SPE-HPLC/QTOF-MS法檢測人全血中馬錢子堿

劉文龍，孫志衛(wèi)，李常明，丁 丁，陳文斌

（長沙市公安局刑偵支隊(duì)，長沙 410004）

SPE-HPLC/QTOF-MS法檢測人全血中馬錢子堿

劉文龍，孫志衛(wèi)，李常明，丁 丁，陳文斌

（長沙市公安局刑偵支隊(duì)，長沙 410004）

目的 建立一種基于固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測人全血中馬錢子堿的檢測方法。方法 樣品過Oasis HLB固相萃取小柱，經(jīng)3 mL去離子水淋洗，有機(jī)溶劑洗脫后，在Zorbox Eclipse Plus C18 （2.1mm×50mm，1.8μ m）色譜柱上分離，以0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，四級桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜檢測。通過計(jì)算500 ng/mL馬錢子堿對照樣品在上述固相萃取和色譜質(zhì)譜條件下，不同洗脫溶劑以及不同洗脫體積下的回收效率從而優(yōu)化洗脫溶劑的種類和使用量。結(jié)果 以甲醇為洗脫溶劑，加入量為3 mL時(shí)，馬錢子堿在200～2000 ng/mL的添加水平下回收率為80.1%～101.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%～8.3%。人全血中馬錢子堿在50～5000 ng/mL范圍內(nèi)線性良好（R2=0.999 97），檢測限為10.2 ng/mL，最低定量限為34.1 ng/mL。結(jié)論 該方法快速方便，回收率和靈敏度高，可用于人全血中馬錢子堿的定量測定。

法醫(yī)毒物分析；馬錢子堿；固相萃??；高效液相色譜/串聯(lián)四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜

馬錢子堿是一種劇毒的白色晶體堿，來自于馬錢子和相關(guān)植物，臨床上用于治療風(fēng)濕頑痹等疾病。成人一次攝入馬錢子堿60～80 mg即可致死［1］。目前，生物樣品中馬錢子堿的固相萃取（solid phase extraction，SPE）前處理方法中使用離子交換柱［2］較多，該小柱只對離子和能離子化的物質(zhì)萃取效率高，但需要對樣品進(jìn)行酸化或堿化處理。而檢測方法現(xiàn)有氣相色譜質(zhì)譜法（GC/MS）、高效液相色譜法（HPLC）和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC/MS/MS）等［2-4］。本實(shí)驗(yàn)通過使用HLB小柱，優(yōu)化SPE提取條件，建立了一種基于固相萃取-高效液相色譜/串聯(lián)四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（SPE-HPLC/QTOF-MS）檢測人血中馬錢子堿的新方法。

1 材料與方法

1.1 儀 器

Agilent 1260-6530 Q-TOF LC/MS系統(tǒng)（美國Agilent公司）；Milli-Q 純水系統(tǒng)（美國Milillipore公司）；Glison GDX-274固相萃取儀（法國Glison公司）。

1.2 色譜條件

色譜柱 Zorbax Eclipse Plus C18（2.1×50 mm， 1.8μm），柱溫30℃；進(jìn)樣量1μ L；流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液-甲醇梯度洗脫，洗脫梯度程序見表1；流速0.3 mL/ min；后運(yùn)行時(shí)間7 min。

表1 流動(dòng)相成分及梯度Table1 Fluid component and gradient of mobile phase

1.3 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），分析物在正離子掃描模式下檢測。Fragmentor電壓125 V；毛細(xì)管電壓3000 V；干燥器溫度350℃；干燥氣流速9 L/min；噴霧壓力35 psi；檢測范圍100～1200 m/z；掃描速率3 scan/s；雙噴霧模式，使用參比溶液實(shí)時(shí)校正質(zhì)量軸；4 GHz高精度模式記錄質(zhì)譜數(shù)據(jù)。母離子和CID碰撞能分別設(shè)為395.19653和40 eV，優(yōu)化參數(shù)后的一級提取離子色譜圖和二級質(zhì)譜圖，分別見圖1和圖2。

圖1 馬錢子堿空白樣品加標(biāo)提取離子色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatography of brucine in control sample

圖2 馬錢子堿空白樣品加標(biāo)二級質(zhì)譜圖Fig.2 Q-TOF MS/MS mass spectrum of brucine in control sample

1.4 試劑與耗材

Oasis 固相萃取小柱（HLB 3 cc/200mg，美國Waters公司）；標(biāo)準(zhǔn)品馬錢子堿（北京藥品生物制品檢定所）；甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純；其余試劑為分析純。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取馬錢子堿標(biāo)準(zhǔn)品配制成1.0 mg/mL甲醇儲備液，置于4℃冰箱中保存，使用時(shí)稀釋成相應(yīng)濃度。

1.6 樣品前處理

在空白全血中添加馬錢子堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，從中準(zhǔn)確吸取1 mL，加1 mL乙腈，然后加入5 mL水稀釋，渦旋振蕩，8000 r/min 離心10 min，取上清液過柱萃取。HLB小柱依次經(jīng)1 mL乙腈、1 mL甲醇、3mL去離子水活化、平衡，樣品過柱后用3 mL水淋洗，再用3 mL甲醇洗脫，洗脫液混勻后經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾后待檢。

1.7 線性關(guān)系測定

用空白全血和馬錢子堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制30、50、100、200、500、2000、5000、10 000、20 000 ng/mL系列濃度的馬錢子堿對照樣品溶液，按1.6方法進(jìn)行處理，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行分析，分別以馬錢子堿峰面積Y對加入標(biāo)準(zhǔn)品量做校正曲線。

1.8 回收率和精密度測定

在空白全血中添加馬錢子堿標(biāo)準(zhǔn)品，使馬錢子堿的全血濃度分別為200、500、2000 ng/mL，按1.6所述方法進(jìn)行處理，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測定值比實(shí)際添加量得回收率，每個(gè)濃度樣品平行分析3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPE條件的優(yōu)化

（1）萃取小柱的選擇：HLB由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，是一種適合酸性、中性和堿性化合物的通用型吸附劑。在本實(shí)驗(yàn)中不需要調(diào)節(jié)酸堿性［2］，也能達(dá)到較高回收率。故選擇HLB作為萃取小柱，樣品處理更簡單。（2）洗脫液種類的選擇：實(shí)驗(yàn)方法分別考察了甲醇和乙腈的洗脫效果。通過比較，發(fā)現(xiàn)甲醇的洗脫回收率高。故以甲醇為洗脫劑。（3）洗脫劑體積的選擇：500 ng/mL馬錢子堿對照樣品經(jīng)SPE小柱富集后，分別用1、2、3、4 mL甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫效果見圖3。由圖可見，隨著洗脫液體積的增加，回收率逐漸提高，當(dāng)洗脫液體積為3 mL時(shí)，增加洗脫液體積，回收率基本不變，故本實(shí)驗(yàn)選用3 mL甲醇洗脫分析物。

圖3 洗脫溶液的體積對目標(biāo)回收率的影響Fig.3 Effect of eluent volume on the recovery rate of brucine

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

馬錢子堿的全血濃度在50～5000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：

y=585.76x+1728.7，R2=0.99997，以信噪比S/N≥3作為檢出限，馬錢子堿的檢測線為10.2 ng/ mL，以S/N≥10作為最低定量限，最低定量限為34.1 ng/mL。

2.3 回收率和精密度

空白全血中加入3種濃度對照品溶液，測得馬錢子堿的回收率和精密度見表2。

表2 加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果（n=3）Table2 Recovery rate and precision of brucine spiked（n=3）

3 案例應(yīng)用

2014年7月，我市發(fā)生一起利用馬錢子投放煎熬中藥材進(jìn)行投毒的案件。用上述檢測方法，受害人血液中馬錢子堿濃度為31.4 ng/mL，同時(shí)檢測出士的寧成分。

綜上所述，該方法快速方便，所用試劑易得，提取回收率和檢測靈敏度高，適用于馬錢子堿投毒案件。

［1］ 段韻，姜燕，符蕓，等.中藥馬錢子中毒死亡檢驗(yàn)方法的研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2006，41（21）:1616-1618.

［2］ 王朝虹，邢俊波，王志萍. LC/MS/MS法測定全血中馬錢子堿和士的寧的含量［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（4）:226-228.

［3］ 王燕軍. 氣相色譜/質(zhì)譜檢驗(yàn)馬錢子堿方法 ［J］.刑事技術(shù)，2001（5）:55.

［4］ 白璐，廖林川，顏有儀. 高效液相色譜法檢測肝組織中馬錢子堿和士的寧［J］.刑事技術(shù)，2005（4）:16-19.

引用本文格式：劉文龍， 孫志衛(wèi)， 李常明， 等.SPE-HPLC/QTOF-MS法檢測人全血中馬錢子堿 ［J］.刑事技術(shù)，2015，40（5）:417-419.

Determination of Brucine in Human Blood by SPE-HPLC/QTOF-MS

LIU Wenlong， SUN Zhiwei， LI Changming， DING Ding， CHEN Wenbin
（Criminal Investigation Detachment of Changsha Public Security Bureau， Changsha 410004， China）

Objective To develop a simple method for determination of brucine in the whole blood based on solid phase extraction （SPE） and high-performance liquid chromatography/electrospray ionization with quadrupole time-of-fl ight tandem mass spectrometry （HPLC/QTOF-MS）.Methods The samples were extracted in HLB column with 3 mL water and organic solvent to be separate as the washing and elution solvent.The extracts were analyzed with Zorbox Eclipse Plus C18 （2.1 mm×50 mm， 1.8 μm） column and gradient elution by mobile phase consisted of water （containing 0.1% formic acid）-methanol at 0.3 mL/min， and the involvement of quadrupole time of flight tandem MS detector.The type and volume of elution were optimized by calculation of recovery effi ciency of 500 ng/mL brucine of the control sample subjected to the different elution solvent and volume.Results Under the optimal condition of 3 mL elution solvent of methanol， the recovery rate of brucine in the blood at 200～2000 ng/mL level was 80.1%～101.3%， and the corresponding standard deviations （ RSDs， n=3）5.2%～8.3%.The calibration curves were linear over 50 ～5000 ng/mL （R2=0.99997）， the limit of detection （LOD） 10.2 ng/ mL， and the limit of quantity （LOQ） 34.1 ng/mL.Conclusions The method is simple， accurate and convenient for qualitative and quantitative determination of brucine in the human whole blood.

forensic toxicology； brucine； solid phase extraction； HPLC/QTOF-MS

DF795.4

B

1008-3650（2015）05-0417-03

10.16467/j.1008-3650.2015.05.016

劉文龍（1987—），男，湖南益陽人，助理工程師，學(xué)士，研究方向?yàn)槔砘治觥?E-mail: 84745453@qq.com

2014-12-08