過氧化氫誘導(dǎo)血管平滑肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其自噬作用

李松巖，郭 敏，王 煙，于 洋，劉師兵，徐 冶（吉林醫(yī)藥學(xué)院.科研實驗室，.附屬醫(yī)院，吉林吉林 303）

過氧化氫誘導(dǎo)血管平滑肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其自噬作用

李松巖1，郭 敏2，王 煙1，于 洋1，劉師兵1，徐 冶1
（吉林醫(yī)藥學(xué)院1.科研實驗室，2.附屬醫(yī)院，吉林吉林 132013）

目的 觀察過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)血管平滑肌細胞（VSMC）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其自噬的作用機制。方法 體外培養(yǎng)VSMC細胞，加入H2O250，100，200，400，600，800，1200和1600 μmol·L-1分別作用12和24 h后，MTT法檢測H2O2對VSMC的抑制率；倒置相差顯微鏡觀察H2O2對VSMC細胞形態(tài)的影響；采用間接免疫熒光法檢測自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）和泛素結(jié)合蛋白p62的表達，采用Western蛋白印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白人卷曲螺旋肌球蛋白樣BCL2相互作用蛋白/自噬基因（Beclin-1）和LC3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和CCAAT-增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）及自噬上游信號通路哺乳動物西羅莫司（雷帕霉素）靶蛋白（mTOR）的表達。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，H2O250～1600 μmol·L-1作用VSMC細胞12和24 h，VSMC細胞存活率明顯降低，12和24 h的IC50分別為（597.2±2.3）和（447.4± 1.7）μmol·L-1。倒置相差顯微鏡觀察可見H2O2400 μmol·L-1組VSMC收縮變圓。H2O2400 μmol·L-1作用VSMC 12 h時，細胞存活率由（97.5±0.1）%下降至（74.4±1.0）%；作用VSMC 24 h，下降至（56.8±0.9）% （P＜0.01）。激光共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，H2O2400 μmol·L-1作用VSMC 8 h，細胞漿中LC3和p62蛋白隨H2O2作用時間的延長表達增加。LC3與p62的共定位顯示，H2O2400 μmol·L-1作用8 h最明顯。Western蛋白印跡結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78，CHOP和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達顯著增加（P＜0.01），mTOR的表達顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論 H2O2可能通過誘導(dǎo)VSMC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活自噬。

自噬；血管平滑肌細胞；過氧化氫；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.004

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是動脈血管的一種慢性炎癥性病變，可引起心腦血管疾病，是嚴重危害人類健康的頭號殺手［1］。近年來，自噬對AS的作用開始受到廣泛關(guān)注。AS的特點是以炎癥細胞浸潤和脂質(zhì)堆積為主要特征的慢性炎癥性過程。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）以及巨噬細胞的自噬在動脈血管病變中起著重要保護作用［2］。

自噬是真核細胞利用溶酶體途徑降解自身受損傷的細胞及細胞器和變性蛋白質(zhì)等生物大分子的一個過程，是在自噬相關(guān)基因調(diào)控下完成的［3-6］。在AS病變中，VSMC的異常增殖是其主要的病理過程［7］。一些內(nèi)外源因素的影響使VSMC增殖失控，可引起血管壁的病變［8］。研究表明，自噬可以抑制VSMC增殖［9］。黃英等［10］研究表明，過氧化氫（H2O2）可以誘導(dǎo)VSMC凋亡［11］。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可引起細胞產(chǎn)生凋亡。本研究通過檢測ERS相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白的表達，探討H2O2對VSMC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

β肌動蛋白、人卷曲螺旋肌球蛋白樣BCL2相互作用蛋白/自噬基因（human coiled-coil myosin-like BCL2-interacting protein，Beclin-1）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated proteins 78 ku，GRP78）、CCAAT-增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）兔多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；新生胎牛血清、杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基（dulbecco minimum essential medium，DMEM）購自美國Gibco公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔相應(yīng)二抗購自長春德爾塔公司；微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）和p62蛋白兔多克隆抗體購自美國Epotomics公司；PVDF膜購自德國Milipore公司；H2O2、甘氨酸、甲叉丙烯酰胺、Hoechst33342熒光染料等購于北京鼎國公司；四甲基偶氮唑藍〔3-（4，5-dimethy-2-thiazoly）-2，5-diphenyl-2-tetrazoliumbromide，MTT〕購于美國Sigma公司。

恒溫二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司），電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司），超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾公司），高速臺式冷凍離心機（德國Hermle公司），倒置光學(xué)顯微鏡（日本Leica公司），水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），Model-680型酶標儀、蛋白電泳儀和蛋白轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-Rad公司），脫色搖床（北京六一醫(yī)學(xué)儀器廠），超聲細胞粉碎儀（寧波新芝生物科技有限公司），高溫高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司），數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 細胞、細胞培養(yǎng)和分組處理

購自中國科學(xué)院上海細胞庫的VSMC為貼壁細胞，用含體積分數(shù)為20%新生胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，青霉素100 kU·L-1和鏈霉素0.1 g·L-1，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化傳代。隔2 d傳代1次。取生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。調(diào)整細胞密度為8×103L-1，接種于96空板，每孔200 μL，隨機分為正常對照組、H2O250，100，200，400，600，800，1200和1600 μmol·L-1組，分別處理12和24 h后進行指標檢測。

1.3 MTT方法檢測細胞存活

取1.2分組處理的細胞，每孔加入200 μL新配制MTT 0.5 mg·L-1，37℃孵育4 h，小心棄去孔中培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，Model-680型酶標儀490 nm波長測定吸光度（A490 nm）值。測3次，取平均值。細胞生長抑制率（%）=1-（A實驗組－A空白組）/（A對照組－A空白組）×100%。

1.4 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)

取對數(shù)生長期細胞以1×108L-1密度接種于24孔板中，每孔500 μL，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞長至80%密度，加入H2O2400 μmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)12和24 h，同時設(shè)正常對照組。各組細胞置于倒置相差顯微鏡下觀察細胞收縮、細胞密度情況，記錄活細胞數(shù)，并照相。

1.5 間接免疫熒光法檢測LC3和p62蛋白的共定位

取高壓消毒后無菌蓋玻片（10 mm×10 mm）置于24孔板中，取VSMC密度1×108L-1，每孔500 μL接種過夜，次日細胞長至80%密度，實驗組加H2O2400 μmol·L-1分別處理4，8和12 h，同時設(shè)正常對照組。棄培養(yǎng)基，加入200 μL固定液（4%多聚甲醛）作用10 min，吸去固定液經(jīng)0.1%Triton PBS作用5 min，PBS 0.01 moL·L-1溶液洗滌，非免疫山羊血清封閉30 min，加入預(yù)混的一抗4℃過夜，PBS 0.01 mol·L-1溶液洗滌，加入預(yù)混的熒光二抗作用30 min，PBS 0.01 mol·L-1溶液洗滌，抗熒光淬滅劑封片。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察H2O2400 μmol·L-1作用VSMC 4，8和12 h細胞不同時間LC3和p62蛋白熒光強弱及共定位的變化。應(yīng)用FV10-ASW軟件隨機選取視野，統(tǒng)計視野內(nèi)所有細胞內(nèi)熒光點個數(shù)，以細胞內(nèi)熒光點個數(shù)的平均值作為目標蛋白的表達量。

1.6 Western蛋白印跡法檢測Beclin-1，LC3，mTOR，GRP78和CHOP蛋白表達

待VSMC生長狀態(tài)良好且呈對數(shù)生長時，隨機分為正常對照組、H2O2400 μmol·L-14，8和12 h組，棄培養(yǎng)液，胰酶消化，離心收集細胞，每瓶加入150 μL蛋白裂解液RIPA，混勻，超聲細胞粉碎儀超聲細胞2次，每次3～5 s，4℃放置30 min，蛋白裂解液充分裂解細胞后，高速臺式冷凍離心機離心收集上清液。Bradford法進行蛋白定量。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，膜用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，PBST洗3次，加入相應(yīng)稀釋度的一抗，4℃過夜。次日PBST洗3次，加入相應(yīng)稀釋度的HRP標記的二抗，室溫搖床孵育1.5 h；PBST 洗5次，ECL顯色，掃描紀錄。以β-肌動蛋白作為內(nèi)參照，采用Quantity One軟件進行分析處理，以目標蛋白與內(nèi)參照蛋白的積分吸光度值比值表示蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 過氧化氫對血管平滑肌細胞存活的影響

如圖1所示，H2O2在50～1600 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)對VSMC的存活具有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系（r=0.985，P＜0.05）。隨著H2O2作用時間的延長，對VSMC存活的抑制作用也逐漸增強，呈現(xiàn)時間依賴關(guān)系（r=0.983，P＜0.05）。H2O2作用12 h，VSMC的IC50為（447.4±2.3）μmol·L-1；作用24 h，VSMC的IC50為（597.2±1.7）μmol·L-1。表明H2O2可顯著抑制VSMC的存活。

Flg.1 Effect of H2O2on survival of vascular smooth musclecells（VSMCs） detectedby　MTTassay. VSMCs were treated with H2O2（50-1600 μmol·L-1）for 12 and 24 h，respectively.±s，n=3.

2.2 過氧化氫對血管平滑肌細胞的生長抑制作用

倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示（圖2），隨著時間延長，H2O2400 μmol·L-1可明顯抑制VSMC的生長，導(dǎo)致細胞收縮變圓，細胞密度變稀?。▓D2B，C）。H2O2400 μmol·L-1與VSMC作用12 h時，細胞存活率由（97.5±0.1）%下降至（74.4±1.0）% （P＜0.01）；H2O2400 μmol·L-1與VSMC作用24 h時，細胞存活率下降至（56.8±0.9）%（n=3，P＜0.01）。

Fig.2 lnhibitory effect of H2O2on VSMCs growth（×250）.See Fig.1 for the cell treatment.A：normal control；B：H2O2400 μmol·L-1for 12 h；C：H2O2400 μmol·L-1for 24 h.

2.3 過氧化氫對血管平滑肌細胞LC3和p62蛋白表達的影響

激光共聚焦顯微鏡及其定量分析（圖3）結(jié)果顯示，與正常對照組（圖4A1-D1）相比，H2O2400 μmol·L-1與VSMC作用4，8和12 h后，LC3蛋白（圖4B2～B4）和p62（圖4C2～C4）均呈散在分布，熒光強度和共定位（圖4D2～D4）隨H2O2作用時間延長而遞增。與正常對照組相比，8 h組細胞內(nèi)LC3綠色熒光點數(shù)由（2.1±0.2）×103個增加到（29.8±0.3）×103個（P＜0.01，圖4B3），細胞內(nèi)p62紅色熒光點數(shù)由（1.6±0.1）×103個增加到（41.2± 0.7）×103個（P＜0.05，圖4C3），細胞內(nèi)共定位黃色熒光點數(shù)由（1.8±0.1）×103個增加到（36.3±0.2）× 103個（P＜0.01），共定位現(xiàn)象明顯增強（圖4D3）。表明H2O2400 μmol·L-1與VSMC作用8 h時，產(chǎn)生自噬最強。

Fig.3 Effect of H2O2on VSMCs autophagy.See Fig.4 for the　dots　in　the　cells.LC3：microtubule-associated　protein light chain 3.±s，n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with normal control group.

Fig.4 Effect of H2O2on LC3（B）and p62（C）protein co-localization in VSMCs by Hoechst（A），F(xiàn)lTC（B）and Rodamin123（C）staining.D was the merge of B and C.1：normal control；2：H2O2400 μmol·L-1for 4 h；3：H2O2400 μmol·L-1for 8 h；4：H2O2400 μmol·L-1for 12 h.Arrows indicate colocalization of LC3 and p62.

2.4 過氧化氫對血管平滑肌細胞Beclin-1，LC3，mTOR，GRP78和CHOP表達的影響

Western蛋白印跡法結(jié)果（圖5）所示，H2O2400 μmol·L-1組自噬標志蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表達顯著上升（P＜0.01），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP表達顯著上升（P＜0.01）。說明ERS可以誘導(dǎo)VSMC細胞產(chǎn)生自噬。結(jié)果顯示，隨著H2O2作用時間的延長，Beclin-1蛋白表達逐漸增強，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值逐漸增高，蛋白表達增強，且mTOR蛋白的表達逐漸減弱。

Fig.5 Effect of H2O2on expression of Beclin-1，LC3，glucose regulated proteins 78 ku（GRP78），C/EBP homologous protein（CHOP）and mammalian target of rapamycin（mTOR）in VSMCs detected by Western blotting.A：lane 1，normal control；lane 2，4 h；lane 3，8 h；lane 4，12 h.B and C were the semiquantitative results of A.±s，n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with normal control group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，H2O2作用VSMC后，細胞存活率下降，細胞收縮變圓，細胞密度也明顯下降，存在時間和濃度依賴性。揭示作為活性氧家族一員的H2O2作用于VSMC，導(dǎo)致細胞應(yīng)激損傷，這與已報道結(jié)果一致［10-11］。

自噬是哺乳動物中高度保守的清除、降解和回收利用細胞內(nèi)生物大分子和受損細胞器的重要代謝通路，對維持細胞穩(wěn)態(tài)有重要作用［12］。本研究通過共聚焦顯微鏡觀察到，LC3和p62蛋白熒光強度隨著H2O2作用時間的延長呈遞增趨勢。H2O2與VSMC作用8 h時，自噬標志蛋白LC3與p62熒光呈現(xiàn)點狀聚集，有明顯細胞內(nèi)共定位現(xiàn)象。而Western蛋白印跡結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)了VSMC Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表達增強，表明VSMC自噬被活化。進一步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有可能是肌醇需求酶1（inositol requiring enzyme 1，IRE1）-c-jun氨基端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）途徑發(fā)揮了一定的作用。IRE1-JNK途徑是自噬的上游控制分子，可被多種刺激所誘導(dǎo)，如生長因子或營養(yǎng)變化，從而對應(yīng)激產(chǎn)生反應(yīng)，包括低氧和氧化應(yīng)激［13］。在細胞中，Beclin-1的活化和Akt/mTOR信號途徑的抑制與自噬的誘導(dǎo)活化有關(guān)聯(lián)［14］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是哺乳動物細胞內(nèi)重要的膜性細胞器，其主要功能是參與蛋白質(zhì)的折疊和修飾及Ca2+的貯存和釋放。在一些生理病理或外界因素下均可誘導(dǎo)ERS［15］。本研究結(jié)果顯示，H2O2作用VSMC增加了Beclin-1蛋白的表達，并且H2O2處理活化了GRP78和CHOP蛋白表達，與此同時Akt/mTOR信號途徑也受到抑制。這可能是H2O2作用VSMC后，誘導(dǎo)VSMC產(chǎn)生ERS，激活細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+信號通道［16］。Ca2+信號通道激活，抑制mTOR信號通路。在這種多信號通路調(diào)節(jié)的情況下使VSMC細胞產(chǎn)生自噬，表明H2O2可通過誘導(dǎo)VSMC的ERS產(chǎn)生自噬。

綜上所述，H2O2能誘導(dǎo)VSMC的ERS，通過激活Ca2+通道，抑制mTOR的表達，從而誘導(dǎo)細胞自噬。VSMC的凋亡，可導(dǎo)致AS斑塊帽的破裂，促進AS進程。而自噬可抑制AS斑塊的發(fā)展［17］。通過控制自噬的發(fā)生和發(fā)展來控制AS斑塊的發(fā)展，最終達到治療動脈硬化的目的，還需進一步研究。

［1］Xu YL.Atherosclerosis-achronicinflammatory process［J］.Chin J Arterioscler（中國動脈硬化雜志），2001，9（2）：93-95.

［2］Wei DH，Jia XY，Liu YH，Guo FX，Tang ZH，Li XH，et al.Cathepsin L stimulates autophagy and inhibits apoptosis of ox-LDL-inducedendothelialcells：potential role in atherosclerosis［J］.Int J Mol Med，2013，31（2）：400-406.

［3］Kijanska M，Peter M.Atg1 kinase regulates early and late steps during autophagy［J］.Autophagy，2013，9（2）：249-251.

［4］Takahashi Y，Meyerkord CL，Hori T，Runkle K，F(xiàn)ox TE，Kester M，et al.Bif-1 regulates Atg9 trafficking by mediating the fission of Golgi membranes during autophagy［J］.Autophagy，2011，7（1）：61-73.

［5］Jaber N，Zong WX.ClassⅢPI3K Vps34：essential roles in autophagy，endocytosis，and heart and liver function［J］.Ann N Y Acad Sci，2013，1280：48-51.

［6］Shaid S，Brandts CH，Serve H，Dikic I.Ubiquitination and selective autophagy［J］.Cell Death Differ，2013，20（1）：21-30.

［7］Yang Z，Klionsky DJ.Eatenalive：a history of macroautophagy［J］.Nat Cell Biol，2010，12（9）：814-822.

［8］Majeski AE，Dice JF.Mechanisms of chaperonemediated autophagy［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36（12）：2435-2444.

［9］Zhu HM，Chen R，Xue F，ST YP，F(xiàn)an XF，Gong YS，et al.Effect of autophagy inhibitor chloroquine on the proliferation of PASMCs induced by hypoxia ［J］.Chin J Appl Physiol（中國應(yīng)用生理學(xué)雜志），2014，30（1）：8-12.

［10］Huang Y，Lu XW，Li WM，Zhang J，Jiang MR. Effect of hydrogen peroxide to vascular smooth muscular cells［J］.Chin J Exp Surg（中華實驗外科雜志），2004，21（4）：403-405.

［11］Kim AJ，Shi Y，Austin RC，Werstuck GH.Valproate protects cells from ER stress-induced lipid accumulation and apoptosis by inhibiting glycogen synthase kinase-3［J］.J Cell Sci，2005，118（Pt 1）：89-99.

［12］Jin S，White E.Role of autophagy in cancer：managementofmetabolicstress［J］.Autophagy，2007，3（1）：28-31.

［13］Bj?rk?y G，Lamark T，Pankiv S，?vervatn A，Brech A，Johansen T.Monitoring autophagic degradation of p62/SQSTM1［J］.Methods Enzymol，2009，452：181-197.

［14］Pattingre S，Espert L，Biard-Piechaczyk M，Codogno P. RegulationofmacroautophagybymTORand Beclin 1 complexes［J］.Biochimie，2008，90（2）：313-323.

［15］Paglin S，Lee NY，Nakar C，F(xiàn)itzgerald M，Plotkin J，Deuel B，et al.Rapamycin-sensitive pathway regulates mitochondrialmembranepotential， autophagy，and survival in irradiated MCF-7 cells［J］.Cancer Res，2005，65（23）：11061-11070.

［16］H?yer-Hansen M，Bastholm L，Szyniarowski P，Campanella M，Szabadkai G，F(xiàn)arkas T，et al. Control of macroautophagy by calcium，calmodulindependent kinase kinase-beta，and Bcl-2［J］.Mol Cell，2007，25（2）：193-205.

［17］Razani B，F(xiàn)eng C，Coleman T，Emanuel R，Wen H，Hwang S，et al.Autophagy links inflammasomes to atherosclerotic progression［J］.Cell Metab，2012，15（4）：534-544.

（本文編輯：喬 虹）

Autophagy and endoplasmic reticulum stress of primary vascular smooth muscle cells triggered by hydrogen peroxide

LI Song-yan1，GUO Min2，WANG Yan1，YU Yang1，LIU Shi-bing1，XU Ye1
（1.Medical Research Laboratory，2.The Affliated Hospital of Jilin Medical University，Jilin 132013，China）

OBJECTlVE To observe the effect of the autophagy and endoplasmic reticulum stress （ERS）in vascular smooth muscle cells（VSMCs）with hydrogen peroxide（H2O2）.METHODS The VSMCs were incubated with different concentrations of H2O2（50，100，200，400，600，800，1200 and 1600 μmol·L-1）for 12 and 24 h.The cell viability was determined by MTT assay.The cell morphology was observed under an inverted phase contrast microscope.The expression of autophagy related protein ubiquitin binding protein p62 and microtubule-associated protein light chain 3（LC3）was detected by indirect immunofluorescence.Western blotting was used to detect autophagy related protein human coiled-coil myosin-like BCL2-interacting protein（Beclin-1），LC3 and mammalian target of sirolimus Rapamycin（mTOR），as well as the expression of endoplasmic reticulum stress（ERS）related protein glucose regulated proteins 78 ku（GRP78）and C/EBP homologous protein（CHOP）.RESULTS MTT results showed that H2O2inhibited the growth of VSMCs cells.The half inhibitory concentration（IC50）was 597.2±2.3 and（447.4±1.7）μmol·L-1at 12 and 24 h，respectively.The results of the inverted phase contrast microscope showed that VSMCs in H2O2group shrinked and turned into smaller round cells. The cell survival rate declined from（97.5±0.1）%in normal control group to（74.4±1.0）%and（56.8± 0.9）%in H2O2400 μmol·L-1at 12 and 24 h，respectively.The results of the laser scanning confocal microscope showed that H2O2400 μmol·L-1increasedthe expressionof LC3andp62 protein in a cytoplasmic time-dependent manner，and increased the colocalization of LC3 and p62，especially at 8 h.The results of Western blotting demonstrated that H2O2increased the expression of ERS related protein GRP78 and CHOP，autophagy related protein Beclin-1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ（P＜0.01），and decreased mTOR（P＜0.01）in VSMCs.CONCLUSlON H2O2induces autophagy through ERS in VSMCs.

autophagy；vascular smooth muscle cells；hydrogen peroxide；endoplasmic reticulum stress

The project supported by Bureau of Education″Twelve-five″scientific and Technological Research Projects of Jilin Province（2013361）；and Youth Physician Research Program of Affiliated Hospital of Jilin Medical College（2014-3）

XU Ye，E-mail:xuye_9707@163.com

R966

A

1000-3002（2015）06-0899-06

吉林省教育廳十二五科學(xué)技術(shù)研究項目（吉教科合字［2013］第361號）；吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院青年醫(yī)師科研課題（院資［2014-3］號）

李松巖，男，碩士，助理實驗師，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：lisongyan888@163.com；徐 冶，男，教授，主要從事腫瘤化學(xué)藥物治療敏感性與耐藥研究。

徐 冶，E-mail：xuye_9707@163.com

（2015-05-21接受日期：2015-07-28）