鋅指蛋白185對膠質(zhì)瘤細胞增殖影響的研究

陸斌，鄭全輝

鋅指蛋白185對膠質(zhì)瘤細胞增殖影響的研究

陸斌1，鄭全輝2△

目的探討鋅指蛋白ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖中的作用。方法標本取自2011年1月—2013年12月于唐山市工人醫(yī)院就診，經(jīng)病理確診為膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織，以瘤旁組織作對照。提取不同組織總蛋白，Western-blot檢測ZNF185的表達。提取瘤旁組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄擴增ZNF185編碼序列并克隆至pEGFPC2質(zhì)粒，構(gòu)建ZNF185表達載體。采用Lipofactamine2000將ZNF185表達載體轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細胞系SF767，以轉(zhuǎn)染pEGFPC2空載體細胞作為對照。采用流式細胞儀檢測細胞周期變化；MTT法檢測細胞增殖活性。結(jié)果與瘤旁組織相比，ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達顯著降低（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染ZNF185表達載體的膠質(zhì)瘤細胞與對照細胞相比ZNF185的表達顯著增加（P＜0.01）；過表達ZNF185導(dǎo)致SF767細胞G0～G1期細胞比例顯著增加（P＜0.05），而S期細胞比例減少（P＜0.05）。同時，過表達ZNF185也導(dǎo)致SF767細胞的增殖速度顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤細胞中發(fā)揮抑制細胞增殖的作用。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；細胞周期；細胞增殖；鋅指；轉(zhuǎn)染；ZNF185

神經(jīng)膠質(zhì)瘤亦稱膠質(zhì)細胞瘤，是臨床上常見的腦惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、病死率較高，嚴重危害人類身體健康。膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制復(fù)雜，是一個長期的、多因素造成的發(fā)病過程。目前對造成膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制仍缺乏深入了解。近年來的分子遺傳學(xué)研究表明，癌基因或抑癌基因的表達異常在膠質(zhì)細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［1］。鋅指蛋白（zinc finger protein，ZNF）185是一種c端含有LIM（Lin-1，Is1.1 and nec-3）結(jié)構(gòu)域的蛋白，盡管目前已知LIM結(jié)構(gòu)域蛋白在細胞分化、器官發(fā)育、細胞骨架組織以及腫瘤的發(fā)生等生物學(xué)過程中具有調(diào)控功能［2］。然而，對于ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不明確。為此，本研究通過檢測ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤和瘤旁組織的表達差異，探討ZNF185對膠質(zhì)瘤細胞細胞周期和增殖的作用，為深入了解其發(fā)病機制提供線索。

1　材料與方法

1.1材料人腦膠質(zhì)瘤及瘤旁組織取自2011年1月—2013年12月于唐山市工人醫(yī)院就診，經(jīng)病理確診為膠質(zhì)瘤的20例患者。人膠質(zhì)瘤細胞系SF767購自北京協(xié)和細胞生物所。DMEM細胞培養(yǎng)液和胎牛血清（FBS）均購自GIBCO公司；TRIzol試劑盒、Lipofactamine2000購自Invitrogen公司；各種限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；兔抗人ZNF185一抗、兔抗人actin一抗，HRP-羊抗兔二抗購自北京博奧森公司。Western-blot底物發(fā)光檢測試劑盒購自Pierce公司。pEGFPC2綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒由中科院動物所趙勇研究員提供；蛋白提取試劑盒和Bio-Rad蛋白濃度測定試劑盒購自北京天恩澤公司，引物由上海生物工程服務(wù)公司合成。氨基糖苷類抗生素G418、RNaseA、propidium iodide（PI）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1Western-blot檢測ZNF185的蛋白表達提取人腦膠質(zhì)瘤組織、瘤旁組織或膠質(zhì)瘤細胞SF767總蛋白，測定蛋白濃度。各取10 μg進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)（4℃、恒流300 mA、2 h）到硝酸纖維素膜（NC）上，然后將NC膜在含100 g/L脫脂奶的TBST中室溫封閉2 h，加兔抗人ZNF185一抗（1∶1 000）4℃過夜，TBST洗去未結(jié)合一抗，再加HRP標記的羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室溫作用1 h，TBST洗滌3次后加ECL發(fā)光底物，室溫反應(yīng)1 min，暗室曝光。

1.2.2ZNF185表達載體構(gòu)建和質(zhì)粒提取瘤旁組織總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說明書進行。PCR采用Pfx高保真DNA聚合酶和下列引物:上游5′-GGAATTCATGAGTATCTCAGCTCTTG-3′，下游5′-ACGCGTCGACTAGAAGAGCTTCTCATAGC-3′。上、下游引物分別加入EcoRⅠ/SalⅠ酶切位點。反應(yīng)條件：94℃2 min，然后94℃30 s，58℃45 s，72℃延伸1 min；30個循環(huán)，最后72℃孵育10 min，PCR產(chǎn)物膠回收并純化。EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pEGFPC2質(zhì)粒，回收純化酶切產(chǎn)物，并利用T4 DNA ligase將其連接在一起。轉(zhuǎn)化，挑克隆進行序列測定。根據(jù)QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒說明書進行質(zhì)粒的提取和純化。

1.2.3細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細胞系SF767采用DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)。表達ZNF185和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染采用Lipofactamine2000，按操作說明進行。為獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ZNF185的細胞，SF767細胞在轉(zhuǎn)染24 h后，用胰酶消化，1∶2分離培養(yǎng)過夜，加入G418（終濃度為600 mg/L）篩選抗性克隆，每3 d更換1次加G418的培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)1個月后，采用流式細胞儀分選綠色熒光蛋白陽性細胞，分別命名為EGFPC2-ZNF185和EGFPC2，在G418（200 mg/L）保持篩選壓力的條件下常規(guī)培養(yǎng)，并采用Westernblot檢測穩(wěn)定篩選細胞中ZNF185的表達。

1.2.4細胞周期測定將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFPC2-ZNF185和EGFP2空載體的SF767細胞用0.25%胰蛋白酶消化，在75%乙醇中固定過夜。PBS洗細胞，加100 g/L RNaseA，37℃孵育30 min。細胞重懸于0.5 mL PBS，加入propidium iodide染色30 min，以FACS分析PI熒光及周期分布。每個樣品收集2×104個細胞進行分析，重復(fù)3次。

1.2.5細胞增殖檢測分別將EGFPC2-ZNF185和EGFPC2空載體轉(zhuǎn)染SF767細胞，接種至96孔培養(yǎng)板（1×104/孔），每個時間點3個重復(fù)孔。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。隨后分別于24、48、72、96和120 h每孔加25 μL MTT（10 g/L），于上述條件下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸凈培養(yǎng)液，每孔加 200 μL DMSO，放置5～10 min后，以DMSO作空白對照，用酶標儀于570 nm處測定各孔的吸光度（A）值，以培養(yǎng)時間為橫軸，平均A值為縱軸，繪制生長曲線。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SSPS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤中的表達水平ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤組織中的相對表達量為0.45±0.09，低于在瘤旁組織中的相對表達量為 1.47±0.19（t= 33.547，P＜0.01），見圖1。

Fig.1 ZNF185 protein expression in glioma and tumor adjacent tissues圖1人腦膠質(zhì)瘤和瘤旁組織中ZNF185的蛋白表達水平

2.2ZNF185基因表達載體的構(gòu)建和測序挑取ZNF185基因表達載體克隆測序。結(jié)果顯示，克隆cDNA包含全長ZNF185編碼序列。此序列羧基端含有2個鋅指結(jié)構(gòu)組成的LIM結(jié)構(gòu)域，氨基端為肌動蛋白骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ATD），見圖2。

2.3ZNF185膠質(zhì)瘤細胞SF767細胞周期Western-blot檢測結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染EGFPC2空載質(zhì)粒的細胞相比，轉(zhuǎn)染EGFPC2-ZNF185的SF767細胞中ZNF185表達顯著增加（P＜0.01），見圖3a、b。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pEGFPC2空載質(zhì)粒的SF767相比，轉(zhuǎn)染EGFPC2-ZNF185質(zhì)粒的SF767處于DNA合成期（S期）的細胞比例顯著降低，而處于靜止G0～G1期的細胞比例顯著增加（P＜0.05），見圖3c、d。

Fig.2 ZNF185 RT-PCR and sequencing of ZNF185 expression plasmid圖2 ZNF185反轉(zhuǎn)錄PCR和表達載體的克隆測序

2.4過表達ZNF185對SF767細胞增殖影響MTT結(jié)果顯示，EGFPC2-ZNF185組SF767細胞與對照EGFPC2組相比，A570值于第1天和第2天差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而第3天至第5天A570值均顯著低于EGFPC2組（P＜0.05），見表1。

Tab.1　Comparison of the proliferation between differently tranfected SF767 cells表1　不同轉(zhuǎn)染組SF767細胞增殖的比較（n=3，±s）

Tab.1　Comparison of the proliferation between differently tranfected SF767 cells表1　不同轉(zhuǎn)染組SF767細胞增殖的比較（n=3，±s）

＊P＜0.05

組別EGFPC2 EHFPC2-ZNF185 t 24 h 0.13±0.01 0.12±0.01 2.031 120 h 0.78±0.02 0.45±0.05 5.436＊72 h 0.31±0.02 0.20±0.01 7.970＊96 h 0.55±0.03 0.32±0.04 8.690＊48 h 0.21±0.02 0.16±0.01 4.257

Fig.3　The effect of ZNF185 over expression on the cell cycle of SF767 cells圖3　過表達ZNF185對SF767細胞周期的影響

3　討論

3.1膠質(zhì)瘤發(fā)生的分子機制人腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)高度惡性的腫瘤，據(jù)報道其5年生存率約為20%［3］。目前研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展與多種癌基因過度表達以及抑癌基因失活密切相關(guān)［4］。但目前對其發(fā)生、發(fā)展的精確分子機制尚不完全清楚。

3.2ZNF185發(fā)揮抑癌基因的作用ZNF是一類含Zn離子并具有手指狀結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，在基因的表達調(diào)控、細胞分化、胚胎發(fā)育等生命過程中發(fā)揮重要作用。Zhang等［5］報道ZNF185蛋白在人多種組織表達。Vanaja等［6］首先發(fā)現(xiàn)與正常前列腺組織相比，ZNF185在前列腺癌組織中的表達降低。且Medina等［7］發(fā)現(xiàn)ZNF185在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中表達也顯著降低。筆者近期研究結(jié)果表明，ZNF185在粒細胞白血病細胞中與正常外周血粒細胞相比表達也顯著降低［8］。以上結(jié)果提示ZNF185可能在多種組織中發(fā)揮抑癌基因的作用。

3.3ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤中的表達和功能本研究發(fā)現(xiàn)，與瘤旁組織相比，ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達顯著降低。在人腦膠質(zhì)瘤細胞系SF767中過表達ZNF185，與對照組細胞相比，過表達ZNF185細胞出現(xiàn)細胞周期G0～G1期阻滯，同時S期細胞減少，細胞增殖減慢。表明ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤細胞中也發(fā)揮抑癌基因的作用。

3.4ZNF185的可能表達調(diào)控機制對于ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤細胞中表達降低的原因及其發(fā)揮作用的機制目前還不清楚。通過對該基因上游調(diào)控序列的研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌和肺癌等組織中，ZNF185基因的啟動子部位呈高度甲基化狀態(tài)［6，8］。另有報道表明，ZNF185的表達水平受染色質(zhì)重塑蛋白BRG1 （SNF復(fù)合體成分之一）的調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)ZNF185隨BRG1表達的降低而降低［8］。研究發(fā)現(xiàn)，ZNF185通過其氨基端ATD結(jié)構(gòu)域與細胞肌動蛋白纖維系統(tǒng)的相互作用可能是其發(fā)揮抑癌作用的機制之一［9］。以上結(jié)果為進一步深入研究ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤細胞中的表達調(diào)控和作用機制提供了線索，并有待在今后研究中逐步加以解決。

［1］Ostrom Q，Cohen ML，Ondracek A，et al.Gene markers in brain tumors:what the epileptologist should know［J］.Epilepsia，2013，54 （Suppl 9）:25-29.doi:10.1111/epi.12439.

［2］Zheng Q，Zhao Y.The diverse biofunctions of LIM domain proteins: determined by subcellular localization and protein-protein interaction ［J］.Biol Cell，2007，99（9）:489-502.doi:10.1042/BC20060126.

［3］Nong DJ，Li GC.Review for the treatment of gliomas［J］.Guide of China Medicine，2013，11（26）:58-60.［農(nóng)大件，李國成.周圍神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療研究進展［J］.中國醫(yī)藥指南，2013，11（26）:58-60］. doi:1671-8194（2013）26-0058-03.

［4］Melin B，Jenkins R.Genetics in glioma:lessons learned from genome-wide association studies［J］.Curr Opin Neurol，2013，6（6）: 688-692.doi:10.1097/WCO.0000000000000033.

［5］Zhang JS，Gong A，Young CY.ZNF185，an actin-cytoskeleton-associated growth inhibitory LIM protein in prostate cancer［J］.Oncogene，2007，26（1）:111-122.

［6］Vanaja DK，Cheville JC，Iturria SJ，et al.Transcriptional silencing of zinc finger protein 185 identified by expression profiling is associated with prostate cancer progression［J］.Cancer Res，2003，63（14）: 3877-3882.

［7］Medina PP，Carretero J，Ballestar E，et al.Transcriptional targets of the chromatin-remodelling factor SMARCA4/BRG1 in lung cancer cells［J］.Hum Mol Genet，2005，14（7）:973-982.doi:10.1093/hmg/ ddi091.

［8］Zheng QH，Zhang AH，Zheng AH，et al.DNA Methylation regulates chronic myeloid leukemia cell proliferation through ZNF185［J］. Progress in Biochemistry and Biophysics，2013，40（1）:64-71.［鄭全輝，張愛紅，鄭愛華，等.DNA甲基化通過鋅指蛋白185調(diào)控慢性粒細胞白血病細胞的增殖［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，2013，40（1）:64-71］.doi:10.3724/SP.J.1206.2012.00369.

［9］Zheng QH，Lu B，Ge SZ，et al.ZNF185 inhibits tumor cell proliferation through binding actin filaments［J］.Chinese Journal of Gerontology，2012，32（21）:4720-4722.［鄭全輝，陸斌，葛淑芝，等.鋅指蛋白185通過與肌動蛋白纖維結(jié)合抑制腫瘤細胞增殖［J］.中國老年學(xué)雜志，2012，32（21）:4720-4722］.doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2012.21.052.

（2014-06-12收稿2014-10-16修回）

（本文編輯李鵬）

The effect of zinc finger protein 185 on the proliferation of human glioma cells

LU Bin1，ZHENG Quanhui2△
1 Tangshan Gongren Hospital，Tangshan 063000，China；2 Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Disease；School of Basic Medical Science，Hebei United University
△Corrsponding AuthorE-mail：zhqhdlp@sohu.com

ObjectiveTo explore the role of zinc finger protein（ZNF）185 in the proliferation of human glioma cells. MethodsHuman glioma tissues and tumor adjacent tissues were obtained from glioma patients diagnosed pathologically in Tangshan Gongren Hospital from January 2011 to December 2013.Total protein was extracted from different tissues.The ZNF185 expression was detected by Western-blot assay.Total RNA was extracted from tumor adjacent tissues.ZNF185 coding sequence was obtained by RT-PCR and inserted into pEGFPC2 plasmid to construct the ZNF185 expression vector.Lipofactamine2000 was used to transfect the ZNF185 expression vector to human glioma cell SF767.pEGFPC2 blank vector transfected SF767 cells were used as control.Changes of cell cycle were analyzed by flow cytometry，and cell proliferation was analyzed by MTT assay.ResultsThe expression of ZNF185 decreased significantly in human glioma tissues compared to that of tumor adjacent tissues（P＜0.01）.The over expression of ZNF185 in SF767 resulted in the increased proportion of cell cycle G0-G1phase，but decreased proportion of S phase（P＜0.05）.Furthermore，the cell proliferation was significantly inhibited in the ZNF185 over-expressed SF767 cells compared with that of blank vector transfected cells（P＜0.05）.ConclusionZNF185 plays an inhibitory role in cell proliferation of human brain glioma cells.

glioma；cell cycle；cell proliferation；zinc fingers；transfection；ZNF185

R739.41

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.005

河北省自然科學(xué)基金面上項目（H2013209019）；唐山市科技局指令性項目（13130290z）

1河北省唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)外科（郵編063000）；2唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點實驗室，河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

陸斌（1974），男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科學(xué)方面研究

△E-mail：zhqhdlp@sohu.com