五味子乙素對(duì)HK-2細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用

盧愛龍，譚小月，張勉之，吳銀娜

五味子乙素對(duì)HK-2細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用

盧愛龍1，譚小月2，張勉之3△，吳銀娜1

目的 探討五味子乙素（Sch B）對(duì)氯化鈷（CoCl2）誘導(dǎo)的人類近端腎小管上皮（HK-2）細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法 取離體培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，隨機(jī)分為4組。對(duì)照（C）組：細(xì)胞未經(jīng)任何處理。CoCl2組（化學(xué)乏氧組）：加入600 μmol/L的CoCl2處理24 h。Sch B預(yù)保護(hù)（CoCl2+Sch B）組：分別加入終濃度為1 μmol/L和10 μmol/L Sch B預(yù)處理2 h后，其余操作同CoCl2組。Sch B組：分別加入終濃度1 μmol/L和10 μmol/L Sch B處理2 h。CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞活性；AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率；Western Blot檢測(cè)各組缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）蛋白表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)各組HIF-1α和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，CoCl2組細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率、HIF-1α蛋白表達(dá)量和iNOS mRNA表達(dá)量顯著增加，HIF-1α mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Sch B預(yù)保護(hù)組較CoCl2組細(xì)胞活性顯著增加，細(xì)胞凋亡率、HIF-1α蛋白表達(dá)量、HIF-1α及iNOS mRNA表達(dá)量均顯著減少；Sch B組與對(duì)照組細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Sch B組幾乎不表達(dá)HIF-1α蛋白。結(jié)論 Sch B可能通過(guò)抑制HIF-1α蛋白和iNOS mRNA的表達(dá)減少HK-2細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)HK-2細(xì)胞缺氧損傷起保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡；缺氧誘導(dǎo)因子1，α亞基；一氧化氮合酶；五味子乙素；HK-2細(xì)胞；氯化鈷；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶

腎缺血再灌注損傷是一種嚴(yán)重的臨床并發(fā)癥，常見于失血性休克、腎移植、腹主動(dòng)脈瘤手術(shù)等危重癥患者。探索對(duì)缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用的藥物一直是研究熱點(diǎn)。五味子乙素（schisandrin B，Sch B）是從中藥五味子中分離的聯(lián)苯環(huán)辛二烯木脂素類有效成分，是五味子中含量較多的有效成分之一，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、護(hù)肝等作用。研究表明，Sch B對(duì)心［1］、腦［2］缺血再灌注損傷均具有保護(hù)作用。而且，Sch B具有顯著的腎臟保護(hù)作用，對(duì)急性汞中毒引起的腎小球和腎小管損傷［3］，以及環(huán)孢素A［4］、順鉑［5］等腎毒性藥物造成的腎損害均有保護(hù)作用。但目前關(guān)于Sch B對(duì)腎缺血再灌注損傷的研究尚較少。缺氧是缺血再灌注損傷中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腎臟管狀上皮細(xì)胞的高水平氧耗量及腎臟的特殊脈管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)使得腎臟對(duì)缺氧非常敏感，而近曲腎小管上皮細(xì)胞對(duì)缺氧損傷尤為敏感?；诖?，本實(shí)驗(yàn)擬從體外水平檢測(cè)Sch B對(duì)氯化鈷（CoCl2）誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人類近端腎小管上皮（HK-2）細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC）細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑與儀器 五味子乙素（純度99%）購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，二甲基亞砜溶解配制成10 mmol/L母液，CoCl2（美國(guó)，Sigma），CCK-8試劑盒（日本，dojindo），AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)，BD），缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）多克隆抗體（美國(guó)，proteintech），β-actin單克隆抗體（美國(guó)，Santa Cruz），RNA抽提試劑Trizol（美國(guó)，Invitrogen），逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）試劑盒（北京全式金），聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀、臺(tái)式高速離心機(jī)及凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)，Bio-Rad），酶標(biāo)儀（美國(guó)，Thermo），引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在含10%胎牛血清，1%雙抗（100 U/mL青霉素+100 mg/L鏈霉素）的DMEM-F12培養(yǎng)基中，于5% CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每2 d進(jìn)行細(xì)胞換液，長(zhǎng)至80%左右融合后以0.25%胰酶消化傳代。

1.4 分組及處理 以HK-2細(xì)胞培養(yǎng)皿或孔板為觀察單位，隨機(jī)分為4組：對(duì)照（C）組：細(xì)胞未經(jīng)任何處理。CoCl2組（化學(xué)乏氧組）：加入600 μmol/L的CoCl2處理24 h。Sch B預(yù)保護(hù)（CoCl2+Sch B）組：分別加入終濃度為1 μmol/L和10 μmol/L Sch B預(yù)處理2 h后，其余操作同CoCl2組。Sch B組：分別加入終濃度1 μmol/L和10 μmol/L Sch B處理2 h。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 CCK-8試劑盒檢測(cè)HK-2細(xì)胞活性 在96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h使細(xì)胞周期同步化，然后按上述分組進(jìn)行處理。處理完成后每孔加CCK-8試劑10 μL，37℃孵育1 h，選擇450 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性（%）=（OD加藥－OD空白）/（OD對(duì)照－OD空白）×100%

1.5.2 AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 待細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h使細(xì)胞周期同步化，再按上述分組加藥處理后，胰酶消化收集各組細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次（2 000 r/min離心5 min），用500 μL緩沖液重懸細(xì)胞后，先加入5 μL AnnexinV-FIFC染色液混勻后，再加入5 μL PI染色液，混勻后室溫避光孵育10 min。篩網(wǎng)過(guò)濾后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。FlowJo軟件計(jì)算分析各組細(xì)胞AnnexinV-FIFC和PI染色細(xì)胞百分含量。

1.5.3 Western Blot檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá) 接種于6孔板中的各組細(xì)胞以預(yù)冷PBS液洗2次，加入50 μL預(yù)冷蛋白裂解液，冰上裂解30 min，細(xì)胞刮刀收集樣本。2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉（BCA）法蛋白定量、配樣，100℃、10 min變性后上樣。經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。用等滲鹽溶液加Tris-HCL緩沖液（TBST）沖洗后加HIF-1α及β-actin的一抗，4℃孵育過(guò)夜。TBST液沖洗，加標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶的二抗孵育。洗膜后ECL顯色，X線片曝光，沖洗，掃描。以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)HIF-1α蛋白的表達(dá)。

1.5.4 RT-PCR檢測(cè)HIF-1α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表達(dá) 采用Trizol試劑盒從接種到6孔板中的各組細(xì)胞提取總mRNA。紫外分光光度儀檢測(cè)mRNA的含量和純度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，瓊脂凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像后以GAPDH為內(nèi)參，用Image J數(shù)碼圖像分析軟件進(jìn)行分析，以擴(kuò)增片段與GAPDH的灰度比值表示產(chǎn)物多少，進(jìn)行半定量分析。HIF-1α引物上游 5′-GGAAACTTCTGGATGCTGGTG-3′，下游5′-TTCCTCGGCTAGTTAGGGTAC-3′，擴(kuò)增片段330 bp；iNOS引物上游5′-CCACCAACAATGGCAACATCAGG-3′，下 游 5′-AGGCAGGGCGTACCACTTTAGCT-3′，擴(kuò)增片段350 bp；GAPDH引物為上游5′-CGGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，下游5′-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為299 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃30 min，85℃5 min。PCR條件：94℃變性5 s，58℃退火15 s，72℃延伸10 s，33個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SigmaStat 3.5統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性 與對(duì)照組相比，CoCl2組細(xì)胞活性明顯降低，Sch B預(yù)保護(hù)組較CoCl2組細(xì)胞活性顯著增加（P＜0.01），Sch B組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 細(xì)胞凋亡率 見圖1、表1。與對(duì)照組相比，CoCl2組細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.001），Sch B預(yù)保護(hù)組較CoCl2組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Sch B組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

Fig.1 Results of apoptosis detected by flow cytometry in six groups of cells圖1 各組細(xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè)凋亡圖

Tab.1 Comparison of the cell viability and apoptotic rates in six groups of cells表1 各組細(xì)胞的細(xì)胞活性和凋亡率比較（n=3，%，±s）

Tab.1 Comparison of the cell viability and apoptotic rates in six groups of cells表1 各組細(xì)胞的細(xì)胞活性和凋亡率比較（n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，d與（4）組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組（1）CoCl2組（2）1 μmol/L Sch B預(yù)保護(hù)組（3）10 μmol/L Sch B預(yù)保護(hù)組（4）1 μmol/L Sch B組（5）10 μmol/L Sch B組（6）F細(xì)胞活性100.000±0.000 57.710±0.957a73.420±4.932ab81.283±2.808abc93.490±3.291bcd94.137±6.854bcd17.554＊＊細(xì)胞凋亡率7.110±0.417 14.897±0.303a12.880±0.734ab11.767±0.677ab8.463±0.600bcd8.383±0.465bcd30.489＊＊

2.3 對(duì)HIF-1α蛋白表達(dá)量的影響 與對(duì)照組相比，CoCl2組HIF-1α蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.001），Sch B預(yù)保護(hù)組較CoCl2組顯著降低（P＜0.01），Sch B組幾乎不表達(dá)HIF-1α蛋白，見圖2、表2。

Fig.2 The expression of HIF-1α in six groups of cells圖2 各組細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)情況

2.4 對(duì)HIF-1α、iNOS mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，CoCl2組HIF-1α mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），iNOS mRNA表達(dá)量顯著增加（P＜0.01），Sch B預(yù)保護(hù)組HIF-1α及iNOS mRNA表達(dá)量均較CoCl2組顯著減少（P＜0.05），見圖3、表2。

3 討論

3.1 凋亡在細(xì)胞缺氧損傷中的作用 細(xì)胞凋亡是在正常生理或病理狀態(tài)下機(jī)體細(xì)胞發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過(guò)程，是缺氧誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的主要機(jī)制之一［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CoCl2誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞缺氧導(dǎo)致細(xì)胞活性顯著下降，凋亡率顯著增加。

Fig.3 The expressions of HIF-1α mRNA and iNOS mRNA in six groups of cells圖3 各組細(xì)胞HIF-1α及iNOS mRNA的表達(dá)情況

Tab.2 Comparison of HIF-1α expression and HIF-1α，iNOS transcription between six groups表2 各組HIF-1α蛋白及HIF-1α、iNOS mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of HIF-1α expression and HIF-1α，iNOS transcription between six groups表2 各組HIF-1α蛋白及HIF-1α、iNOS mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，d與（4）組比較，e與（5）組比較，P＜0.05

?

3.2 HIF-lα在細(xì)胞缺氧損傷中的作用 在缺氧條件下機(jī)體或細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一系列的缺氧應(yīng)答反應(yīng)，而這些缺氧應(yīng)答反應(yīng)主要通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）來(lái)調(diào)控。HIF作為氧自穩(wěn)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)百余種靶基因的表達(dá)，從而使得機(jī)體或細(xì)胞對(duì)缺氧缺血性損傷產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)HIF家族共有3個(gè)成員，包括HIF-l、HIF-2和HIF-3，其中HIF-l廣泛分布于哺乳動(dòng)物和人體細(xì)胞內(nèi)。在腎臟缺氧缺血損傷中，HIF-1主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞上。HIF-1是由α亞基和β亞基組成的一種異二聚體，其中α亞基是功能性亞基，β亞基是結(jié)構(gòu)性亞基。缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生HIF-lα，通過(guò)調(diào)控一系列與適應(yīng)缺氧有關(guān)的轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體針對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)性。HIF-1α介導(dǎo)一系列適應(yīng)性反應(yīng)的同時(shí)也誘導(dǎo)了很多病理性反應(yīng)，如細(xì)胞凋亡［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIF-1α蛋白的高表達(dá)與HK-2細(xì)胞的活性下降及凋亡增加相關(guān)，說(shuō)明HIF-1α蛋白可能誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的凋亡。HIF-1α蛋白非缺氧時(shí)容易降解，但在缺氧時(shí)則降解阻止。研究發(fā)現(xiàn)：除嚙齒類動(dòng)物外，缺氧條件下HIF-1的調(diào)節(jié)性亞基HIF-1α在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上并沒(méi)有顯著性變化，而是經(jīng)過(guò)阻滯蛋白酶體通路活性，使本應(yīng)降解掉的HIF-1α蛋白堆積，進(jìn)而影響下游各個(gè)基因的表達(dá)［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組與CoCl2組HIF-1α mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異，但CoCl2組HIF-1α蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加，與既往研究結(jié)果一致。

3.3 iNOS在細(xì)胞缺氧損傷中的作用 內(nèi)源性NO 由L-精氨酸氧化而來(lái)，催化該反應(yīng)的酶即為一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）。NOS有3個(gè)同工酶亞型：神經(jīng)型NOS（nNOS）、內(nèi)皮型NOS（eNOS）和iNOS。iNOS在正常細(xì)胞內(nèi)一般是少量表達(dá)的，當(dāng)細(xì)胞受到缺氧等病理刺激時(shí)，iNOS催化合成非生理濃度的大量NO，產(chǎn)生一系列病理生理作用。盡管NO能維持黏膜的血管舒張和血管通透性，但是過(guò)多的NO也可直接引起細(xì)胞毒性作用，與氧自由基結(jié)合生成過(guò)氧亞硝酸等，從而引起組織損傷［9］。HIF-1α是iNOS基因轉(zhuǎn)錄活化的重要調(diào)節(jié)因子。有研究發(fā)現(xiàn)iNOS基因表達(dá)調(diào)控區(qū)內(nèi)具有HIF-1α的結(jié)合位點(diǎn)；HIF-1α與iNOS基因調(diào)控區(qū)的特異位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)其表達(dá)［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CoCl2組iNOS mRNA表達(dá)量顯著增加，與HIF-1α的增加一致。

3.4 Sch B保護(hù)細(xì)胞缺氧損傷 五味子是臨床常用中藥之一，具有斂肺生津、補(bǔ)腎養(yǎng)心、收斂固澀等功效，其提取物對(duì)各種器官如肝臟、心臟、腎臟等的損傷具有保護(hù)作用，能拮抗阿霉素對(duì)體外培養(yǎng)足細(xì)胞的損傷作用［11］。Sch B是從五味子中提取的中藥單體，既往研究結(jié)果表明，其具有抗氧化、抗腫瘤等作用，對(duì)心腦肝腎等重要器官均具有保護(hù)作用，而且對(duì)機(jī)體正常的細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。本研究初步證實(shí)Sch B可能通過(guò)抑制HIF-1α蛋白和iNOS mRNA的表達(dá)減少HK-2細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)HK-2細(xì)胞缺氧損傷起保護(hù)作用，但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

［1］Chen P，Pang S，Yang N，et al.Beneficial effects of schisandrin B on the cardiac function in mice model of myocardial infarction［J］.PloS one，2013，8（11）:e79418.doi:10.1371/journal.pone.0079418.eCollection 2013.

［2］Chen N，Chiu PY，Ko KM.Schisandrin B enhances cerebral mitochondrial antioxidant status and structural integrity，and protects against cerebral ischemia/reperfusion injury in rats［J］.Biol PharmBull，2008，31（7）:1387-1391.

［3］Stacchiotti A，Li Volti G，Lavazza A，et al.Different role of Schisandrin B on mercury-induced renal damage in vivo and in vitro［J］.Toxicology，2011，286（1-3）:48-57.doi:10.1016/j.tox.2011.05.005.

［4］Zhu S，Wang Y，Chen M，et al.Protective effect of schisandrin B against cyclosporine A-induced nephrotoxicity in vitro and in vivo ［J］.Am J Chin Med，2012，40（3）:551-566.doi:10.1142/ S0192415X12500425.

［5］Bunel V，Antoine MH，Nortier J，et al.Protective effects of schizandrin and schizandrin B towards cisplatin nephrotoxicity in vitro［J］.J Appl Toxicol，2014，34（12）:1311-1319.doi:10.1002/jat.2951.

［6］Song H，Han IY，Kim Y，et al.The NADPH oxidase inhibitor DPI can abolish hypoxia-induced apoptosis of human kidney proximal tubular epithelial cells through Bcl2 up-regulation via ERK activation without ROS reduction［J］.Life Sci，2015，126：69-75.doi: 10.1016/j.lfs.2015.02.004.

［7］Zhang Q，Qian Z，Pan L，et al.Hypoxia-inducible factor 1 mediates the anti-apoptosis of berberine in neurons during hypoxia/ischemia ［J］.Acta Physiol Hung，2012，99（3）:311-323.doi:10.1556/ APhysiol.99.2012.3.8.

［8］Sarwat AM，Al-Salam S.Expression of HIF-1，galectin-3，cox-2 and Wilms tumor-1 protein in multiple schwannomas of the conus medullaris［J］.J Neurooncol，2009，92（1）:111-115.

［9］Liu HT，Mu DZ.Inducible nitric oxide synthase and brain hypoxicischemic brain damage［J］.Chin J Contemp Pediatr，2014，16（9）: 962-967.［劉海婷，母得志.誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和缺氧缺血腦損傷［J］.中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2014，16（9）：962-967］.doi: 10.7499/j.issn.1008-8830.2014.09.022.

［10］Hu R，Dai A，Tan S.Hypoxia-inducible factor 1 alpha upregulates the expression of inducible nitric oxide synthase gene in pulmonary arteries of hyposic rat［J］.Chin Med J（Engl），2002，115（12）:1833-1837.

［11］Ai C，Tan XY，Zhang MZ，et al.Effects of Schisandra Chinensis Fruit Ethanol Extract on Nephrin and Desmin Expression in Adriamycin Induced Podocyte Injury［J］.Tianjin Med J，2014，42（6）: 526-529.［艾辰，譚小月，張勉之，等.五味子醇提液對(duì)阿霉素?fù)p傷足細(xì)胞中nephrin和desmin表達(dá)的影響［J］.天津醫(yī)藥，2014，42 （6）:526-529］.doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.004.

（2015-03-04收稿 2015-03-18修回）

（本文編輯 李鵬）

Protective effects of schisandrin B on hypoxia injury of HK-2 cells

LU Ailong1，TAN Xiaoyue2，ZHANG Mianzhi3△，WU Yinna1
1 Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Medical School of Nankai University；3 Tianjin Gongan Hospital
△Corresponding Author E-mail:zhangmianzhi@vip.sina.com

Objective To explore the protective effects of schisandrin B（Sch B）on hypoxia injury induced by cobaltous chloride（CoCl2）in human proximal renal tubular epithelial（HK-2）cells，and the possible mechanism thereof.Methods HK-2 cells were randomly assigned to four groups:control group（Con，cells were untreated），CoCl2group（CoCl2，cells were treated with 600 μmol/L CoCl2for 24 h），Sch B pretreat group（CoCl2+Sch B，cells were pretreated with 1 μmol/L and 10 μmol/L Sch B for 2 h）and Sch B group（Sch B，cells were treated with 1 μmol/L and 10 μmol/L Sch B for 2 h）.CCK-8 kit was used to detect the cell viability of four groups.Flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of four groups.The protein expression of hypoxia-inducible factor 1α（HIF-1α）was assessed by Western blot assay.The expressions of HIF-1α and inducible nitric oxide synthase（iNOS）mRNA were determined by RT-PCR.Results Compared with the control group，after treated with 600 μmol/L CoCl2，the cell viability was decreased，and the apoptosis was increased，the expressions of HIF-1α and iNOS mRNA were up-regulated in HK-2 cells.There was no significant difference in the expression of HIF-1α mRNA between control group and CoCl2group.Compared with the CoCl2group，after pretreated with 1 μmol/L and 10 μmol/L Sch B，the cell viability was increased and the apoptosis was decreased，the expressions of HIF-1α and iNOS were down-regulated in HK-2 cells.There were no significant differences in the cell viability and apoptotic rate between control group and Sch B group.Conclusion Pretreatment with Sch B can reduce the apoptosis of HK-2 cells by inhibiting the expression of HIF-1α and iNOS mRNA，which shows protective effects on hypoxia injury.

apoptosis；hypoxia-inducible factor 1，alpha subunit；nitric oxide synthase；schisandrin B；HK-2 cells；cobaltous chloride；inducible nitric oxide synthase

R692

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.005

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（14JCYBJC28200）

1天津醫(yī)科大學(xué)（郵編300070）；2南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3天津市公安醫(yī)院

盧愛龍（1988），男，碩士研究生在讀，主要從事腎缺血再灌注損傷研究

△E-mail：zhangmianzhi@vip.sina.com