變化密切相關(guān)［2］。凋亡發(fā)生時多種細胞骨架蛋白由于受到促凋亡因素作用，發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。F肌動蛋白肌絲發(fā)生斷裂，網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)遭到破壞，是細胞凋亡時形態(tài)改變的一個典型特征，也可能是凋亡早期的調(diào)控物之一［3］。

apelin作為一種新的血管活性多肽，在肺組織中和其受體APJ聯(lián)合表達水平最高［4］。apelin除了具有多數(shù)舒血管活性物質(zhì)所具有的功能外，還有調(diào)節(jié)免疫反應、抗炎和抗病毒感染的功能［5］。眾多肺動脈高壓臨床和動物模型實驗研究也表明，apelin/ APJ系統(tǒng)可能參與了肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展［6］。我們之前研究也表明，apelin能促進PMVEC增殖，干預LPS誘導的PMVEC損傷。但對凋亡以及細胞骨架的影響還未見報道。因此，本研究采用流式細胞儀、激光共聚焦顯微鏡等觀察LPS對大鼠PMVEC凋亡和細胞骨架肌動蛋白變化的影響以及apelin對此的干預作用，并深入探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

apelin、LPS（E.coli 055：B5）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和FITC標記的鬼筆環(huán)肽購自美國Sigma-Aldrich公司，用無血清DMEM培養(yǎng)液溶解配制成10 mmol·L-1的母液，-80℃保存，臨用時用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT、胰蛋白酶購自北京索來寶科技有限公司；p38、p-p38抗體購自Bioworld Technology公司；BCL-2、BAX抗體購自美國Cell Signal Technology公司；β肌動蛋白抗體購自北京中杉金橋公司；IRDye 800、IRDye 700標記的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗購自美國Rockland公司；AnnexinⅤFITC Kit購自北京四正柏生物科技有限公司；青鏈霉素混合液（100×）購自北京索來科技有限公司；肝素鈉購自江蘇萬邦生長醫(yī)藥股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱、HEALFORCE超凈工作臺購于上海力申儀器公司；5412R低溫離心機購于德國Eppendorf公司；倒置顯微鏡、光學顯微鏡購于日本Olympus公司；TCS-SP2激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司；ND-1000紫外/可見光分光光度計購自美國NanoDrop公司；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)購自美國Gene公司；Epics-XLⅡ型流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 PMVEC制備與鑒定

采用組織貼塊法原代培養(yǎng)PMVEC［7］。Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量100～150 g，合格證號13101098，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。腹腔注射3000 U肝素鈉并麻醉后，右心室注入D-Hanks液對心肺進行灌注，取出肺組織，剪取肺表面1～3 mm深的肺外緣組織，清洗后將其剪成約1 mm3大小的組織塊，均勻接種到25 cm2一次性無菌塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)，加DMEM培養(yǎng)液（含20%胎牛血清，青霉素100 kU·L-1，鏈霉素0.1 g·L-1，VEGF 50 ng·mL-1，肝素鈉90 U·mL-1）約1.5 mL于培養(yǎng)瓶內(nèi)，浸沒組織塊。于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，b每天換液1次。貼壁60 h時，輕輕去除組織塊，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每3 d換液1次，直至瓶底細胞基本匯合后，傳代培養(yǎng)。鏡下觀察、機械刮除及差速消化法進行純化去除成纖維細胞及平滑肌細胞等混雜細胞。Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細胞化學染色進行鑒定。

1.4 細胞分組與處理

取對數(shù)生長期的PMVEC消化分離，并制備2×107L-1密度的細胞懸液，接種于無菌玻片上或培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1～2 d至細胞融合約達80%時，用含0.1%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h作同步化處理，用于后續(xù)實驗。（1）細胞分為LPS 10 mg·L-1處理不同時間（0，3，6，12，24，48 h）組，觀察細胞骨架蛋白的變化；（2）LPS 10 mg·L-1處理不同時間（0，5，15，30，60，120，240 min）組檢測p38磷酸化水平的變化。（3）細胞分為正常對照組（加入等體積的0.1%胎牛血清培養(yǎng)液）、LPS10mg·L-1組、apelin1和10nmol·L-1（apelin預處理2 h后加入LPS10 mg·L-1），刺激細胞24 h，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架蛋白的變化；AnnexinⅤ/PI染色法檢測大鼠PMVEC凋亡；Western蛋白印跡法檢測BAX和BCL-2的表達。同樣濃度apelin預處理2 h后，加入LPS 10 mg·L-1刺激細胞30 min，檢測p38磷酸化水平的變化；（4）細胞分為正常對照組（加入等體積的0.1%胎牛血清培養(yǎng)液）、LPS 10 mg·L-1組、p38抑制劑SB203580 10 μmol·L-1預處理2 h后加入LPS 10 mg·L-1組，刺激細胞24 h，AnnexinⅤ/PI染色檢測細胞凋亡。

1.5 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架蛋白的變化

取1.4分組處理的細胞，4%多聚甲醛室溫條件下固定細胞30 min，PBS液清洗3次后，加入0.2% Triton X-100室溫破膜30 min。接著PBS液清洗3次，10%山羊血清封閉30 min，然后加入FITC標記的鬼筆環(huán)肽（1∶1000）4℃過夜，PBS清洗3次后，熒光信號采用Leica SP2激光共聚焦進行檢測，不同處理組的細胞采用激光共聚焦顯微鏡檢測時，各項參數(shù)均保持一致。細胞攜帶的熒光強弱表示F肌動蛋白的表達豐度。

1.6 AnnexinⅤ/Pl染色法檢測細胞凋亡

取1.4分組處理的細胞，用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，將其轉(zhuǎn)移到尖底離心管中，1000×g，離心10 min；棄去上清，用4℃預冷的PBS液洗滌細胞2次，然后用250 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，調(diào)整密度約1×109L-1。每組各取100 μL細胞懸液置于5 mL流式管中，加入5 μL AnnexinⅤ/FITC和10 μL PI 20 g·L-1染劑，混勻后室溫避光孵育15 min；然后在反應管中加入400 μL PBS制成單細胞懸液，在流式細胞儀上檢測細胞的凋亡率。實驗平行重復4次，結(jié)果使用Expo32 ADC Analysis軟件分析擬合。

1.7 Western蛋白印跡檢測BAX，BCL-2蛋白水平以及p38 MAPK磷酸化水平

取1.4分組處理的細胞，加入適量RIPA細胞裂解液，裂解細胞并提取蛋白，ND-1000紫外/可見光分光光度計進行蛋白定量。等量蛋白（60μg）上樣，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（DAGE）分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上（4℃，2 h），室溫下含50 g·L-1脫脂奶粉的TBST封閉1h，加入一抗，4℃過夜，次日TBST液洗膜后，加入相應二抗（1∶5000稀釋），37℃，1 h。TBST液洗膜3次，Odyssey 9120雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描PVDF膜并成像保存。p38 MAPK磷酸化水平用p-p38/p38MAPK的積分吸光度值比值表示。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 apelin對LPS誘導的大鼠PMVEC骨架蛋白的影響

激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果顯示（圖1），正常對照組可見少量的肌動蛋白纖維絲，且主要分布在細胞周邊，界限分明（圖1A）。LPS 10 mg·L-1處理6 h，胞漿F肌動蛋白纖維絲即明顯增多增長，大多沿細胞呈縱軸排列，整個細胞的F肌動蛋白-熒光強度明顯增強（圖1C）；LPS作用12 h細胞外周邊緣變得毛糙不規(guī)整，輕微鋸齒樣分布，細胞有輕微的回縮（圖1D）；作用24 h時可見細胞周邊的F肌動蛋白逐漸消失，胞漿中出現(xiàn)密集的束狀應力纖維，F(xiàn)肌動蛋白在細胞內(nèi)雜亂無章、彌散分布，細胞間失去正常連接結(jié)構(gòu)（圖1E）；作用48 h可見細胞已完全變形，失去正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，應力纖維增多、雜亂，細胞間連接基本消失（圖1F）。apelin 1和10 nmol·L-1預處理明顯干預了LPS誘導的PMVEC應力纖維的形成和細胞骨架形態(tài)的改變，F(xiàn)肌動蛋白熒光強度也明顯減弱（圖2C，D）。

2.2 apelin對LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡的影響

Fig.1 Effect of lipopolysaccharide（LPS）on cytoskeleton proteins in pulmonary microvascular endothelial cells （PMVECs）observed by confocal microscopy.Quiescent PMVECs were treated with LPS 10 mg·L-1for 0 h（A），3 h（B），6 h（C），12 h（D），24 h（E）and 48 h（F），respectively.Arrows show the arrangement of F-actin.

Fig.2 Effect of apelin on changes in cytoskeleton proteins in rat PMVECs induced by LPS observed by confocal microscopy.Quiescent PMVECs were pretreated with apelin（1 and 10 nmol·L-1）for 2 h，then stimulated with LPS（10 mg·L-1）for 24 h.A：normal control group；B：LPS group；C：LPS+apelin 1 nmol·L-1；D：LPS+apelin 10 nmol·L-1. Arrows show the arrangement of F-actin.

AnnexinⅤ-FITC染色流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果（圖3及表1）顯示，與正常對照組相比，LPS 10 mg·L-1作用24 h明顯誘導了大鼠PMVEC凋亡，早期和晚期細胞凋亡率均明顯增加（P＜0.01）。apelin 1和10 nmol·L-1預處理明顯抑制了LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡，早期和晚期細胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），說明apelin明顯干預了LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡。

Fig.3 Effect of apelin on apoptosis in rat PMVECs induced by LPS.Quiescent PMVECs were pretreated with apelin（1 and 10 nmol·L-1）for 2 h，then stimulated with LPS （10 mg·L-1）for 24 h.A：normal control group；B：LPS group；C：LPS+apelin 1 nmol·L-1；D：LPS+apelin 10 nmol·L-1.

Tab.1 Effects of apelin on apoptosis rate of rat PMVECs induced by LPS

2.3 apelin對LPS誘導的大鼠PMVEC細胞BAX和BCL-2蛋白水平的影響

結(jié)果如圖4所示，與正常對照組相比，LPS 10 mg·L-1作用24 h明顯降低了BCL-2的蛋白水平（P＜0.01），同時也顯著上調(diào)了BAX的蛋白水平（P＜0.01），BCL-2/BAX的比率明顯降低。apelin 1和10 nmol·L-1明顯逆轉(zhuǎn)了LPS誘導的BAX和BCL-2的蛋白水平失衡情況，均不同程度地下調(diào)了BAX水平，上調(diào)了BCL-2的水平（P＜0.05，P＜0.01），BCL-2/ BAX的比率明顯升高。

Fig.4 Effect of apelin on BCL-2 and BAX expression in rat PMVECs induced by LPS by Western blotting.See Fig.3 for the treatment.1：normal control group；2：LPS group；3：LPS+apelin 1 nmol·L-1；4：LPS+apelin 10 nmol·L-1.±s，n= 3.**P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with LPS group.

2.4 apelin對LPS誘導的大鼠PMVEC中p38 MAPK磷酸化水平的影響

Fig.5 Effect of LPS on phosphorylation of p38 MAPK （p-p38 MAPK）in rat PMVECs by Western blotting.B was the semiquantitative result of A.±s，n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with LPS 0 mg·L-1.

Western蛋白印跡結(jié)果（圖5）顯示，LPS 10 mg·L-1作用5 min即明顯誘導大鼠PMVEC中p38 MAPK磷酸化水平增高（P＜0.05），且在30 min時磷酸化水平達到最高（P＜0.01）。相同實驗條件下（圖6），apelin 1和10 nmol·L-1預處理均不同程度地抑制了LPS作用30 min誘導的p38 MAPK磷酸化水平的增高（P＜0.01）。說明apelin可能通過抑制p38 MAPK通路干預了LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡。

Fig.6 Effect of apelin on p-p38 MAPK in rat PMVECs induced by LPS.1：normal control group；2：LPS group；3：LPS+apelin 1 nmol·L-1；4：LPS+apelin 10 nmol·L-1.±s，n=3. **P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with LPS group.

2.5 SB203580對LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡的影響

表2及圖7結(jié)果顯示，與正常對照組相比，LPS 10 mg·L-1作用24 h早期和晚期細胞凋亡率均明顯增加（P＜0.01）。SB203580 10 μmol·L-1預處理明顯抑制了LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡，早期和晚期細胞凋亡率均顯著降低（P＜0.01）。

Tab.2 Effect of SB203580 on apoptosis in rat PMVECs induced by LPS

Fig.7 Effect of SB203580 on apoptosis in rat PMVECs induced by LPS detected by flow cytometry.See Tab.2 for the treatment.A：normal control group；B：LPS group；C：LPS+SB203580（10 μmol·L-1）group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，LPS作用于大鼠PMVEC后，F(xiàn)肌動蛋白纖維絲明顯增多，在細胞內(nèi)雜亂無章、彌散分布，細胞骨架形態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞凋亡明顯增多，提示LPS可直接誘導細胞損傷。另外，在LPS作用過程中出現(xiàn)p38 MAPK活化，其磷酸化水平顯著增加，提示p38 MAPK信號通路可能參與了LPS誘導的細胞損傷。apelin作為一種新的血管活性多肽，明顯干預了LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡、骨架蛋白重排等細胞損傷，還抑制了LPS誘導的p38 MAPK活化，表明apelin對細胞損傷的保護作用與其抑制p38 MAPK信號分子活化有關(guān)。

眾所周知，細胞骨架在維持細胞的正常形態(tài)以及完整性方面起著重要作用。F肌動蛋白可能是凋亡早期的調(diào)控物之一，F(xiàn)肌動蛋白的解聚是凋亡過程中所必須的［8］。當細胞受到惡性刺激時，F(xiàn)肌動蛋白會發(fā)生重組和再分布，細胞周邊F肌動蛋白環(huán)斷裂，細胞中央出現(xiàn)大量呈束狀密集排列的應力纖維，導致細胞中心張力增高，加速細胞收縮，引起凋亡壞死［9］。本研究結(jié)果表明，apelin預處理明顯干預了LPS誘導的PMVEC應力纖維的形成和細胞骨架形態(tài)的改變，F(xiàn)肌動蛋白熒光強度明顯減弱，說明apelin能明顯抑制LPS誘導的PMVEC骨架重排。

bcl-2基因是重要的抗凋亡基因之一，它可通過抑制線粒體通透性增加，阻止線粒體膜電位的下降來阻止細胞凋亡的發(fā)生［10］。bcl-2基因家族的另一個成員Bax，不但可以拮抗BCL-2的抗凋亡作用，還可以直接促進細胞凋亡［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，apelin明顯逆轉(zhuǎn)了LPS對BAX和BCL-2的影響，表明apelin通過調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的含量明顯抑制了LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡。

MAPK的活化在許多細胞類型中參與Toll樣受體介導的細胞生物學功能［12］，是細胞內(nèi)信息傳遞通路的匯聚點或共同通路，對細胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯有重要的調(diào)控作用，其中p38 MAPK主要參與細胞對病理性應激和細胞毒性因子的反應。本研究顯示，LPS作用5 min時即明顯誘導大鼠PMVEC 中p38磷酸化水平增高，且在30 min時磷酸化水平達到最高，提示p38蛋白必須磷酸化后，信號才能轉(zhuǎn)入細胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子、影響基因的表達。表明LPS誘導的p38活化可以說是觸發(fā)細胞凋亡等相關(guān)信號轉(zhuǎn)導的起始環(huán)節(jié)，隨后通過調(diào)控下游信號，影響凋亡等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，最終誘導細胞損傷，說明p38 MAPK可能參與了LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)SB203580明顯抑制LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡，進一步說明p38的活化參與了LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡。而apelin預處理明顯抑制了LPS誘導的p38磷酸化水平的增高，說明apelin通過抑制p38 MAPK通路干預了LPS誘導的大鼠PMVEC凋亡。

綜上所述，apelin明顯干預了LPS誘導的大鼠PMVEC骨架蛋白重排、凋亡損傷及凋亡相關(guān)蛋白的影響，這一保護作用與其抑制p38 MAPK信號通路有關(guān)。

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（本文編輯：喬 虹）

Effect of apelin on lipopolysaccharide-induced apoptosis and cytoskeleton rearrangement in rat pulmonary microvascular endothelial cells and the mechanisms

LIU Huan-long1，ZHU Zhong-ning2，LU Meng-xi3，SU Su-wen2，PEI Ting-mei2，CHEN Xue-yan2
（1.Department of Pharmacy，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China；2.Department of Pharmacology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；3.College of Basic Medicine，North China University of Science and Technology，Tangshan 063009，China）

OBJECTlVE To explore the effect of apelin on the lipopolysaccharide（LPS）-induced apoptosis and cytoskeleton rearrangement in rat pulmonary microvascular endothelial cells（PMVECs）and the underlyingmechanisms.METHODSPMVECswereculturedwiththeexplanttechnique.The cytoskeletal rearrangement after LPS 10 mg·L-1treatment for 0，3，6，12，24 and 48 h was detected by the laser confocal microscope.Quiescent PMVECs were pretreated with apelin（1 and 10 nmol·L-1）or p38 inhibitor SB203580（10 μmol·L-1）for 2 h and stimulated with LPS（10 mg·L-1）for 24 h before the apoptosis of PMVECs was evaluated by AnnexinⅤ/PI staining assay，while the levels of apoptosis-related proteins BAX and BCL-2 were evaluated by Western blotting analysis.Meanwhile，quiescent PMVECs were treated with LPS 10 mg·L-1for 0，5，15，30，60，120 and 240 min or pretreated with apelin（1 and 10 nmol·L-1）for 2 h and then stimulated with LPS（10 mg·L-1）for 30 min，and then the phosphorylation of p38 MAPK was detected by Western blotting.RESULTS The results of the laser confocal microscope showed that LPS significantly induced cytoskeleton rearrangement of rat PMVECs.Meanwhile，the formation of stress fiber and the morphological changes in cytoskeleton induced by LPS were obviously inhibited by apelin（1 and 10 nmol·L-1）pretreatment.The results of AnnexinⅤ-FITC staining showed that apelin 1 and 10 nmol·L-1inhibited the LPS-induced apoptosis of PMVECs significantly.The early apoptosis rate decreased from（43.8±4.6）%to（33.7±6.9）%and（11.2±3.0）%，respectively（P＜0.05）and the late apoptosis rate decreased from（54.3±3.4）%to（29.5±4.6）%and（9.0±1.6）%，respectively（P＜0.05）.Apelin 1 and 10 nmol·L-1also reversed the imbalance of the protein expression of BAX and BCL-2 caused by LPS （P＜0.05）.Western blotting analysis suggested that the phosphorylation of p38 MAPK began to increase after LPS treatment for 5 min（P＜0.05）and with the highest level observed at 30 min（P＜0.01），which was obviously inhibited by apelin（1 and 10 nmol·L-1）pretreatment（P＜0.01）.Meanwhile，SB203580 pretreatment significantly inhibited the LPS induced apoptosis of rat PMVECs，for the early and late apoptosis rate decreased from（36.7±3.8）%to（19.7±4.7）%and（38.3±7.5）%to（15.7±3.6）%，respectively （P＜0.01）.CONCLUSlON Apelin obviously inhibits the LPS induced cytoskeletal rearrangement and apoptosis injury，which is mediated by the inhibition of p38 MAPK signal pathway.

apelin；lipopolysaccharide；pulmonary microvascular endothelial cells；apoptosis；cytoskeleton

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81273600）；and Natural Science Foundation of Hebei Province（H2013206147）

CHEN Xue-yan，Tel：（0311）86265644；E-mail：cxylong@126.com

R966

A

1000-3002（2015）06-0905-07

國家自然科學基金資助項目（81273600）；河北省自然科學基金資助項目（H2013206147）

劉煥龍，男，博士，副主任藥師，主要從事心血管藥理學研究，E-mail：lhlong1026@163.com，Tel：（0311）66002772；陳雪彥，女，副教授，主要從事心血管藥理學研究。

陳雪彥，E-mail：cxylong@126.com，Tel：（0311）86265644，13933004550

（2015-05-27接受日期：2015-09-08）