二代測序技術(shù)及其在法醫(yī)遺傳學(xué)中的應(yīng)用

王 樂，葉 健，白 雪，楊 帆，趙興春

（公安部物證鑒定中心 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點實驗室 北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術(shù)研究中心，北京 100038）

二代測序技術(shù)及其在法醫(yī)遺傳學(xué)中的應(yīng)用

王 樂，葉 健，白 雪，楊 帆，趙興春*

（公安部物證鑒定中心 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點實驗室 北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術(shù)研究中心，北京 100038）

從DNA指紋圖譜到STR復(fù)合擴增檢驗，30年來法醫(yī)DNA工作者目睹著技術(shù)的深刻變革以及在此推動下案件偵查模式的巨大轉(zhuǎn)變。自從二代測序技術(shù)問世以來，遺傳學(xué)的研究方式已發(fā)生了巨大轉(zhuǎn)變。但是相比其在癌癥和遺傳病診斷、基因組從頭測序和重測序、轉(zhuǎn)錄組重測序、藥物研制等領(lǐng)域的應(yīng)用，二代測序在法庭科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用尚處于起步階段。本文介紹二代測序的基本概念、發(fā)展歷史和工作原理，綜述了二代測序技術(shù)在STR分型、SNP分型、線粒體全基因組測序等幾個重點領(lǐng)域近兩年的最近動態(tài)，最后結(jié)合二代測序在法庭科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用展望提出可能遇到的挑戰(zhàn)，希冀對相關(guān)研究和實踐提供參考。

法醫(yī)遺傳學(xué)；二代測序；短串聯(lián)重復(fù)序列；單核苷酸多態(tài)性；線粒體全基因組測序

自從二代測序（second generation sequencing，SGS）技術(shù)和平臺問世以來，遺傳學(xué)的研究方式已發(fā)生了巨大轉(zhuǎn)變。如今，每周都有基因組數(shù)據(jù)發(fā)表，測序速度越來越快，測序成本越來越低。在過去十年間，二代測序的方法和平臺變得日趨完善，數(shù)據(jù)準確性顯著提升，并開始運用于人類臨床診斷。法醫(yī)遺傳學(xué)領(lǐng)域也開始關(guān)注二代測序，在科技論文發(fā)表和學(xué)術(shù)會議報告方面，二代測序相關(guān)成果數(shù)量呈現(xiàn)爆發(fā)式增長，這些成果為解決刑事案件提供新的可能性。運用二代測序技術(shù)，基于一次實驗、一份微量生物樣本檢材就可以同時獲得短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性（short tandem repeat，STR）、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入缺失多態(tài)性（insertion/deletion polymorphism，Indel）、mRNA等各種類型的大量的遺傳標(biāo)記信息，這是現(xiàn)有PCR-CE （PCR-capillary electrophoresis）平臺所無法做到的。運用二代測序技術(shù)，STR等位基因間精細的序列差異得以彰顯，未知的稀有STR等位基因得以被發(fā)現(xiàn)，這些詳細的序列信息有可能輔助混合樣本的數(shù)據(jù)解析。本文將簡單介紹二代測序的基本概念、發(fā)展歷史、工作原理，并對其在STR分型、SNP分型、線粒體全基因組測序領(lǐng)域的最新進展進行綜述。

1 一代測序與二代測序

1980年，英國生物化學(xué)家Frederick Sanger與美國生物化學(xué)家Walter Gilbert因建立DNA測序技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎。在Sanger測序中，核苷酸擴增從某一固定堿基開始，通過摻入雙脫氧核苷酸在隨機堿基終止，通過A、T、C、G四種雙脫氧核苷酸分別標(biāo)記著不同顏色的熒光基團，判定DNA序列每個堿基位置的核苷酸種類［1］。由于Sanger測序巧妙地引入了雙脫氧核苷酸，該方法也被稱為雙脫氧鏈終止法。二代測序技術(shù)出現(xiàn)后，為了便于區(qū)分，以Sanger測序為代表的DNA測序方法被稱為一代測序。Sanger測序被譽為生物化學(xué)領(lǐng)域最偉大的發(fā)明之一，壟斷DNA測序行業(yè)三十年，為生物科技的迅猛發(fā)展奠定了堅實的基礎(chǔ)，至今仍是DNA測序的主流技術(shù)。

二代測序，也叫下一代測序（next generation sequencing，NGS）或大規(guī)模平行測序（massively parallel sequencing，MPS），它不是DNA測序的一種方法，而是具有共同本質(zhì)屬性的一類方法，這個共同的本質(zhì)屬性是“大規(guī)模平行”，這也正是二代測序區(qū)別于一代測序的關(guān)鍵所在。無論一代測序或是二代測序，其實驗結(jié)果都是由A、T、C、G 4種核苷酸組成的DNA序列。二代測序?qū)嶒炦^程大體可分為樣本準備、文庫構(gòu)建、測序反應(yīng)和數(shù)據(jù)分析四個步驟。各公司提供的二代測序平臺在測序原理方面千差萬別，但基本都體現(xiàn)以上實驗步驟。

2 二代測序的發(fā)展歷史和工作原理

二代測序技術(shù)的發(fā)展進程是新型二代測序平臺不斷涌現(xiàn)、速度不斷提升、成本不斷降低的過程。以下就幾款較為經(jīng)典的二代測序平臺簡要介紹其工作原理。

2.1 454/Roche GS FLX系統(tǒng)

2004年，454生命科學(xué)公司（2007年被Roche公司收購）生產(chǎn)了商品化二代測序儀—基因組測序儀20 （GS 20）［2］。2006年12月，推出新款二代測序儀—基因組測序儀FLX （GS FLX）［3-5］。GS FLX系統(tǒng)首先將基因組DNA打碎成300～800 bp片段，在單鏈DNA的3’和5’端分別連上不同的接頭，每條帶有接頭的單鏈DNA被固定在一顆磁珠上，隨后擴增試劑將磁珠乳化，形成油包水的混合物，即形成許多個只包含一個磁珠和一個獨特片段的微反應(yīng)器。每個片段在自己的微反應(yīng)器里進行獨立擴增，擴增產(chǎn)物仍然結(jié)合在磁珠上。緊接著，攜帶DNA的磁珠被放入PTP板中進行測序，板上小孔的直徑?jīng)Q定了每個小孔只能容納一顆磁珠，四種堿基依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進入PTP板，每次只進入一個堿基，如果發(fā)生堿基配對，就會釋放出一個焦磷酸，這個焦磷酸在酶的作用下轉(zhuǎn)化為光信號，并實時地被CCD捕獲，由此可以準確、快速的確定待測模板的堿基序列。454系統(tǒng)是二代測序技術(shù)的代表性平臺，雖已宣布停產(chǎn)，但時至今日基于該系統(tǒng)的研究成果仍在不斷涌現(xiàn)。

2.2 Solexa系統(tǒng)

2006年，Illumina公司收購Solexa公司，于2007年推出二代測序儀Illumina genome analyzer［6-8］。Solexa系統(tǒng)的核心思想是邊合成邊測序。首先將基因組DNA打碎成100～200 bp的小片段，在小片段兩端加上接頭，單鏈DNA片段的一端通過接頭與芯片表面的引物堿基互補而被固定，另一端隨機和附近的另外一個引物互補，形成橋狀結(jié)構(gòu)。擴增后，DNA單分子成為單克隆的DNA簇。合成反應(yīng)中，加入DNA聚合酶、熒光標(biāo)記脫氧核糖核苷三磷酸（deoxynucleotide triphosphate， dNTP）和接頭引物進行擴增，在DNA簇延伸互補鏈時，每加入一個熒光標(biāo)記dNTP就能釋放出相應(yīng)熒光，測序儀通過捕獲熒光信號即可獲得待測片段的序列信息。

2.3 SOLiDTM系統(tǒng)

2007年，ABI公司推出二代測序平臺—SOLiDTM系統(tǒng)［9］。SOLiDTM是“通過寡核苷酸連接和檢測測序（sequencing by oligonucleotide ligation and detection）”的英文縮寫，與GS FLX系統(tǒng)和Solexa系統(tǒng)不同，SOLiDTM系統(tǒng)采用的不是合成法測序，而是連接法測序。完成文庫構(gòu)建后，SOLiDTM系統(tǒng)采用與454技術(shù)類似的乳液PCR對短片段進行擴增，擴增產(chǎn)物同樣固定于磁珠表面，磁珠共價結(jié)合于玻片上。SOLiDTM系統(tǒng)的獨特之處在于使用DNA連接酶和熒光標(biāo)記寡核苷酸探針（8個堿基）實現(xiàn)測序反應(yīng)，并通過“雙堿基編碼”系統(tǒng)實現(xiàn)熒光顏色識別。

2.4 Ion PGMTM系統(tǒng)

2010年， Life Technologies公司收購Ion Torrent公司，并迅速推出首款半導(dǎo)體測序儀—Ion PGMTM系統(tǒng)［10，11］。2012年，推出新型臺式測序儀—Ion ProtonTM系統(tǒng)［12］。Ion PGMTM和Ion ProtonTM系統(tǒng)開啟了后光學(xué)測序時代，即整個測序過程不涉及光信號，直接監(jiān)測測序反應(yīng)過程中氫離子釋放導(dǎo)致的局部pH值變化，利用離子傳感器直接將化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號。2014年，Thermo Fisher公司收購Life Technologies公司，推出兩款為Ion PGMTM系統(tǒng)設(shè)計的法醫(yī)SNP分型試劑盒：包含124個常染色體SNP位點和34個Y-SNP位點的人類個體識別試劑盒以及包含165個常染色體SNP位點的祖先來源推斷試劑盒，Thermo Fisher正致力于研發(fā)CODIS核心基因座的STR分型試劑盒，先期適用版本包含10個基因座［13］。

2.5 MiSeq FGxTM系統(tǒng)

圖1 Pubmed歷年新收錄二代測序科研論文數(shù)量Fig.1 Annual statistics of research articles on NGS in Pubmed

2014年，Illumina公司推出基于二代測序技術(shù)的法醫(yī)基因組分析系統(tǒng)—MiSeq FGxTM系統(tǒng)，并配套二代測序試劑盒—Forenseq DNA Signature Prep試劑盒［13］。MiSeq FGxTM系統(tǒng)繼承Solexa系統(tǒng)邊合成邊測序的基本原理，支持STR、SNP、線粒體DNA等多種法庭科學(xué)分子標(biāo)記檢測與分析；Forenseq DNA Signature Prep試劑盒包含27個常染色體STR基因座、24個Y-STR基因座、7個X-STR基因座、94個身源識別SNP基因座、22個表型SNP基因座和56個地域祖先來源SNP基因座。

3 科研論文發(fā)表情況

科研論文的發(fā)表數(shù)量和變化趨勢可以直觀地體現(xiàn)某個研究領(lǐng)域的研究熱度和發(fā)展趨勢。截止2015 年7月10日，Pubmed搜索引擎共收錄16423篇二代測序相關(guān)科研論文，主要集中于二代測序技術(shù)在各類癌癥和遺傳病診斷、基因組從頭測序和重測序、藥物研制、轉(zhuǎn)錄組、微生物組、基因調(diào)控等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用。自2007年起論文數(shù)量呈現(xiàn)逐年遞增趨勢（見圖1），2014年達到4506篇，預(yù)計2015年將突破5000篇。以上數(shù)據(jù)說明二代測序技術(shù)的相關(guān)研究正處于上升階段，更多的科研團隊正投入到相關(guān)研究中。相比之下，二代測序技術(shù)在法庭科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用發(fā)展滯后，截止2015年7月10日總共僅有119篇科研論文發(fā)表（見圖2），占比不足二代測序文章總數(shù)的1%，且直到2014年文章數(shù)量才出現(xiàn)急劇增長，說明二代測序技術(shù)在法庭科學(xué)領(lǐng)域起步晚，尚處于剛剛興起的階段。

4 二代測序與STR

圖2 Pubmed歷年新收錄二代測序技術(shù)在法庭科學(xué)領(lǐng)域運用科研論文數(shù)量Fig.2 Annual statistics of research articles on forensic NGS in Pubmed

STR技術(shù)是當(dāng)前法醫(yī)DNA領(lǐng)域的主流技術(shù)。首先，我國公安機關(guān)現(xiàn)有400余個DNA實驗室，對于其中90%以上的實驗室，基于PCR-CE方法進行STR分析是唯一的技術(shù)手段；第二，目前國際上最先進的法醫(yī)遺傳學(xué)實驗室仍視基于PCR-CE平臺的STR分析為DNA鑒定金標(biāo)準；第三，全球各國DNA數(shù)據(jù)庫均基于STR基因座；第四，大量積案、冷案的DNA證據(jù)均以STR分型體現(xiàn)，檢材已無法再次獲得。綜合以上四點，筆者認為STR技術(shù)在未來法醫(yī)DNA領(lǐng)域中仍將占據(jù)統(tǒng)治地位，二代測序技術(shù)若要在法醫(yī)遺傳學(xué)領(lǐng)域站穩(wěn)腳跟，則必須妥善解決好STR分型問題。

基于二代測序進行STR分析相比PCR-CE平臺具有顯著優(yōu)勢：第一，PCR-CE平臺僅區(qū)分等位基因的片段大小，核苷酸數(shù)量相等的所有等位基因被認為是同一個等位基因；二代測序技術(shù)可明辨DNA序列，展示出STR等位基因重復(fù)單元和側(cè)翼序列的真實差異。丹麥哥本哈根大學(xué)Morling等利用二代測序技術(shù)對197份丹麥人樣本進行STR檢驗，在D12S391基因座中發(fā)現(xiàn)53種不同的等位基因，而同批樣本用PCR-CE平臺檢測，僅發(fā)現(xiàn)15個不同的等位基因［14］。另一項研究顯示，PCR-CE平臺檢測結(jié)果中30%的純合子經(jīng)測序驗證為雜合子［13］。以上結(jié)果表明基于二代測序進行STR分析比PCR-CE平臺更為精細化，更充分發(fā)掘現(xiàn)有STR基因座的區(qū)分能力，只需更少的基因座即可達到現(xiàn)有個體識別率。第二， 二代測序?qū)到鈾z材進行STR分析具有優(yōu)勢。PCR-CE平臺采用多色熒光復(fù)合擴增技術(shù)，為在各色熒光中安置更多的基因座，設(shè)計引物時經(jīng)常有意保留較長的側(cè)翼序列，導(dǎo)致擴增效率降低，不利于降解檢材分型。利用二代測序技術(shù)進行STR分型，各基因座片段長度完全可以重疊在小片段區(qū)域且互不干擾，相當(dāng)于將更多的常規(guī)STR基因座作為Mini-STR基因座使用，對降解檢材分型效果自然更好。

2011年，丹麥自然歷史博物館Gilbert研究團隊基于454平臺率先將二代測序技術(shù)引入STR分析［15］。2012年，比利時根特大學(xué)Deforce教授研究組比較了D3S1358等9個CODIS核心基因座在454 和PCR-CE平臺的測序效果［16］。Deforce教授肯定了利用454平臺進行STR分析的可行性，也客觀指出454平臺比PCR-CE平臺更昂貴，需要更繁重的實驗室工作，錯誤率也更高。同年，美國巴特爾紀念研究Faith研究團隊報道利用Illumina二代測序系統(tǒng)進行STR分型［17］。2014年， Morling等報道基于454平臺進行STR分型嘗試和方法優(yōu)化，研究了D3S1358、D12S391、D21S11等3個STR基因座，發(fā)現(xiàn)30個新等位基因，并在D12S391核心重復(fù)單元中發(fā)現(xiàn)新的SNP位點［14］。美國武裝部隊DNA鑒定實驗室Scheible教授首次嘗試利用二代測序進行案件檢材的STR分型，并建立了48個常用STR基因座的二代測序分型方法［18］。

2015年，Morling等利用Thermo Fisher公司的Ion PGMTM系統(tǒng)，以及尚處于試用階段的包含10個基因座的試劑盒產(chǎn)品，建立了STR分型方法［19］。結(jié)果表明該方法在價格、需要檢材量、測序速度等方面相比其它方法具有優(yōu)勢。目前，Ion PGMTM系統(tǒng)測序讀長可達400 bp，雖然該方法僅針對重復(fù)單元較短的基因座（103～205 bp），但該系統(tǒng)仍具有潛力分型重復(fù)單元更長的基因座。Illumina公司推出的MiSeq FGxTM系統(tǒng)和Forenseq DNA Signature Prep試劑盒是現(xiàn)有唯一商業(yè)化二代測序STR分型解決方案，Illumina同時宣布要用二代測序技術(shù)替代PCR-CE平臺。而Thermo Fisher公司的策略則是將二代測序STR分型作為PCR-CE平臺的補充［13］。就在本文撰寫過程中，上海刑事科學(xué)技術(shù)研究院、上海市公安局、復(fù)旦大學(xué)聯(lián)合研究團隊報道在國際上首次成功利用二代測序技術(shù)進行Y-STR分型［20］。

5 二代測序與SNP

不同于STR分型區(qū)分長度多態(tài)性，SNP分型區(qū)分的是序列多態(tài)性。在二代測序數(shù)據(jù)分析方面，SNP要比STR更簡單。SNaPshot是基于PCR-CE平臺的SNP分型方法，也是目前最常用的SNP分型方法之一。澳大利亞Daniel研究組在136個SNP位點范圍內(nèi)比較了二代測序（Ion PGMTM平臺）、SNaPshot 和Sanger測序的實驗結(jié)果，二代測序分型成功率達97%以上，也發(fā)現(xiàn)個別位點由于特殊結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致測序錯誤［21］。奧地利、西班牙、德國等國家實驗室對二代測序SNP分型進行了實驗室間比對研究，研究組使用的是Ion PGMTM平臺和配套試劑盒，結(jié)果表明靈敏度達到25 pg，僅在rs1979255等5個位點發(fā)現(xiàn)結(jié)果不一致情況［10］。美國國家標(biāo)準與技術(shù)研究院Vallone團隊研究了二代測序?qū)到釪NA的分型效果，發(fā)現(xiàn)基于二代測序Ion PGMTM平臺的SNP體系對降解檢材分型效果優(yōu)于基于PCR-CE平臺的STR、Mini-STR和Indel體系［22］。二代測序數(shù)據(jù)的增長對Y染色體進化和Y-SNP研究也產(chǎn)生了深遠影響，每次二代測序研究都有機會對Y染色體重新分析并發(fā)現(xiàn)新的Y-SNP，學(xué)者已經(jīng)呼吁在二代測序背景下盡快形成具有國際共識的系統(tǒng)命名規(guī)則［23］。

6 二代測序與線粒體DNA

2014年以來，法醫(yī)遺傳學(xué)相關(guān)二代測序研究最集中的領(lǐng)域當(dāng)屬線粒體基因組測序［24-30］。雖然線粒體DNA技術(shù)的應(yīng)用遠不及STR技術(shù)廣泛，我國公安機關(guān)開展線粒體DNA鑒定的實驗室也相對較少，但該技術(shù)對于涉及微量DNA檢材或母系遺傳調(diào)查的案件具有獨特優(yōu)勢和不可替代性，是一項重要的刑事技術(shù)手段［31］。線粒體基因組全長16569個堿基，由于使用Sanger方法測線粒體基因組全序列費用高且工作量繁重，很多法庭科學(xué)實驗室只關(guān)注控制區(qū)中約600個堿基的高變區(qū)Ⅰ和高變區(qū)Ⅱ。二代測序技術(shù)使線粒體基因組測序的法醫(yī)學(xué)常規(guī)應(yīng)用成為可能，線粒體DNA的識別率將獲提升，線粒體技術(shù)有可能重新煥發(fā)青春。

Irwin等人率先意識到現(xiàn)有法庭科學(xué)線粒體數(shù)據(jù)庫只包含控制區(qū)信息，無法滿足線粒體基因組二代測序的數(shù)據(jù)分析需求［32］。Parson團隊評估了Ion PGMTM系統(tǒng)對線粒體基因組進行測序的效果，他們建立了64套線粒體基因組，并全部與經(jīng)典的Sanger測序結(jié)果比對，發(fā)現(xiàn)結(jié)果差異率低于0.02%［11］。美國Budowle研究組和McElhoe研究組分別建立并優(yōu)化評估了基于Illumina二代測序平臺的線粒體基因組測序方法，并比較了高變區(qū)Ⅰ/高變區(qū)Ⅱ與線粒體基因組的單倍型多樣性差異［25，26］。與高變區(qū)序列分析類似，線粒體基因組測序同樣只需微量DNA樣本。Parson等人使用Illumina二代測序平臺成功地從單根毛干樣本中恢復(fù)出完整的線粒體基因組序列，并建立起法醫(yī)DNA實驗室可常規(guī)使用的技術(shù)方法［27］。454系統(tǒng)同樣支持線粒體基因組測序［24，29］，并被應(yīng)用于異質(zhì)性分析研究中［29］。

7 展望與挑戰(zhàn)

隨著二代測序技術(shù)在法庭科學(xué)領(lǐng)域萌芽與發(fā)展，一場革命性的技術(shù)變革正在醞釀之中。二代測序技術(shù)的優(yōu)勢并不局限于高通量、高速度、集成化、低成本，在法庭科學(xué)領(lǐng)域，二代測序技術(shù)最有可能從微量的生物檢材中挖掘出案件所需要的全部遺傳學(xué)相關(guān)信息，這對于公安實戰(zhàn)具有無可比擬的吸引力。二代測序技術(shù)在法庭科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍并不局限于本文提到的STR、SNP和線粒體基因組測序，也可以為與法庭科學(xué)相關(guān)的動物、植物、微生物種屬鑒定和來源分析提供解決方案，服務(wù)于微生物恐怖襲擊、瀕危物種販賣、食品安全等類型案件，還可以用于表觀遺傳學(xué)和MicroRNA分析，推斷組織來源、嫌疑人年齡等信息［31］。

同時，我們也清醒認識到二代測序距離法庭科學(xué)常規(guī)應(yīng)用還有一定距離：首先，測序成本必須有效降低。低成本是二代測序的顯著優(yōu)勢，也是各公司推廣產(chǎn)品過程中的重要宣傳項目，但所謂“低成本”是與二代測序的另一個顯著特點“高通量”相輔相成的，即只有當(dāng)測序數(shù)據(jù)量足夠大時，單位數(shù)據(jù)量的成本才能夠降下來。當(dāng)前，常規(guī)STR分型、SNP分型往往只關(guān)注十幾個到幾十個位點，在如此小的數(shù)據(jù)量前提下，二代測序的成本則顯著高于PCR-CE平臺。第二，法庭科學(xué)數(shù)據(jù)分析方法尚不成熟。以STR分型為例，PCR-CE平臺關(guān)注的是STR的長度多態(tài)性，而二代測序獲得的是更加精細化的STR序列多態(tài)性，將對法庭科學(xué)起到更大的支撐作用；另一方面，基于各國現(xiàn)有的龐大DNA數(shù)據(jù)庫，技術(shù)接軌是必然選擇，如何將序列多態(tài)性在一定程度上轉(zhuǎn)化為長度多態(tài)性是二代測序工作者必須解決的問題。雖然業(yè)內(nèi)公司已提出初步解決方案，但大多是針對各個基因座的不同情況各個擊破，要實現(xiàn)統(tǒng)一的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)還需要更多的工作。第三，數(shù)據(jù)準確性風(fēng)險必須有效規(guī)避。法庭科學(xué)關(guān)乎個人命運、家庭幸福、公平正義和社會穩(wěn)定，是社會公眾不允許出錯的學(xué)科。各種二代測序平臺都不可避免地存在一定比例的錯誤率，這些技術(shù)風(fēng)險的控制效果將決定二代測序技術(shù)何時可以通過法律認可應(yīng)用于法庭科學(xué)實踐。第四，二代測序必須是一個開放的平臺。一項技術(shù)要被普及運用，離不開國際學(xué)界的廣泛參與、探索、優(yōu)化與完善。目前二代測序平臺由少數(shù)公司提供，除了價格、穩(wěn)定性等因素外，用戶往往傾向于選擇更加開放的平臺，即允許用戶根據(jù)各自需求自主設(shè)計實驗，更改參數(shù)設(shè)置，并與其它平臺有效兼容。法庭科學(xué)新技術(shù)往往需要專家證人出庭作證，只有整個技術(shù)的工作原理清晰明了，才有可能被法庭和立法機關(guān)接受。丹麥Morling教授已經(jīng)提出，二代測序的數(shù)據(jù)分析軟件算法必須公開，數(shù)據(jù)分析算法的“黑盒子”是無法被接受的［13］。第五，數(shù)據(jù)整合與倫理學(xué)。如前文所述，要充分發(fā)揮二代測序技術(shù)“高通量”與“低成本”的優(yōu)勢，數(shù)據(jù)整合勢在必行?；赑CR-CE平臺開發(fā)的常染色體STR、Y染色體STR、地域種族推斷SNP、外表特征刻畫SNP、插入缺失多態(tài)性Indel、mRNA、表觀遺傳學(xué)修飾等多種實驗體系，在二代測序的技術(shù)框架下都可以整合在一起，甚至法庭科學(xué)以外的其他標(biāo)記（如疾病診斷、遺傳缺陷篩查等）也可以整合在一起。從二代測序技術(shù)的特點角度講，越整合成本越低；從倫理學(xué)的角度講，越整合倫理學(xué)風(fēng)險越大；如何把握好二者之間的平衡，尚須全面深入的研究探討。

［1］ Sanger F， Nicklen S， Coulson AR.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1977，74（12）:5463-5467.

［2］ Margulies M， Egholm M， Altman WE， et al.Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors ［J］.Nature， 2005，437:376-380.

［3］ Meyer M， Stenzel U， Myles S， et al.Targeted high-throughput sequencing of tagged nucleic acid samples ［J］.Nucleic Acids Res， 2007，35: e97.

［4］ Meyer M， Stenzel U， Hofreiter M.Parallel tagged sequencing on the 454 platform ［J］.Nat Protoc， 2008，3: 267-278.

［5］ Droege M， Hill B.The genome sequencer FLX system--longer reads， more applications， straight forward bioinformatics and more complete data sets ［J］.J Biotechnol， 2008，136:3-10.

［6］ Van Tassell CP， Smith TP， Matukumalli LK， et al.SNP discovery and allele frequency estimation by deep sequencing of reduced representation libraries ［J］.Nat Methods， 2008，5:247-252.

［7］ Cronn R， Liston A， Parks M， et al.Multiplex sequencing of plant chloroplast genomes using Solexa sequencing-by-synthesis technology［J］.Nucleic Acids Res， 2008，36:e122.

［8］ Li R， Li Y， Fang X， et al.SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing ［J］.Genome Res， 2009，19:1124-1132.

［9］ Lin B， Wang J， Cheng Y.Recent patents and advances in the nextgeneration sequencing technologies ［J］.Recent Pat Biomed Eng，2008，2008:60-67.

［10］ Eduardoff M， Santos C， de la Puente M， et al.Inter-laboratory evaluation of SNP-based forensic identification by massively parallel sequencing using the ion PGM ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2015，17:110-121.

［11］ Parson W， Strobl C， Huber G， et al.Evaluation of next generation mtGenome sequencing using the ion torrent personal genome machine （PGM） ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2013，7:543-549.

［12］ Thomson JP， Fawkes A， Ottaviano R， et al.DNA immunoprecipitation semiconductor sequencing （DIP-SC-seq） as a rapid method to generate genome wide epigenetic signatures ［J］.Sci Rep， 2015，5:9778.

［13］ Borsting C， Morling N.Next generation sequencing and its applications in forensic genetics ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2015，http://dx.doi.org/10.1016/j.fsigen.2015.02.002.

［14］ Gelardi C， Rockenbauer E， Dalsgaard S， et al.Second generation sequencing of three STRs D3S1358， D12S391 and D21S11 in Danes and a new nomenclature for sequenced STR alleles ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2014，12:38-41.

［15］ Fordyce SL， Avila-Arcos MC， Rockenbauer E， et al.Highthroughput sequencing of core STR loci for forensic genetic investigations using the Roche genome sequencer FLX platform ［J］.Biotechniques， 2011，51:127-133.

［16］ Van Neste C， Van Nieuwerburgh F， Van Hoofstat D， et al.Forensic STR analysis using massive parallel sequencing ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2012，6:810-818.

［17］ Bornman DM， Hester ME， Schuetter JM， et al.Short-read， highthroughput sequencing technology for STR genotyping ［J］.Biotech Rapid Dispatches， 2012:1-6.

［18］ Scheible M， Loreille O， Just R， et al.Short tandem repeat typing on the 454 platform: strategies and considerations for targeted sequencing of common forensic markers ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2014，12:107-119.

［19］ Fordyce SL， Mogensen HS， Borsting C， et al.Second-generation sequencing of forensic STRs using the ion torrent HID STR 10-plex and the Ion PGM ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2015，14:132-140.

［20］ Zhao X， Ma K， Li H， et al.Multiplex Y-STRs analysis using the Ion Torrent Personal Genome Machine （PGM） ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2015.http://dx.doi.org/10.1016/j.fsigen.2015.06.012.

［21］ Daniel R， Santos C， Phillips C， et al.A SNaPshot of next generation sequencing for forensic SNP analysis ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2015，14:50-60.

［22］ Gettings KB， Kiesler KM， Vallone PM.Performance of a next generation sequencing SNP assay on degraded DNA ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2015，19:1-9.

［23］ Larmuseau MH， Van Geystelen A， Kayser M， et al.Towards a consensus Y-chromosomal phylogeny and Y-SNP set in forensics in the next-generation sequencing era ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2015，15:39-42.

［24］ Mikkelsen M， Frank-Hansen R， Hansen AJ， et al.Massively parallel pyrosequencing of the mitochondrial genome with the 454 methodology in forensic genetics ［J］.Forensic Sci Int Genet，2014，12:30-37.

［25］ King JL， LaRue BL， Novroski NM， et al.High-quality and highthroughput massively parallel sequencing of the human mitochondrial genome using the Illumina MiSeq ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2014，12:128-135.

［26］ McElhoe JA， Holland MM， Makova KD， et al.Development and assessment of an optimized next-generation DNA sequencing approach for the mtgenome using the Illumina MiSeq ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2014，13:20-29.

［27］ Parson W， Huber G， Moreno L， et al.Massively parallel sequencing of complete mitochondrial genomes from hair shaft samples［J］.Forensic Sci Int Genet， 2015，15:8-15.

［28］ Van Neste C， Gansemans Y， De Coninck D， et al.Forensic massively parallel sequencing data analysis tool: Implementation of MyFLq as a standalone web- and Illumina BaseSpace（（R））-application ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2015，15:2-7.

［29］ Skonieczna K， Malyarchuk B， Jawien A， et al.Heteroplasmic substitutions in the entire mitochondrial genomes of human colon cells detected by ultra-deep 454 sequencing ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2015，15:16-20.

［30］ Just RS， Irwin JA， Parson W.Mitochondrial DNA heteroplasmy in the emerging field of massively parallel sequencing ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2015.http://dx.doi.org/10.1016/ j.fsigen.2015.05.003.

［31］ Yang Y， Xie B， Yan J.Application of next-generation sequencing technology in forensic science ［J］.Genomics Proteomics Bioinformatics， 2014，12:190-197.

［32］ Irwin JA， Parson W， Coble MD， et al.mtGenome reference population databases and the future of forensic mtDNA analysis ［J］.Forensic Sci Int Genet， 2011，5:222-225.

引用本文格式：王樂，葉健，白雪，等.二代測序技術(shù)及其在法醫(yī)遺傳學(xué)中的應(yīng)用 ［J］.刑事技術(shù)，2015，40（5）:353-358.

Next Generation Sequencing and Its Application in Forensic Genetics

WANG Le， YE Jian， BAI Xue， YANG Fan， ZHAO Xingchun*
（Beijing Engineering Research Center of Crime Scene Evidence Examination， Key Laboratory of Forensic Genetics of Ministry of Public Security， Institute of Forensic Science of Ministry of Public Security， Beijing 100038， China）

From DNA fi ngerprinting to multiplex STR amplifi cation and detection， forensic DNA scientists witnessed the rapid advances in DNA technology and the substantial changes in ways of solving criminal cases during the past three decades.As a matter of fact， only incremental developments of forensic DNA technologies and the "passive comparison" mode of using DNA information could not meet current expectations for forensic genetics from crime investigators.It has been unprecedentedly emphasized that great efforts are needed for more powerful solutions that are automatic， highthroughput， precise， rapid and being support to the "active searching" mode of DNA information utilization.Under such circumstances， next generation sequencing （NGS） comes just in time.Chinese authorities and experts have already realized the great potential of NGS applications for forensic purposes， although the application of NGS in forensic science is still at initial stages， compared with its applications in fi elds of cancer diagnosis， genetic disease diagnosis， de novo sequencing，genome resequencing， transcriptome resequencing and drug discovery.More information can be obtained from a single experiment by analyzing the STR， SNP， Indel and RNA markers simultaneously， which could be impossible on routinely used PCR-CE platforms because of the limited amount of exhibits.In this article， the authors attempt to describe the basic concepts， developmental history and working principles of NGS to Chinese experts in the general fi eld of forensic science and technologies， and share the updates of NGS-based STR typing， SNP typing and whole mtGenome sequencing during the past two years.Representative NGS platforms including the 454/Roche GS FLX system， the Solexa system， the SOLiDTMsystem， the Ion PGMTMsystem and the MiSeq FGxTMsystem were introduced.Annual statistics of research articles on NGS and forensic NGS were described and trends for related research were analyzed.Finally， perspectives of forensic NGS were presented and possible challenges including data analysis methods， openness of NGS systems and ethical issues were discussed in the hope of providing a reference for related research and applications.

forensic genetics； next generation sequencing； STR； SNP； whole mtGenome sequencing

DF795.2

A

1008-3650（2015）05-0353-06

10.16467/j.1008-3650.2015.05.002

公安部科技強警基礎(chǔ)工作專項項目（No.2013GABJC035），中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目（No.2012JB001， 2015JB007）

王 樂（1983—），男，遼寧沈陽人，副主任法醫(yī)師，博士，研究方向為法醫(yī)遺傳學(xué)。 E-mail: wangle_02@163.com

趙興春，男，主任法醫(yī)師，碩士，研究方向為法醫(yī)遺傳學(xué)。 E-mail: zhaoxchun@sina.com

2015-7-21