唑尼沙胺對癲癇大鼠血清及腦組織NO含量及NOS活性的影響

陳芳，劉斌，張靜，王薇，孫素真，王麗輝

唑尼沙胺對癲癇大鼠血清及腦組織NO含量及NOS活性的影響

陳芳，劉斌，張靜，王薇，孫素真，王麗輝△

目的 探討新型抗癲癇藥物唑尼沙胺對癲癇大鼠血清及腦組織NO含量及一氧化氮合酶（NOS）活性的影響。方法50只健康雄性SD大鼠中隨機抽取8只為正常對照組，剩余42只全部腹腔注射戊四氮制成癲癇模型，從中隨機抽取24只，以完全隨機分組法分為癲癇模型組、唑尼沙胺組及苯巴比妥組，監(jiān)測各組大鼠經(jīng)藥物干預(yù)后血清及腦組織NO、丙二醛（MDA）含量及NOS、超氧化物歧化酶（SOD）的活性變化。結(jié)果 35只（83%）大鼠模型制備成功；戊四氮致癇大鼠的腦電圖中均可見陣發(fā)性癲癇波；與正常對照組比較，癲癇模型組和唑尼沙胺組大鼠的血清和腦組織的NO、MDA含量及NOS活性明顯升高，SOD活性下降；苯巴比妥組腦組織NO、MDA含量升高，SOD活性下降，血清MDA含量升高。與癲癇模型組比較，唑尼沙胺組和苯巴比妥組大鼠血清和腦組織NO、MDA含量及NOS活性明顯降低，SOD活性升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 唑尼沙胺通過降低腦組織NO含量而發(fā)揮其抗癲癇作用。

抗驚厥藥；癲癇；戊四唑；一氧化氮；一氧化氮合酶；丙二醛；超氧化物歧化酶；大鼠，Sprague-Dawley；唑尼沙胺

癲癇是人類一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，可能由多種因素、介質(zhì)共同參與。有研究顯示NO可以作為神經(jīng)遞質(zhì)，參與癲癇的發(fā)作［1-2］。而丙二醛（MDA）作為過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，可以間接地反映組織中氧自由基含量的變化；超氧化物歧化酶（SOD）可清除體內(nèi)氧自由基，減輕神經(jīng)元損傷。本研究以戊四氮致癇大鼠為模型，其癲癇發(fā)作與人類相似，并給予新型抗癲癇藥物唑尼沙胺及傳統(tǒng)抗癲癇藥物苯巴比妥干預(yù)性治療，描記大鼠腦電圖特點并檢測大鼠腦組織和血清NO、一氧化氮合酶（NOS）、MDA及SOD的變化，從而探討治療癲癇的可能機制，為癲癇治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量（250±20）g（許可證號：1310073，河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供）。實驗前先將所有動物在實驗室飼養(yǎng)7 d，以適應(yīng)環(huán)境。從所有實驗動物中隨機抽取8只為正常對照組，剩余42只全部腹腔注射戊四氮制成癲癇模型。模型制備成功后，以完全隨機分組法抽取24只作為本實驗動物，再分為癲癇模型組、唑尼沙胺組及苯巴比妥組，每組8只。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 24只大鼠均給予戊四氮溶液45 mg/kg，每24 h腹腔注射1次，注射后均觀察40 min，記錄致癇大鼠發(fā)作的潛伏期、驚厥發(fā)作的表現(xiàn)及持續(xù)時間。致癇大鼠的癲癇表現(xiàn)形式采用Racine分級評價標準：0級，無反應(yīng)；Ⅰ級，濕狗樣抖動和（或）面肌痙攣，如動須、眨眼及節(jié)律性咀嚼；Ⅱ級，頸部肌肉的痙攣，出現(xiàn)點頭和（或）甩尾；Ⅲ級，單側(cè)前肢痙攣；Ⅳ級，雙側(cè)前肢痙攣，站立位出現(xiàn)；Ⅴ級，全身強直、陣攣，失去平衡、跌倒。觀察實驗大鼠在造模過程中出現(xiàn)以上分級中的Ⅳ～Ⅴ級表現(xiàn)，提示戊四氮點燃成功。正常對照組在同期給予同等容量的生理鹽水腹腔注射。

1.2.2 腦電圖（EEG）監(jiān)測 從每組實驗大鼠中抽取2只行腦電圖監(jiān)測：先用10%的水合氯醛35 mg/kg腹腔注射，麻醉大鼠后固定于固定架上。再用頭皮針樣電極的單極導(dǎo)聯(lián)法，連續(xù)描記2 min的腦電圖。腦電圖靈敏度20 μV/mm，時間常數(shù)為0.1 s。每次記錄前均在彩色顯示器上觀察信號，待信號基線平穩(wěn)后再將信號存入計算機硬盤。放置電極位置及導(dǎo)聯(lián)：單極導(dǎo)聯(lián)法；取2根0.5寸（15 mm）針灸毫針為記錄電極，分別刺入大鼠頭頂部中線兩側(cè)的頭皮下，再將導(dǎo)線連接到腦電圖的信號輸入設(shè)備，大鼠尾根部也需放置電極，接地。在每只大鼠的第6次癲癇發(fā)作時描記腦電圖，先觀察行為學變化，再記錄腦電圖變化。

1.2.3 藥物劑量及途徑 造模成功后30 min，唑尼沙胺組給予唑尼沙胺45 mg·kg-1·d-1灌胃；苯巴比妥組給予苯巴比妥30 mg·kg-1·d-1灌胃；正常對照組、癲癇模型組給予同等體積的生理鹽水。每日1次，于上午11：00前給藥，連續(xù)給藥14 d。

1.2.4 標本的采集和測定 所有動物在實驗2周時稱質(zhì)量后，首先將大鼠以戊巴比妥鈉40 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，仰臥位固定在手術(shù)板上，經(jīng)腹主動脈采血法采血3～4 mL后斷頭取出整塊腦組織。用吸水紙粘去多余水分，將腦組織稱質(zhì)量，取一側(cè)大腦半球，經(jīng)福爾馬林固定后行病理切片觀察；另一側(cè)大腦用生理鹽水按1 g∶9 mL比例制成10%的腦組織勻漿，取上清液，冰凍-70℃待測。待所有腦組織及血清標本留取完畢后從冰箱取出，常溫融化后按照各試劑盒說明書操作步驟檢測血清和腦組織的NO、MDA含量及NOS、SOD活性。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料先行正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)分布的資料用x ±s表示。方差齊性檢驗后，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 癲癇大鼠的特征 共給42只SD大鼠注射戊四氮，其中有2只（4.8%）大鼠有Ⅴ級發(fā)作持續(xù)10 min以上而死亡。所有大鼠均在第1次腹腔注射戊四氮后出現(xiàn)Ⅲ級及以上驚厥發(fā)作，38只（90%）可在第2次注射戊四氮后達到RacineⅣ級及以上。第3次戊四氮腹腔注射后，5只未達RacineⅣ級發(fā)作。最終35只（83%）模型制備成功。

2.2 EEG改變 正常對照組的腦電圖表現(xiàn)為低中幅、相對對稱的正常腦電波，見圖1。戊四氮致癇大鼠腦電圖表現(xiàn)為：基本背景節(jié)律下可見陣發(fā)性癲癇波，見圖2。唑尼沙胺組及苯巴比妥組大鼠經(jīng)藥物干預(yù)，腦電波中的棘波減少，背景節(jié)律較規(guī)整。

2.3 各組大鼠血清和腦組織NO、MDA含量及NOS、SOD活性的變化 與正常對照組比較，癲癇模型組和唑尼沙胺組大鼠的腦組織和血清的NO、MDA含量及NOS活性明顯升高，SOD活性下降；苯巴比妥組腦組織NO、MDA含量升高，SOD活性下降，血清MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與癲癇模型組比較，唑尼沙胺組和苯巴比妥組大鼠血清和腦組織NO、MDA含量及NOS活性明顯降低，SOD活性升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1、2。

Tab.1 Changes of NO，MDA content and NOS，SOD activity in rat brain tissues表1 各組大鼠腦組織NO、MDA含量及NOS、SOD活性的變化 （n=8，x±s）

Tab.2 Changes of serum NO，MDA content and NOS，SOD activity in three groups of rats表2 各組大鼠血清NO、MDA含量及NOS、SOD活性的變化 （n=8，x±s）

3 討論

癲癇是一種長期反復(fù)發(fā)作的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，人們對癲癇發(fā)病機制及治療的研究主要依靠動物模型。戊四氮為興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，根據(jù)其藥代動力學特點，此藥物可以引起動物抽搐的迅速發(fā)生，并且這種抽搐發(fā)作可以迅速達到高峰，持續(xù)較短，能自動停止，同時此模型具有不破壞局部腦組織的結(jié)構(gòu)，不伴有神經(jīng)元損傷、壞死的優(yōu)點，有利于癲癇腦組織的形態(tài)學觀察。因此戊四氮致癇的動物模型是研究癲癇的理想動物模型。

目前治療癲癇的基本方法仍是口服抗癲癇藥物。傳統(tǒng)的抗癲癇藥物如苯妥英、卡馬西平、丙戊酸等均因長期服用出現(xiàn)較大的毒性，并且可能存在肝酶代謝異常、半衰期短及產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物等，其不良反應(yīng)較嚴重，因此在臨床上的應(yīng)用受到限制［3］。唑尼沙胺是一種新型廣譜抗癲癇藥，無大多數(shù)傳統(tǒng)抗癲癇藥物（AEDs）所含有的酰腺結(jié)構(gòu)，具有獨特的化學結(jié)構(gòu)和廣譜的抗癲癇活性［4］。唑尼沙胺作為在難治性部分性發(fā)作的癲癇患者添加治療已顯示出其有效性［5-6］，長期治療也持續(xù)有效［7-8］，且相對于傳統(tǒng)抗癲癇藥物不良反應(yīng)小。目前已發(fā)現(xiàn)此藥物可通過多種作用機制發(fā)揮治療癲癇的作用，主要包括：（1）抑制電壓依賴性鈉離子通道。（2）降低T-型鈣離子內(nèi)流［9］。（3）直接改變一些神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和降解，如γ-氨基丁酸（GABA）、多巴胺、5-羥色胺（5-HT）和乙酰膽堿，這些作用可以增強突觸抑制。但是，NO及氧自由基在唑尼沙胺抗癲癇作用機制中的作用少見報道。

本研究通過檢測血清及腦組織NO、MDA含量和NOS活性，證實了癲癇發(fā)作后NO含量升高，引起腦組織損傷；有研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸鈉可以通過減少NO的代謝產(chǎn)物而發(fā)揮其抗癲癇作用［10］。而本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過唑尼沙胺或苯巴比妥治療后血清及腦組織NO含量及NOS活性降低，提示唑尼沙胺可能通過降低NO含量或NOS活性而發(fā)揮其治療作用。另外，本實驗中癲癇組大鼠MDA含量升高，SOD活性降低；而經(jīng)過唑尼沙胺干預(yù)治療的大鼠與癲癇模型組相比，MDA含量降低，SOD活性升高，提示唑尼沙胺可能通過降低MDA含量或提高SOD活性發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。本實驗證實了唑尼沙胺抗癲癇治療的有效性，為臨床工作中尋找新的及選用合理的抗癲癇藥物提供了依據(jù)。

（圖1、2見插頁）

［1］Su J，Zhu W，Liu J，et al.Involvement of neuronal nitric oxide synthase in antiepileptic action of alpha-asarone on pentylenetetrazol molding rats［J］.Biomed Mater Eng，2014，24（6）:3645-3655.doi: 10.3233/BME-141192.

［2］Rahimi N，Sadeghzadeh M，Javadi-Paydar M，et al.Effects of dpenicillamine on pentylenetetrazole-induced seizures in mice:Involvement of nitric oxide/NMDA pathways［J］.Epilepsy Behav，2014，28（39C）:42-47.doi:10.1016/j.yebeh.2014.07.013.

［3］Bialer M.Chemical properties of antiepileptic drugs（AEDs）［J］.Adv Drug Deliv Rev，2012，64（10）:887-895.doi:10.1016/j.addr.2011.11.006.

［4］Holder JL Jr，Wilfong AA.Zonisamide in the treatment of epilepsy［J］.Expert Opin Pharmacother，2011，12（16）:2573-2581.doi:10.1517/ 14656566.2011.622268.

［5］Brodie MJ，Duncan R，Vespignani H，et al.Dose-dependent safety and efficacy of zonisamide:a randomized，double-blind，placebocontrolled study in patients with refractory partial seizures［J］.Epilepsia，2005，46（1）:31-41.doi:10.1111/j.0013-9580.2005.14704.x.

［6］Villanueva V，Serrano-Castro PJ.Zonisamide in the epilepsy treatment:a literature review from add-on therapy to monotherapy［J］.Rev Neurol，2013，56（8）:429-438.

［7］Kim DW，Choi K，Moon HS，et al.Long-term retention rate of zonisamide in patients with epilepsy:An observational study［J］.Clin Neuroparmacol，2014，37（5）:133-135.doi: 10.1097/ WNF.0000000000000046.

［8］Wehner T，Chinnasami S，Novy J，et al.Long term retention of retigabine in a cohort of people with drug resistant epilepsy［J］.Seizure，2014，23（10）:878-881.doi:10.1016/j.seizure.2014.08.001.

［9］Shahabadi N，Khorshidi A，Mohammadpour M.Investigation of the effects of Zn2+，Ca2+and Na+ions on the interaction between zonisamide and human serum albumin（HSA）by spectroscopic methods［J］.Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc，2014，25 （122）:48-54.doi:10.1016/j.saa.2013.11.047.

［10］Cho DH，Park JH，Joo Lee E，et al.Valproic acid increases NO production via the SH-PTP1-CDK5-eNOS-Ser116 signaling cascade in endothelial cells and mice［J］.Free Radic Biol Med，2014，19 （76）:96-106.doi:10.1016/j.freeradbiomed.2014.07.043.

（2014-05-26收稿 2014-12-09修回）

（本文編輯 魏杰）

Effects of zonisamide on NO content and NOS activity in serum and brain tissue of epileptic rats

CHEN Fang，LIU Bin，ZHANG Jing，WANG Wei，SUN Suzhen，WANG Lihui△
Department of Neurology，Children's Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050031，China
△Corresponding Author E-mail:1251680182@qq.com

Objective To investigate the effect of zonisamide as a new antiepileptic drug on nitric oxide（NO）content and nitric oxide synthase（NOS）activity in serum and brain tissue of epileptic rats.Methods Eight healthy rats were used as normal control group，and twenty-four epileptic rats induced by pentrazol were randomly divided into epilepsy model group，zonisamide group and phenobarbital group.Levels of NO and malondialdehyde（MDA）content，NOS and superoxide dismutase（SOD）activity in serum and brain tissue were detected in four groups.Results Forty-two rats were injected pentrazol，and 35（83%）rats were established the rat model successfully.Epileptic waves were visible in EEG of epileptic rats.The concentrations of NO，MDA and the activity of NOS in serum and brain were significantly increased，the activity of SOD was significantly decreased，in epileptic rats than those of control rats.The concentrations of NO and MDA were significantly increased；the activity of SOD was significantly decreased，in brain in phenobarbital group compared with those of control group.There were significantly lower levels of NO，MDA and NOS，and significantly higher level of SOD in serum and brain tissue in zonisamide group and phenobarbital group than those of epileptic model group（P＜0.05）.Conclusion Zonisamide plays an antiepileptic role by reducing the concentration of NO in brain of epileptic rats.

anticonvulsants；epilepsy；pentylenetetrazole；nitric oxide；nitric oxide synthase；malondialdehyde；superoxide dismutase；rats，Sprague-Dawley；zonisamide

R742.1

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.007

河北省兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（郵編050031）

陳芳（1981），女，主治醫(yī)師，主要從事兒童神經(jīng)內(nèi)科研究

△E-mail：1251680182@qq.com