COX-2與Survivin蛋白在人成釉細胞瘤中的表達及意義

李樂，張興樂，王鵬，劉雨

COX-2與Survivin蛋白在人成釉細胞瘤中的表達及意義

李樂1，張興樂1，王鵬1，劉雨2

目的研究環(huán)氧化合酶-2（COX-2）和生存素（Survivin）在人成釉細胞瘤（AB）中的表達情況。方法收集60例AB患者的腫瘤組織和正?？谇火つそM織。60例AB患者中原發(fā)40例，復(fù)發(fā)20例；組織學分型：棘皮瘤型12例，濾泡型18例，叢狀型18例，基底細胞型6例，促結(jié)締組織增生型6例。采用免疫組化法和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測AB和正?？谇火つぶ蠧OX-2和Survivin的表達，比較不同組織及分型的AB表達情況。結(jié)果AB中COX-2蛋白的陽性表達率（82.7%）高于正常口腔黏膜（10.0%），Survivin表達陽性率（83.3%）高于正?？谇火つぃ?6.7%）。AB 中COX-2蛋白表達水平為0.781±0.142，高于正常口腔黏膜組織的0.179±0.056；Survivin蛋白表達水平為0.447± 0.139，高于正?？谇火つそM織的0.072±0.017，差異均有統(tǒng)計學意義。COX-2與Survivin的表達呈正相關(guān)（r=0.778，P＜0.05）。不同組織學分型AB中的COX-2和Survivin表達陽性率差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論COX-2、Survivin在AB中高表達，可能與AB的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

成釉細胞瘤；環(huán)氧化合酶-2；生存素；免疫組織化學；印跡法，蛋白質(zhì)

人成釉細胞瘤（ameloblastoma，AB）是常見的牙源性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制尚不明了［1］。有研究發(fā)現(xiàn)，在胰頭癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌中及口腔鱗癌中均有環(huán)氧化合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和生存素（Survivin）蛋白的表達，兩者皆可以促進腫瘤細胞的增殖，抑制腫瘤細胞凋亡，參與腫瘤血管形成，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［2］。但有關(guān)這2種蛋白在AB中的研究較少，其與AB發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不明確。本實驗采用免疫組化法和蛋白免疫印跡法（Western Blot）法檢測AB組織和正?？谇火つぶ蠧OX-2、Survivin的蛋白表達，探討兩者在AB發(fā)生發(fā)展過程中起到的作用。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2007年1月—2013年12月在我院口腔頜面外科經(jīng)手術(shù)治療的AB患者60例（AB組），男33例，女27例，年齡12～70歲，平均（45.1±5.2）歲。60例AB患者中，原發(fā)40例，復(fù)發(fā)20例（未選擇相同患者）。部位：下頜骨42例，上頜骨18例。組織學分型：棘皮瘤型12例，濾泡型18例，叢狀型18例，基底細胞型6例，促結(jié)締組織增生型6例。以WHO在2002年發(fā)布的《頭頸部腫瘤病理學與遺傳學》中牙源性腫瘤分類作為本研究的病理診斷標準［3］，所有患者均未患其他腫瘤，所有腫瘤HE切片均經(jīng)我院病理科2位教授共同復(fù)讀確認。選擇同期行唇裂手術(shù)患者的正常唇紅黏膜組織60例作為對照組。

1.2主要試劑SP-9000試劑盒、濃縮型DAB顯色劑、0.01 mol/L的PBS緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。鼠抗人COX-2、Survivin、β-actin單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。二抗購自北京博奧森公司。PVDF膜、化學發(fā)光液購自美國Milipore公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化法測COX-2、Survivin在AB和正?？谇火つぶ械谋磉_標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。采用免疫組化S-P法檢測AB和正常口腔黏膜組織中COX-2和Survivin的蛋白表達，DAB法顯色。陽性對照為口腔鱗癌，陰性對照采用PBS代替一抗。于顯微鏡下觀察切片，胞漿中出現(xiàn)黃色顆粒為陽性著色，讀取任意5個高倍鏡視野進行判斷。A（細胞顯色深淺評分）:0分為細胞無色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。B（顯色瘤細胞比例評分）:1分為≤25%；2分為＞25%～75%；3分為＞75%。最終每例積分=A×B［4］，按積分高低分為:陰性（-），積分0分；弱陽性（+），積分1～4分；中度陽性（++），積分＞4～7分；強陽性（+++），積分＞7。

1.3.2Western Blot法測COX-2、Survivin在AB和正?？谇火つぶ械谋磉_取-80℃保存的AB和正?？谇火つそM織各100 mg放入含RIPA裂解液的研磨器中，用剪刀剪碎后研磨，靜置40 min后4℃離心，取其上清。用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。加入一抗（鼠抗人COX-2、Survivin抗體稀釋濃度為1∶1 000，鼠抗人β-actin抗體稀釋濃度為1∶5 000），4℃冰箱過夜，第2天加入二抗（山羊抗鼠1∶5 000）。暗室中涂布化學發(fā)光液，以X線片曝光并常規(guī)顯影、定影，以β-actin為內(nèi)參。采用FlourChem V 2.0凝膠成像分析軟件分析，記錄每條蛋白電泳帶的蛋白吸光度容積比率。

1.4統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)以SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。定性資料采用χ2檢驗分析。定量資料以±s表示，采用t檢驗分析。COX-2與Survivin表達量的關(guān)系行Pearson相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1COX-2、Survivin蛋白水平的免疫組化結(jié)果COX-2、Survivin蛋白在叢狀型AB的中間星網(wǎng)狀層細胞與外周柱狀或立方狀細胞質(zhì)中呈中、高度表達，見圖1；在濾泡型AB的外周層細胞核中也中、高度表達，見圖2；而在人正?？谇火つぶ袇s幾乎未見表達，見圖3。AB組中COX-2、Survivin蛋白的陽性表達率均高于對照組（P＜0.05），原發(fā)AB和復(fù)發(fā)AB中COX-2、Survivin蛋白的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義，見表1。各組織學分型間COX-2和Survivin蛋白陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

Fig.1　The expression of COX-2（A）and Survivin（B）protein in plexiform AB（SP，×200）圖1　COX-2蛋白（A）和Survivin蛋白（B）在叢狀型AB中的表達（SP，×200）

Fig.2　The expression of COX-2（A）and Survivin（B）protein in follicular AB（SP，×400）圖2　COX-2蛋白（A）和Survivin蛋白（B）在濾泡型AB中的表達（SP，×400）

Fig.3　The expression of COX-2（A）and Survivin（B）protein in normal oral mucosa（SP，×400）圖3　COX-2蛋白（A）和Survivin蛋白（B）在正?？谇火つぶ械谋磉_（SP，×400）

2.2COX-2、Survivin蛋白水平的Western Blot結(jié)果腫瘤組織中COX-2蛋白、Survivin蛋白表達水平明顯高于正?？谇火つそM織（P＜0.05），見表3、圖4。Survivin蛋白與COX-2蛋白呈正相關(guān)（r= 0.778，P＜0.05）。

Tab.1　The positive expression of COX-2 and Survivin protein in AB and normal oral mucosa groups表1COX-2、Survivin蛋白在AB組和對照組的陽性表達情況　例（%）

Tab.2　COX-2 and Survivin protein expression in various types of AB groups表2COX-2、Survivin蛋白在各型AB中的表達例（%）

Tab.3　Comparison of the expression of COX-2 and Survivin between AB and normal oral mucosa groups表3COX-2、Survivin蛋白在AB組和對照組中的表達水平比較?。ā纒）

Tab.3　Comparison of the expression of COX-2 and Survivin between AB and normal oral mucosa groups表3COX-2、Survivin蛋白在AB組和對照組中的表達水平比較?。ā纒）

＊＊P＜0.01

組別AB組對照組t n 60 60 COX-2 0.781±0.142 0.179±0.056 17.65＊＊Survivin 0.447±0.139 0.072±0.017 11.976＊＊

Fig.4　The expression of COX-2 and Survivin protein圖4　COX-2、Survivin蛋白的表達

3　討論

COX-2是一種誘導(dǎo)型酶，在多種腫瘤組織中高表達，但在正常組織中無表達，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5］。COX-2的過度表達具有以下作用：（1）抵抗腫瘤細胞凋亡。（2）刺激腫瘤細胞增殖。（3）促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。（4）促進腫瘤組織及其周圍組織的血管形成［6］。本研究結(jié)果顯示COX-2蛋白在AB組織中的陽性表達率高于正?？谇火つそM織，表明AB相對于正?？谇火つそM織具有更強的增殖活性。COX-2蛋白主要表達于中間星網(wǎng)狀層細胞與外周柱狀或立方狀細胞質(zhì)中，這可能說明星網(wǎng)狀層細胞與外周柱狀或立方狀細胞的增殖活性更強，是腫瘤的生發(fā)中心。Sun等［7］發(fā)現(xiàn)COX-2可明顯抑制細胞凋亡，同時上調(diào)抗凋亡因子bcl-2的水平。既往有研究表明，bcl-2在成釉細胞瘤中陽性率高，且表達位置與本實驗中COX-2的表達位置一致［8］。由此提示，AB中COX-2可能通過刺激bcl-2的表達從而抑制AB細胞凋亡，促進腫瘤細胞的增殖。COX-2還可通過提高腫瘤組織中血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）的表達而促進腫瘤及周圍組織中的血管生成［9］。以往的研究顯示，AB為典型的血管依賴性病變，VEGF在AB為強陽性表達，并伴隨AB生物學行為的不同（復(fù)發(fā)和惡變）其表達遞增［10］。本實驗Western Blot結(jié)果顯示COX-2在AB組織中表達水平明顯高于正常口腔黏膜組織，與VEGF的表達趨勢相同，提示AB中COX-2可能通過調(diào)節(jié)VEGF的表達促進血管生成，進一步促進腫瘤的發(fā)展，與既往結(jié)果一致［11］，COX-2在AB的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了很重要的作用。

上皮-間質(zhì)誘導(dǎo)存在于AB的發(fā)生、發(fā)展及其構(gòu)成的臨床生物學行為中［11］，本實驗證實survivin不但表達于中間星網(wǎng)狀層細胞與外周柱狀或立方狀細胞質(zhì)中，在纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、炎性淋巴細胞等AB的間質(zhì)成分中也都有survivin的陽性表達，這提示survivin在AB的起始階段可能就開始發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用。Survivin蛋白是迄今為止分子質(zhì)量最小、抗凋亡作用最強的凋亡抑制蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)survivin可通過抑制促凋亡基因Bax和Fas下游的反應(yīng)而抑制細胞凋亡［12］。AB中Bax雖然在外周層和星網(wǎng)狀層細胞中都有表達，但表達以弱陽性為主，在惡變組中表達明顯降低［7］。結(jié)合本實驗免疫組化結(jié)果提示，可能正是由于survivin在AB的外周層和星網(wǎng)狀層細胞中的高表達，對Bax的表達起抑制作用，從而抑制了腫瘤細胞的凋亡。本實驗60例AB中有50例survivin呈陽性表達，且表達程度較高，正常人口腔黏膜上皮細胞、顆粒性變細胞和角化退變樣細胞中survivin蛋白的表達為陰性或弱陽性，而Endoh等［13］研究證實，由于survivin的過度表達，凋亡關(guān)卡失去了在細胞正常增殖周期中的限制作用，并通過有絲分裂促進轉(zhuǎn)化細胞的異常增殖，這說明由于survivin的過度表達促進了AB的發(fā)展。本實驗的Western Blot結(jié)果顯示survivin在AB中的表達水平明顯高于正?？谇火つそM織中的表達水平，結(jié)合免疫組化結(jié)果提示，survivin在AB中可能通過抑制促凋亡基因Bax的表達來增強腫瘤細胞的抗凋亡作用，并通過抑制凋亡關(guān)卡的限制作用而促進AB中腫瘤細胞的增殖。

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（2014-08-29收稿2014-10-23修回）

（本文編輯閆娟）

The expression of COX-2 and Survivin in ameloblastoma and its clinical significance

LI Le1，ZHANG Xingle1，WANG Peng1，LIU Yu2
1 Department of Stomatology，2 Operation Room，the Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde 067000，China

ObjectiveTo investigate the expression of cyclooxygenase-2（COX-2）and Survivin in ameloblastoma（AB）tissues.MethodsA total of 60 AB samples（primary AB 40 cases，recurrent AB 20 cases）and 60 normal oral mucosas were collected from the Affiliated Hospital of Chengde Medical College.The AB samples included 12 acanthomatous types，18 follicular patterns，18 plexiform patterns，6 basal cell ameloblastomas and 6 desmoplastic ameloblastomas.The expression levels of COX-2 and Survivin were detected by immunohistochemistry and Western blot methods in AB and normal oral mucosa.The expressions of COX-2 and Survivin were compared between different types and tissues of AB.ResultsThe positive rate of COX-2 was significantly higher in AB（82.7%）than that in normal oral mucosa（10.0%）.The positive rate of Survivin was significantly higher in AB（83.3%）than that in normal oral mucosa tissues（16.7%）.The expression of COX-2 （0.781±0.142）was higher in AB than that of normal oral mucosa tissues（0.179±0.056）.The expression of Survivin（0.447± 0.139）was significantly higher in AB than those in normal oral mucosa tissues（0.072±0.017）.There was a positive correlation between the expression of COX-2 and Survivin（r=0.778，P＜0.05）.There were no significant differences in the positive expressions of COX-2 and Survivin between different types of AB（P＞0.05）.ConclusionCOX-2 and Survivin were overexpressed in AB，which may be involved in the occurrence and development of AB.

ameloblastoma；cyclooxygenase-2；survivin；immunohistochemistry；blotting，Western

R739.8

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.013

河北省科技支撐計劃項目（201121054）

1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔科（郵編067000），2手術(shù)部

李樂（1980），男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事口腔頜面部腫瘤研究