藻源型溶解性有機(jī)氮的產(chǎn)生及不同時(shí)期藻類(lèi)有機(jī)物的特性

古 勵(lì),郭顯強(qiáng),丁昌龍,何 強(qiáng),單志?。?重慶大學(xué),三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400045；.中國(guó)海誠(chéng)工程科技股份有限公司,上海 0003）

藻源型溶解性有機(jī)氮的產(chǎn)生及不同時(shí)期藻類(lèi)有機(jī)物的特性

古 勵(lì)1*,郭顯強(qiáng)1,丁昌龍1,何 強(qiáng)1,單志俊2（1.重慶大學(xué),三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400045；2.中國(guó)海誠(chéng)工程科技股份有限公司,上海 200031）

研究了銅綠微囊藻藻細(xì)胞全生命周期中氮的轉(zhuǎn)化過(guò)程以及藻類(lèi)有機(jī)物的性質(zhì),結(jié)果表明：溶解性有機(jī)氮（DON）在藻類(lèi)生長(zhǎng)周期中總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì),藻細(xì)胞在其生長(zhǎng)初期釋放量小于 0.05mgDON/107cells,衰亡期釋放能力約為 0.40mgDON/107cells；胞外有機(jī)物（EOM）中分子量分布在對(duì)數(shù)期和衰亡期以＜1kDa和＞100kDa為主,穩(wěn)定期以＜30kDa為主；胞內(nèi)有機(jī)物（IOM）的分子量分布隨藻的生長(zhǎng)變化較小,集中在＜1kDa和＞100kDa范圍內(nèi).三維熒光光譜分析表明,EOM中熒光物質(zhì)主要為類(lèi)腐植酸和溶解性微生物代謝產(chǎn)物；而IOM主要由類(lèi)芳香蛋白和溶解性微生物代謝產(chǎn)物組成.

銅綠微囊藻；氮轉(zhuǎn)化；溶解性有機(jī)氮

水體富營(yíng)養(yǎng)化會(huì)導(dǎo)致藻細(xì)胞的大量繁殖,爆發(fā)藻華事件.藻的大量繁殖會(huì)釋放大量的代謝產(chǎn)物,對(duì)水處理過(guò)程造成干擾,如影響混凝效果［1-3］,加速膜污染［4］,生成消毒副產(chǎn)物［5-6］等,且干擾程度受藻類(lèi)代謝產(chǎn)物的性質(zhì)影響.藻類(lèi)有機(jī)物（AOM）由胞外有機(jī)物（EOM）和胞內(nèi)有機(jī)物（IOM）組成.EOM由藻細(xì)胞生長(zhǎng)代謝釋放形成,IOM多源自藻細(xì)胞破裂釋放出來(lái)的內(nèi)含物.通常認(rèn)為藻類(lèi)有機(jī)物包含低聚糖類(lèi)物質(zhì)、多糖、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸以及少量的有機(jī)酸,其中蛋白質(zhì)、多肽、氨酸均為典型的有機(jī)氮類(lèi)物質(zhì)（DON）［1,5-8］.

DON是水中含氮有機(jī)物的總稱(chēng),是水中溶解性有機(jī)物（DOM）的重要組成部分,是含氮消毒副產(chǎn)物的重要前體物［9-10］.在氯（胺）消毒過(guò)程中,DON中的某些組分可以與消毒劑發(fā)生反應(yīng)生成比含碳消毒副產(chǎn)物（C-DBPs）毒性更高的含氮消毒副產(chǎn)物（N-DBPs）,如鹵乙酰胺（HAcAms）、鹵代硝基甲烷（HNMs）、鹵乙腈（HANs）等［11-12］.有研究表明［13-14］,含氮消毒副產(chǎn)物的生成特性不僅與DON的濃度水平有關(guān),其理化性質(zhì)對(duì)其生成特性也有很重要的影響.

藻類(lèi)有機(jī)物因其藻所處生長(zhǎng)周期、環(huán)境及藻種類(lèi)差異呈現(xiàn)出不同的性質(zhì)［2,8,15］,在研究藻源型消毒副產(chǎn)物時(shí),學(xué)者多以對(duì)數(shù)期或者穩(wěn)定期的藻類(lèi)為對(duì)象,分析該階段藻類(lèi)有機(jī)物性質(zhì)及消毒副產(chǎn)物的生成特性,缺乏對(duì)不同生長(zhǎng)周期藻的藻類(lèi)有機(jī)物性質(zhì)的系統(tǒng)分析.而水處理過(guò)程中消毒副產(chǎn)物的生成量與藻類(lèi)有機(jī)物的性質(zhì)密切相關(guān).基于此,本文選擇銅綠微囊藻為典型代表,研究藻類(lèi)全生命周期中的氮的轉(zhuǎn)化過(guò)程以及DON的產(chǎn)生及變化規(guī)律,對(duì)不同生長(zhǎng)階段藻的AOM的性質(zhì)進(jìn)行分析比較,以期為藻華爆發(fā)水體中氮元素的轉(zhuǎn)化規(guī)律,以及高藻水處理過(guò)程中含氮消毒副產(chǎn)物前體物的控制提供參考.

1　材料與方法

1.1藻的培養(yǎng)

銅 綠 微 囊 藻 （Microcystis aeruginosa, FACHB-905）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所.采用序批式培養(yǎng),向裝有750mL培養(yǎng)基的1L三角瓶中接種少量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期純?cè)宸N,置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),期間不再補(bǔ)充培養(yǎng)液,培養(yǎng)基采用BG-11培養(yǎng)基.恒溫培養(yǎng)箱中光照強(qiáng)度為1500～2000lx,溫度為（25±1）℃,光暗比為 12h/12h.藻密度采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù).

1.2藻類(lèi)有機(jī)物的分離

EOM 采用藻類(lèi)懸浮液離心法,選取藻類(lèi)懸濁液,離心機(jī)（TDL-4A,菲恰爾）4000r/min,離心20min,取上清液過(guò)濾,濾出液即為 EOM.向離心管中加入等體積的超純水,將沉淀于離心管底部的藻重新混合均勻,置于離心機(jī)按照 EOM分離步驟清洗3次,確保不含 EOM,然后采用凍融法反復(fù)凍融 3次,顯微鏡下觀察藻細(xì)胞數(shù)目,確保80%以上的藻細(xì)胞被破壞釋放 IOM,最后用濾膜過(guò)濾獲取IOM.

1.3測(cè)試方法

溶解性有機(jī)碳（DOC）采用 TOC測(cè)試儀（TOC-VCPH,島津,日本）測(cè)定；UV254采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（DR5000,HACH,美國(guó)）測(cè)定；分別采用紫外分光光度法、N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法以及納氏試劑分光光度法測(cè)試 NO3--N、NO2--N和NH4+-N,采用堿性-過(guò)硫酸鉀消解分光光度法測(cè)定TN［16］,DON的質(zhì)量濃度采用總氮減去無(wú)機(jī)氮的差減法獲得,其分析誤差為T(mén)N、NO3--N、NO2--N、NH4+-N的方差總和［16-17］.

采用超濾法進(jìn)行分子量切割,過(guò)濾方式為平行過(guò)濾［18-20］,超濾膜的孔徑分別為 100,30,10,5, 1K；三維熒光光譜（3DEEM）采用熒光分光光度計(jì)（F-7000,Hitachi,日本）,參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波波長(zhǎng)掃描范圍為 200～550nm,發(fā)射波波長(zhǎng)掃描范圍為220～650nm,掃描間隔均為5nm,狹縫寬度為5nm,光電倍增管（PMT）電壓為 600V,掃描速度為60000nm/min,響應(yīng)時(shí)間為0.002s.EEM譜圖均扣除超純水空白,運(yùn)用origin 8.5.1繪制三維熒光光譜譜圖.熒光區(qū)域積分定量分析前將瑞利散射上方的數(shù)據(jù)置為零,消除瑞利散射的影響；以超純水做空白參比,消除拉曼散射影響［21-24］.

2　結(jié)果與討論

2.1藻細(xì)胞的生長(zhǎng)周期的確定

實(shí)驗(yàn)條件下銅綠微囊藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖1所示,其生長(zhǎng)周期可被劃分為 4個(gè)階段,即適應(yīng)期0～5d,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期6～33d,穩(wěn)定生長(zhǎng)期34～131d,衰亡期＞132d.適應(yīng)期藻類(lèi)數(shù)量沒(méi)有明顯變化；在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,藻密度急劇增長(zhǎng),此階段藻生長(zhǎng)代謝旺盛；進(jìn)入穩(wěn)定期后,藻密度在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持在一定濃度水平,持續(xù) 90多天,此階段部分藻細(xì)胞增殖-衰敗交互生長(zhǎng),藻細(xì)胞數(shù)目基本穩(wěn)定,但胞內(nèi)有機(jī)物釋放至胞外造成會(huì)大量胞外有機(jī)物的積累；衰亡期,藻細(xì)胞衰敗速率加快,增殖速率放緩,藻密度逐漸減小,藻液由暗綠色變?yōu)辄S綠色,繼而變?yōu)辄S色,最終成為白色.此外,藻液由黃綠色變?yōu)榈S色的過(guò)程持續(xù)時(shí)間僅為幾天.

Yang等［15］通過(guò)胞外有機(jī)物的TOC、藻細(xì)胞的TOC以及藻密度3個(gè)指標(biāo)繪制了銅綠微囊藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn),確定適應(yīng)期0～3d,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4～22d,又是穩(wěn)定期持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),穩(wěn)定期與衰亡期的界限沒(méi)有得出.Pivokonsky等［1］以葉綠素a以及EOM 的 DOC繪制了銅綠微囊藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn),通過(guò)葉綠素a的監(jiān)測(cè)確定適應(yīng)期為0～2d,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為3～6d,穩(wěn)定生長(zhǎng)期為 7～16d,16d便進(jìn)入衰亡期；EOM中DOC呈現(xiàn)相對(duì)一致的趨勢(shì),適應(yīng)期DOC增長(zhǎng)緩慢,對(duì)數(shù)期由于代謝旺盛增速加快,穩(wěn)定期呈現(xiàn)緩慢的增長(zhǎng),衰亡期 DOC迅速增大.本實(shí)驗(yàn)所得銅綠微囊藻生長(zhǎng)周期相對(duì)較長(zhǎng),與吳劍、方晶云等［25-26］所得生長(zhǎng)曲線(xiàn)較為一致,不同學(xué)者得出的藻生長(zhǎng)曲線(xiàn)存在較大的差異與所用的培養(yǎng)基及接種量的不同等因素直接相關(guān).

圖1　銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.4　The growth curve for Microcystis aeruginous cultivated in batch

2.2生長(zhǎng)周期中氮的轉(zhuǎn)化

2.2.1無(wú)機(jī)氮 由圖2可以看出,NO3--N在整個(gè)生長(zhǎng)周期中持續(xù)下降,NO2--N和NH4+-N呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),這與吳劍等［25］研究結(jié)論相似.適應(yīng)期,并未出現(xiàn)藻的大量增殖對(duì) NO3--N進(jìn)行消耗；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,藻細(xì)胞迅速增殖值,大量的營(yíng)養(yǎng)元素被利用,NO3--N濃度幾乎呈線(xiàn)性降低；穩(wěn)定生長(zhǎng)期初期,藻細(xì)胞仍保持著較高的活性,且藻細(xì)胞的體積較之前有所增加,部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被藻細(xì)胞作為能量?jī)?chǔ)存在體內(nèi),穩(wěn)定生長(zhǎng)期亦存在藻細(xì)胞的衰敗,其衰敗速率隨著藻的生長(zhǎng)逐漸增大,初期衰敗速率增長(zhǎng)緩慢,NO3--N被消耗的速率遠(yuǎn)大于衰敗釋放質(zhì)環(huán)境中的速度,NO3--N下降速率依然較大；穩(wěn)定期中后期,衰敗速率與增長(zhǎng)速率持平,藻密度呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài),NO3--N下降速率減緩；進(jìn)入衰亡期,初期NO3--N濃度仍有所降低,至末期NO3--N略有上升,可能的原因是：末期藻密度減小,活性降低,光合作用產(chǎn)生的氧氣很少,胞內(nèi)物質(zhì)隨著藻細(xì)胞大量衰敗釋放到水體,DON存在少量分解,從而導(dǎo)致NO3--N略微上升.

圖2　銅綠微囊藻EOM中不同氮形態(tài)質(zhì)量濃度變化曲線(xiàn)Fig.4　Transformation for different nitrogen during the growth of Microcystis aeruginous

NO2--N濃度隨著藻密度的增加,呈現(xiàn)先增大隨后略微降低的趨勢(shì),但均在10mg/L以?xún)?nèi),相對(duì)于NO3--N變化微弱.關(guān)于NO2--N的變化趨勢(shì),可能存在以下兩方面原因：（1）NO3--N被藻細(xì)胞吸收過(guò)程中首先被硝酸還原酶還原成亞硝酸鹽,然后通過(guò)亞硝酸鹽還原酶和谷氨酸合成酶最后合成胞內(nèi)有機(jī)物質(zhì),硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮均可以作為藻的碳源被利用,但當(dāng)細(xì)胞活性降低時(shí),部分亞硝酸鹽隨藻代謝產(chǎn)物被釋放到胞外［27］；（2）銅綠微囊藻在光照條件下光合作用產(chǎn)生氧氣,黑暗條件下呼吸作用耗氧造成氧化還原電位較低,可能存在自養(yǎng)反硝化作用,產(chǎn)生中間產(chǎn)物 NO2--N釋放至胞外［25］.NH4+-N呈現(xiàn)緩慢的上升趨勢(shì),但最高濃度小于10mg/L.藻細(xì)胞內(nèi)及釋放至胞外的有機(jī)氮可能被藻細(xì)胞利用或部分分解,產(chǎn)生了中間產(chǎn)物 NH4+-N,隨著有機(jī)氮的累積,中間產(chǎn)物NH4+-N濃度也逐漸增加.

2.2.2總氮及有機(jī)氮 如圖2所示,藻液中的總氮濃度在適應(yīng)生長(zhǎng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以及穩(wěn)定生長(zhǎng)期與NO3--N的變化趨勢(shì)一致,但在衰亡期,由于藻細(xì)胞的大量衰敗致使藻細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的含氮有機(jī)物釋放至胞外環(huán)境中,使得 TN濃度呈現(xiàn)較明顯的上升趨勢(shì).對(duì)于 DON,適應(yīng)生長(zhǎng)期幾乎沒(méi)有釋放；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞代謝旺盛,且少有藻細(xì)胞的衰敗,因此僅有少量DON的釋放；穩(wěn)定生長(zhǎng)期初期 DON的濃度上升速度依然緩慢,進(jìn)入穩(wěn)定期中后期 DON濃度上升速度明顯加快,可能的原因是：穩(wěn)定期初期,藻細(xì)胞衰敗數(shù)量較少,隨著培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗殆盡,藻細(xì)胞死亡數(shù)量增加,致使含氮豐富的內(nèi)含物（如氨基酸、藻青蛋白、脂肪胺等）釋放進(jìn)入環(huán)境中,DON濃度迅速增加；衰亡期,藻細(xì)胞衰亡速度進(jìn)一步加快,更多的胞內(nèi)有機(jī)物釋放,DON出現(xiàn)累積.

圖3　單位藻細(xì)胞（107cells）產(chǎn)生的DON隨生長(zhǎng)周期的變化Fig.4　DON mass concentration per 107cells during the growth period

胞內(nèi)物質(zhì)的釋放使得EOM中有機(jī)物濃度升高,可能會(huì)對(duì)混凝起到抑制作用,難以去除［1,3］.此外,研究表明 DON的濃度與含氮消毒副產(chǎn)物呈一定正相關(guān)［28］,而穩(wěn)定期中后期以及衰亡期EOM中的DON濃度非常高,最高接近100mg/L,因此當(dāng)水源水爆發(fā)藻華時(shí),應(yīng)該特別注意對(duì)藻EOM 性質(zhì)進(jìn)行表征,根據(jù)水質(zhì)情況慎重選擇應(yīng)急處理措施,避免消毒中N-DBPs產(chǎn)率過(guò)高引發(fā)用水安全風(fēng)險(xiǎn).

從圖 3可看出,處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以及穩(wěn)定生長(zhǎng)期的銅綠微囊藻釋放 DON的能力小于0.05mg/107cells,進(jìn)入衰亡期藻細(xì)胞釋放 DON的能力急劇上升,升至 0.4mg/107cells,盡管這主要是由于藻細(xì)胞EOM中DON的積累以及藻密度的逐漸減小所致,但以上數(shù)據(jù)提供了藻華爆發(fā)期間液相 DON濃度的基本參考,可通過(guò)藻細(xì)胞的數(shù)量,初步了解所釋放含氮有機(jī)物的數(shù)量.

2.3不同生長(zhǎng)周期的藻類(lèi)有機(jī)物性質(zhì)表征

2.3.1不同生長(zhǎng)周期基本水質(zhì)參數(shù)的變化 從表 1可以看出,AOM在各個(gè)時(shí)期的特征紫外吸光度值（SUVA值）均較低,為0.87～2.34L/（m?mg）. SUVA值與物質(zhì)的芳香度以及疏水性物質(zhì)的數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系［29］,SUVA值低表明AOM的芳香性較低以及親水性有機(jī)物含量較高.另一方面,SUVA值低還表明藻類(lèi)有機(jī)物中腐植酸和富里酸類(lèi)物質(zhì)、高分子質(zhì)量有機(jī)物、不飽和雙鍵及芳香族類(lèi)有機(jī)物含量少,不易被混凝沉淀工藝去除［30］.IOM的SUVA值隨著藻細(xì)胞生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)逐漸增大,由0.87增至1.79,最終高達(dá)2.34,說(shuō)明IOM隨著藻的生長(zhǎng),其芳香性、疏水性物質(zhì)逐漸增加；EOM 的 SUVA值為 0.88～1.34L/ （m?mg）,隨生長(zhǎng)周期不同變化較小,表明EOM中親水性物質(zhì)較多,不易被去除.IOM中DOC/DON質(zhì)量濃度比可以看出,穩(wěn)定期的 IOM中含有的有機(jī)氮成分最高,而對(duì)數(shù)期的 IOM中有機(jī)氮成分比例最低,衰亡期的 IOM中有機(jī)氮可能作為能量物質(zhì)被藻細(xì)胞消耗,致使比例相對(duì)較低.可能的原因：對(duì)數(shù)期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足,藻細(xì)胞增殖速度快,儲(chǔ)存的能量物質(zhì)較少,穩(wěn)定期出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng),蛋白質(zhì)作為藍(lán)藻的重要的儲(chǔ)能物質(zhì)貯存于胞內(nèi)［1］,表現(xiàn)為有機(jī)氮組分的增加,而衰亡期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)嚴(yán)重缺乏,胞內(nèi)能源物質(zhì)被藻細(xì)胞消耗,DON/DOC下降.

表1　不同生長(zhǎng)周期的EOM/IOM的基本水質(zhì)參數(shù)Table 1　Characteristics of EOM/IOM extracted from different growth phases

2.3.2不同時(shí)期藻類(lèi)有機(jī)物分子量分布特性如圖4所示,3個(gè)時(shí)期IOM分子量分布均為雙峰型,主要集中在＜1kDa的和＞100kDa兩個(gè)范圍內(nèi).對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定生長(zhǎng)期、衰亡期的銅綠微囊藻的IOM的分子量在＜1kDa和＞100kDa的范圍內(nèi)所占的比例分別為16%、25%、44%和76%、61%、54%,表明隨著藻細(xì)胞的生長(zhǎng),藻細(xì)胞內(nèi)含物中小分子有機(jī)物所占的比重在增加,大分子的物質(zhì)所占的比重減小.IOM中小于1kDa的物質(zhì)包括葉綠素、藻毒素、嗅味化合物、氨基酸等,大于100kDa的有機(jī)物主要包含藻藍(lán)蛋白和碳水化合物等［31］.出現(xiàn)上述情況可能的原因：環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)元素逐漸減少,藻細(xì)胞之間對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)逐漸增強(qiáng),使得穩(wěn)定期儲(chǔ)存的部分胞內(nèi)物質(zhì)被藻細(xì)胞自身降解利用轉(zhuǎn)化為小分子有機(jī)物［1］.

相比之下,EOM的分子量分布在對(duì)數(shù)期和衰亡期大致相同,分子量分布集中在＜1kDa和＞100kDa 2個(gè)區(qū)域,其中對(duì)數(shù)期兩個(gè)分子量區(qū)域所占的比例為41%、45%,衰亡期為24%和58%.穩(wěn)定生長(zhǎng)期EOM的分子量分布與對(duì)數(shù)期和衰亡期存在較大差異,主要集中在＜30kDa的范圍內(nèi)（約占 EOM 的 93%）,其中＜1kDa、1～5kDa、5～10kDa、10～30kDa的EOM所占總EOM的比例分別為24%、26%、31%、12%.實(shí)驗(yàn)中所取對(duì)數(shù)期藻處于對(duì)數(shù)期后期,因此 EOM分子量分布情況與 Henderson［8］研究的穩(wěn)定生長(zhǎng)期初期的EOM分子量分布較為相似.衰亡期EOM中大分子有機(jī)物的增加主要是由細(xì)胞死亡裂解后釋放出大量大分子胞內(nèi)有機(jī)物造成的.

圖4　不同生長(zhǎng)周期的藻類(lèi)有機(jī)物分子量分布Fig.4　Transformation of MW fractions of AOM under different growth stages

由圖5可以看出,對(duì)數(shù)期與衰亡期的EOM和IOM的分子量分布相似,穩(wěn)定期的EOM和IOM分子量分布有較大差異.分析其原因可能是：對(duì)數(shù)期的藻細(xì)胞所處環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足,且代謝旺盛,使得藻細(xì)胞胞內(nèi)胞外有機(jī)物性質(zhì)相似；而穩(wěn)定期有內(nèi)含物的釋放,同時(shí)新的藻細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)內(nèi)含物進(jìn)行利用和代謝,從而使得大分子細(xì)胞降解,形成1～100kDa的中等分子量結(jié)構(gòu)的有機(jī)物；衰亡期,藻細(xì)胞的衰亡破裂向EOM中釋放大量胞內(nèi)物質(zhì),致使衰亡期的IOM和EOM分子量分布相似.

2.3.3不同生長(zhǎng)周期藻類(lèi)有機(jī)物三維熒光表征 相比其他表征方法,三維熒光光譜的選擇性更強(qiáng)以及靈敏度更高,并且操作簡(jiǎn)單,被廣泛用于有機(jī)物性質(zhì)的表征過(guò)程.根據(jù) Chen等［21］的研究,將熒光區(qū)域劃分為5個(gè)區(qū)域：區(qū)域I和II（芳香蛋白類(lèi),λex＜250nm, λem＜380nm）,區(qū)域 III（富里酸類(lèi),λex＜250nm, λem＞380nm）,區(qū)域 IV（溶解性微生物代謝物類(lèi),λex＞250nm, λem＜380nm）及區(qū)域V（腐殖酸類(lèi),λex＞250nm, λem＞380nm）.區(qū)域I、II 和IV代表有機(jī)氮類(lèi)物質(zhì),區(qū)域III和V代表有機(jī)碳化合物［26］.

圖5　不同生長(zhǎng)周期的藻類(lèi)有機(jī)物分子量分布對(duì)比Fig.4　Molecular weight （MW） distributions of AOM under different phases

如圖6所示,EOM熒光特征峰主要集中在區(qū)域 IV和 V,且區(qū)域 IV所在的峰強(qiáng)度更大,表明EOM 中含有大量的腐植酸類(lèi)物質(zhì)和溶解性微生物代謝產(chǎn)物.溶解性微生物代謝產(chǎn)物（SMPs）由酪氨酸、色氨酸、蛋白類(lèi)等富含有機(jī)氮的物質(zhì)組成,因此 EOM中有機(jī)氮類(lèi)物質(zhì)占較大比重,這與 Li等［6］研究一致.區(qū)域 IV內(nèi)的熒光峰位置隨著生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生偏移,峰強(qiáng)有所增加（表2）,這主要是由微生物代謝產(chǎn)物的累積所造成的.區(qū)域V內(nèi)的熒光峰位置隨著生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)發(fā)生了偏移,表明EOM中腐植酸類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化.相比之下,藻類(lèi)IOM隨著生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng),熒光峰有較大的變化.如圖6所示,d、e、f分別代表對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的IOM的三維熒光光譜譜圖,IOM中熒光物質(zhì)主要集中在類(lèi)蛋白物質(zhì)和溶解性微生物代謝產(chǎn)物兩個(gè)富含有機(jī)氮的區(qū)域內(nèi),主要包括芳香蛋白類(lèi)物質(zhì)、酪氨酸、色氨酸、蛋白類(lèi)化合物等,表明IOM中的有機(jī)物以有機(jī)氮類(lèi)化合物為主,這與王昊等［32］研究結(jié)果相似.另外兩個(gè)比較明顯的峰出現(xiàn)在區(qū)域III和V,這兩個(gè)區(qū)域代表有機(jī)碳類(lèi)化合物.隨著藻生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng),熒光峰（Ex/Em,275～280/330nm）和（Ex/Em,225/ 330～335nm）峰強(qiáng)逐漸減小,可能的原因是：穩(wěn)定期和衰亡期的藻細(xì)胞,尤其是在衰亡期,由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少,藻細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)激烈,致使胞內(nèi)蛋白類(lèi)儲(chǔ)能物質(zhì)被消耗分解為腐植酸和富里酸等物質(zhì)［33］.

為進(jìn)一步分析不同生長(zhǎng)周期 AOM中藻類(lèi)有機(jī)物的熒光物質(zhì)組成,對(duì)不同時(shí)期的藻類(lèi)有機(jī)物的熒光光譜進(jìn)行了熒光區(qū)域積分,并且將積分結(jié)果轉(zhuǎn)化為單位 DOC時(shí)對(duì)應(yīng)的值,降低濃度不同帶來(lái)的差異,結(jié)果見(jiàn)表3.各個(gè)區(qū)域單位DOC質(zhì)量濃度下熒光體積占五個(gè)熒光區(qū)域總體積的百分比（Pi）如圖7.可以看出,對(duì)數(shù)期、衰亡期的IOM中的單位 DOC質(zhì)量濃度中含有的熒光物質(zhì)較EOM要多.穩(wěn)定期的EOM中單位DOC質(zhì)量濃度中含有的熒光物質(zhì)比例較IOM中高.從圖7可以看出,EOM中熒光物質(zhì)主要集中在熒光區(qū)域?yàn)镮V和V,對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期EOM中區(qū)域?yàn)镮V和V的Pi分別為50%和42%、19%和73%、38%和54%；對(duì)數(shù)期與穩(wěn)定期的IOM中含有較大比重的蛋白類(lèi)（區(qū)域I與II）熒光物質(zhì),而衰亡期中蛋白類(lèi)熒光物質(zhì)Pi減小,與之相對(duì)應(yīng)的是腐植酸類(lèi)物質(zhì)（區(qū)域 V）的急劇增加.出現(xiàn)上述結(jié)果可能的原因：穩(wěn)定期的藻儲(chǔ)存蛋白類(lèi)物質(zhì)作為能源物質(zhì),因此IOM中富含有機(jī)氮的熒光區(qū)域（區(qū)域 I、II與 IV）所占比重為整個(gè)生命周期中最大的；衰亡期作為儲(chǔ)能物質(zhì)的蛋白質(zhì)被利用分解為富里酸、胡敏酸等有機(jī)物,因此出現(xiàn)了有機(jī)氮熒光區(qū)域所占比例的減小以及類(lèi)腐殖酸和富里酸這類(lèi)有機(jī)碳物質(zhì)熒光區(qū)域比重的增加.

圖6　不同生長(zhǎng)周期AOM的EEM譜圖Fig.4　Fluorescence EEMs of AOM under different phases

表2　不同樣品的EEM特征峰峰強(qiáng)Table 1　Fluorescence spectral parameters of different samples

表3　不同時(shí)期AOM的單位DOC質(zhì)量濃度的區(qū)域熒光體積Table 1　Excitation-emission area volumes per DOC mass concentration in specific regions of AOM during different growth phases

圖7　不同時(shí)期AOM （EOM/IOM）的EEM光譜Pi百分比分布Fig.4　Pi （%） distributions in EEM spectra of AOM （EOM/IOM） under different growth phases

3　結(jié)論

3.1微囊藻生長(zhǎng)過(guò)程中,水體中 TN存在下降,說(shuō)明藻華爆發(fā)過(guò)程存在一定脫氮作用.

3.2進(jìn)入穩(wěn)定期后期,藻細(xì)胞衰亡速率增大,釋放大量有機(jī)氮內(nèi)含物,液相中 DON濃度急劇升高；生長(zhǎng)初期藻細(xì)胞 DON的釋放能力小于0.05mg/107cells,衰亡期釋放能力約為 0.40mg/ 107cells.

3.3對(duì)數(shù)期和衰亡期的藻 EOM 分子量呈雙峰分布,穩(wěn)定期的EOM以小分子有機(jī)物為主；IOM在整個(gè)生長(zhǎng)周期中分子量均呈現(xiàn)雙峰分布,主要集中在＜1kDa和＞100kDa內(nèi),隨藻的生長(zhǎng)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)逐漸被分解為小分子物質(zhì).

3.4EOM中熒光物質(zhì)種類(lèi)在整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)變化較小,主要為腐植酸類(lèi)物質(zhì)和溶解性微生物代謝產(chǎn)物,熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)略有變化；IOM中熒光物質(zhì)主要為芳香蛋白類(lèi)和溶解性微生物代謝產(chǎn)物,穩(wěn)定期藻的IOM中有機(jī)氮類(lèi)物質(zhì)所占比重最大.

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Formation of algae-derived DON and characterization of algae organic matter （AOM） from different stages.

GU Li1*, GUO Xian-qiang1, DING Chang-long1, HE Qiang1, SHAN Zhi-jun2（1.Key Laboratory of Eco-Environment of Three Gorges Region of Ministry of Education, Chongqing University, Chongqing 400045, China；2.China Haisum Engineering Co. Ltd., Shanghai 200031, China）.

China Environmental Science, 2015,35（9）：2745～2753

Formation rules of dissolved organic nitrogen （DON）, as well as characteristics of extracellular oganic matter （EOM） & intracellular organic matter （IOM） during the growth of Microcystis aeruginous have been studied. The results show as follows： DON concentration of EOM shows a growing tendency during the growth of Microcystis aeruginous, the yield of which is less than 0.05mg DON per 107cells in the early growth phase, around 0.40mg DON per 107cells in the late growth phase, respectively； molecular weight distributions of EOM during exponential phase and decline phase mainly concentrate in range of less than 1kDa and more than 100kDa, while organic matter less than 30kDa dominating EOM in stationary phase；molecular weight distributions of IOM concentrate in range of more than 1kDa and less than 100kDa in the three phases. The main fluorescence regions of EOM occur at the fluorescence region of humic acid-like materials and soluble microbial products. By contrast, the region of aromatic proteins and soluble microbial products dominate the main region of EEM spectra of IOM.

Microcystis aeruginous；transformation of nitrogen forms；dissolved organic nitrogen （DON）

X524

A

1000-6923（2015）09-2745-09

2015-01-22

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（51208531）

*責(zé)任作者, 副教授, guli@cqu.edu.cn

古 勵(lì)（1982-）,男,副教授,研究方向?yàn)榘踩嬘盟|(zhì)保障理論與技術(shù),城市固廢處理處置及資源化技術(shù)研究.發(fā)表論文20余篇.